杜超群 孫曉梅 謝允慧 侯義梅

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091； 2.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院 武漢 430075； 3.建始縣林業(yè)科學(xué)研究所 建始 445300)

日本落葉松(Larixkaempferi)原產(chǎn)日本，自然分布在本州島中部僅200 km2的狹小范圍內(nèi)，經(jīng)過百余年的人工引種在我國獲得了極大的發(fā)展空間，在溫帶、暖溫帶及北亞熱帶亞高山區(qū)的廣大區(qū)域均有栽植(馬常耕等， 2008)。日本落葉松具有早期速生、成林快、易于栽培、適應(yīng)性廣等特點，已成為我國北方及南方亞高山地區(qū)的重要針葉造林樹種 (馬常耕， 1992)。

隨著日本落葉松引種區(qū)域的南移，北亞熱帶亞高山區(qū)是我國最適引種區(qū)。該區(qū)在20世紀60年代初一個偶然的機會小面積引種日本落葉松獲得成功， 1985年和1987年營建了3片落葉松種和種源試驗林，其中包括來自黑龍江、吉林和遼寧共13個產(chǎn)地的日本落葉松資源，依此確立了日本落葉松在該區(qū)利用的主體地位； 在中日合作JACA項目的資助下， 1998年在該區(qū)營建了2片由日本引進的種源/家系試驗林，包括來自6個產(chǎn)地84個天然林分的材料及來自日本各育種場、種子園的129個家系； 1988—1997年引進遼寧、山東和內(nèi)蒙古初級種子園的建園優(yōu)樹，并在湖北當?shù)卦缙谝N的人工林中選擇優(yōu)樹，利用這些材料嫁接建立了初級種子園(即一代育種群體)，在建園的同時(從1988年開始)陸續(xù)營造了不同批次的子代測定林； 2006年冬至2007年春對已達1/2輪伐期以上的11片子代測定林進行全面調(diào)查(共計12 707個單株)并選出優(yōu)良單株， 2008年開始采穗、嫁接(共計285個單株，獲成活苗木1.5萬株)， 2012—2016年定植營建了育種園(即二代育種群體)(楊秀艷等， 2010)。日本落葉松在該區(qū)主要引種于海拔1 000～2 100 m的中高山地，在該海拔上杉木(Cunninghamialanceolata)和馬尾松(Pinusmassoniana)等已不適宜栽種，曾經(jīng)引種的華山松(Pinusarmandii)、油松(Pinustabulaeformis)也以失敗告終，日本落葉松的成功引種填補了該生態(tài)區(qū)段主要造林樹種的空白。

對育種資源的遺傳基礎(chǔ)進行系統(tǒng)全面的了解，維持合理的遺傳多樣性以及清晰的遺傳背景，構(gòu)建遺傳品質(zhì)不斷提高且遺傳基礎(chǔ)不斷拓展的育種群體，對于高輪次持續(xù)改良十分重要(李悅等， 2000； 康向陽， 2019)。國內(nèi)外很多樹種，如馬尾松、杉木、油松、火炬松(Pinustaeda)、華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)等都開展了育種群體遺傳多樣性基礎(chǔ)及多世代材料間遺傳多樣性動態(tài)變化的研究(馮源恒等， 2018； 歐陽磊等， 2014； 李悅等， 2000； Chhatreetal.， 2013； 于大德等， 2014)，為可持續(xù)的遺傳改良提供了依據(jù)和指導(dǎo)。作為外來樹種，我國也一直重視日本落葉松育種資源遺傳基礎(chǔ)的研究。易敏(2014)、劉昌勇(2016)等以引種種源群體為材料對生長、材性性狀及分子水平的遺傳變異開展研究，發(fā)現(xiàn)該群體具有豐富的表型變異及中等水平的分子遺傳多樣性； 陳興彬(2016)以種子園及其子代群體為材料分析比較了親本和子代群體的遺傳多樣性； 孫曉梅等(2003； 2004)開展了種子園自由授粉家系子代生長、形質(zhì)與材性性狀的遺傳變異研究； 楊秀艷等(2011)嘗試利用分子標記開展了二代優(yōu)樹群體的遺傳基礎(chǔ)評價。這些研究結(jié)果為日本落葉松遺傳改良以及資源高效利用提供了理論支撐，但由于方法各異無法開展不同改良水平群體的分析與比較。隨著育種向更高輪次發(fā)展，如何維持高選擇強度下日本落葉松育種群體的遺傳多樣性，是育種者和良種應(yīng)用單位更為關(guān)注的問題，同時也是后期育種策略制定與調(diào)整的重要依據(jù)。

本文以北亞熱帶引種的日本落葉松種源群體與經(jīng)人工選擇的一代和二代優(yōu)樹育種群體為研究對象，利用SSR分子標記技術(shù)開展不同改良水平育種群體遺傳多樣性評價，揭示群體遺傳基礎(chǔ)隨遺傳改良進程的變化規(guī)律，評價當前遺傳改良策略對遺傳基礎(chǔ)的影響，探討高輪次育種群體遺傳多樣性維持的有效方法，為后期育種策略的制定及可持續(xù)的遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于湖北省建始縣長嶺崗林場日本落葉松國家良種基地，包括分別以引種種源試驗林、一代種子園、二代育種園形式保存的引種種源群體(introduced provenance population，IP)、一代優(yōu)樹育種群體(first cycle breeding population，F(xiàn)P)和二代優(yōu)樹育種群體(second cycle breeding population，SP)(表1)。其中引種種源群體來源于日本原產(chǎn)地日本落葉松自然分布區(qū)內(nèi)的6個種源84個天然林分的443個單株， 1995年引種育苗， 1998年造林(易敏， 2014)； 一代種子園建園優(yōu)樹大部分來源于遼寧草河口林場、朝陽林場和土壤研究所以及山東天麻、內(nèi)蒙古旺業(yè)甸初級種子園，最初的建園優(yōu)樹均來自于遼寧早期引種的日本落葉松人工林林分，35株優(yōu)樹選自湖北當?shù)?960年引種的日本落葉松人工林林分， 1988年至1997年嫁接定植，通過去劣疏伐共保留145個無性系(杜超群等， 2019)； 二代優(yōu)樹群體主要選自營建于湖北省當?shù)氐娜毡韭淙~松子代測定林(楊秀艷等， 2010)，子代測定林家系種子采自當?shù)爻跫壏N子園及內(nèi)蒙古、遼寧和山東省初級種子園，通過家系單株配合選擇方式選出二代優(yōu)樹238株，此外還從日本引進的各育種場、種子園家系(引種及造林同種源群體)中選擇優(yōu)樹47株，共計285株，于2012—2016年定植于育種園內(nèi)。

1.2 試驗方法

采集供試材料的新鮮嫩葉，硅膠干燥后帶回實驗室。利用改良CTAB法(楊秀艷等， 2011)提取基因組DNA，采用課題組前期開發(fā)的16對多態(tài)性較好的日本落葉松EST-SSR引物進行PCR擴增(Chenetal.， 2015； 2018)。引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(熒光修飾)，Taq酶、dNTP購自TaKaRa寶生物工程有限公司。PCR擴增采用15 μL體系，包括： dNTPs 1.5 μL(0.25 mmol·L-1)，Buffer(Mg2+plus)1.5 μL，Taq酶0.2 μL(5 U·μL-1)，上下游引物各0.6 μL(0.4 μmol·L-1)，模板DNA 1 μL，超純水9.6 μL，其中基因組DNA模板的濃度為30～50 ng·μL-1。PCR擴增采用Touch down PCR程序： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s，60～50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s， 20個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃； 95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，10個循環(huán)； 72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。

PCR 擴增產(chǎn)物在ABI 3730XL DNA測序儀上進行自動熒光檢測，用GeneMarker 2.2.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行分析，將各峰值的位置與同一泳道GL 500分子內(nèi)標進行比較，得出SSR 擴增產(chǎn)物的長度數(shù)值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlex 6.41軟件估算各遺傳參數(shù)，包括每個位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)、Shannon多樣性指數(shù)(I)和群體多態(tài)性信息含量(PIC)，并進行分子方差分析(AMOVA)及主坐標分析(PCoA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多樣性

16對引物在全部873個樣品中共檢測到等位基因106個，每個位點的等位基因數(shù)2～18個不等，多態(tài)性差異較大，平均為6.7個。有效等位基因數(shù)在1.158～6.123之間，平均有效等位基因數(shù)為2.543。Shannon指數(shù)平均為0.979，PIC值平均為0.480，其中PIC<0.25的位點2個(HL391和HL339)，為低度多態(tài)性位點； 0.250.5的位點有8個，為高度多態(tài)性位點(表2)。說明這些標記能夠較好地反映群體遺傳多樣性水平。

續(xù)表2 Continued

2.2 群體間遺傳多樣性比較

種源群體中共檢測到87個等位變異，一代、二代群體中分別檢測到82個和81個等位變異，少于種源群體，但一代和二代群體的有效等位基因數(shù)和有效等位基因占比(Ne/Na)均高于種源群體。3個群體相互比較發(fā)現(xiàn)，種源群體在QL386、QL322、OH299、H339及H217這5個位點的等位基因數(shù)最多，一代群體在Y27、QL397和H233這3個位點上的等位基因數(shù)最多，二代群體在H215和H46這2個位點上的等位變異數(shù)最多。進一步對3個群體16對標記的等位基因頻率進行比較(表3，表中僅列出了等位基因頻率差異明顯的5個位點)，發(fā)現(xiàn)一代與二代群體的等位基因頻率分布較為一致，而它們與種源群體則存在明顯的區(qū)別。例如在位點Y27的等位基因E、QL397的等位基因K、QL375的等位基因B、H52的等位基因B和C以及QL386的等位基因H和J，一代、二代群體的頻率高于種源群體； 而位點Y27的等位基因B、QL397的等位基因I、H52的等位基因D以及QL386的等位基因B和D在種源群體中的頻率則更高。

表3 3個群體的等位基因頻率比較Tab.3 Comparison of allele frequencies in three populations

3個群體的Shannon多樣性指數(shù)(I)分別為0.911、1.017和1.009，多態(tài)性信息含量PIC值分別為0.432、0.484和0.488； 整體來看，一代、二代群體的平均觀察雜合度Ho高于種源群體。這些都說明與種源群體相比，一代、二代群體的遺傳多樣性均有所提高，改良后的群體仍然維持了較高的遺傳多樣性水平。對3個群體16個位點的遺傳多樣性參數(shù)進行方差分析，結(jié)果顯示群體間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 群體間遺傳分化

基于所有位點的AMOVA分析結(jié)果(表4)表明： 遺傳多樣性主要存在于群體內(nèi)，群體間僅占10%。采用Nei的方法計算3個群體間的相似性系數(shù)和遺傳距離(表5)，種源群體與一代優(yōu)樹群體的遺傳距離為0.073，與二代優(yōu)樹群體的遺傳距離為0.075，這說明隨著遺傳改良的進行，種源群體與后續(xù)世代的遺傳相似性逐漸減小，遺傳距離有增大的趨勢，但世代間的遺傳分化程度不高，一、二代優(yōu)樹群體之間遺傳相似性系數(shù)高達0.994。

表4 3個群體的AMOVA分析Tab.4 AMOVA analysis of three populations

表5 3個群體之間的遺傳距離(左下角)與遺傳相似性(右上角)Tab.5 Genetic distance (lower left) and genetic similarity (upper right) between populations

基于SSR遺傳距離的PCoA分析結(jié)果如圖1所示，3個群體中，一代優(yōu)樹與二代優(yōu)樹在圖中分布的位置相近，重合區(qū)域較多，種源群體與另2個群體之間只有部分重合，偏離比較明顯，說明種源群體與一代、二代優(yōu)樹群體差異較大，而一代、二代優(yōu)樹群體之間比較相似。

圖1 3個群體基于SSR遺傳距離的PCoA分析Fig. 1 PCoA analysis based on SSR genetic distance of three populations

2.4 引入種源群體對二代育種群體遺傳多樣性的影響

雖然二代育種群體的遺傳多樣性參數(shù)值沒有降低，但遺傳背景與種源群體相比仍存在較明顯的差異，因此考慮將種源群體中與二代群體差異較大的基因型引入其中，以拓寬二代育種群體的遺傳基礎(chǔ)。選擇種源群體中單株材積排名前50位，且與二代育種群體遺傳距離較遠的30個單株補充進入二代育種群體，群體規(guī)模從285個單株增加到315個。從圖2中直觀地看到，引入種源群體后二代育種群體在坐標中的分布范圍明顯擴大，遺傳參數(shù)估算結(jié)果表明群體的有效等位基因數(shù)(Ne)從2.614提高至2.651，Shannon多樣性指數(shù)(I)從1.009變?yōu)?.023，PIC值從0.488變?yōu)?.494，各參數(shù)均有所增加，說明引入種源群體可有效拓寬群體的遺傳多樣性。

圖2 二代育種群體引入種源群體后的PCoA分布Fig. 2 PCoA distribution of second cycle breeding population after introducing provenance population

3 討論

3.1 日本落葉松育種群體遺傳多樣性隨遺傳改良進程的變化

研究和評價林木育種系統(tǒng)的遺傳多樣性，對于林木育種的理論與實踐都具有非常重要的意義(李悅等， 2000)。本研究利用16對EST-SSR標記比較和評價了北亞熱帶亞高山區(qū)日本落葉松引種種源群體、一代育種群體和二代育種群體的遺傳多樣性，其平均有效等位基因數(shù)為2.543，Shannon多樣性指數(shù)為0.979，PIC值為0.480，遺傳多樣性略低于SSR標記的日本原產(chǎn)地同類研究結(jié)果(Hansen， 2008； Nishimuraetal.， 2011)，高于針葉樹天然群體的平均值，高于報道的華北落葉松育種群體的相關(guān)值(于大德等， 2014)?？傮w來說，北亞熱帶地區(qū)日本落葉松育種群體具有較高的遺傳多樣性水平。

很多研究認為育種實踐在有效提高改良群體的遺傳增益的同時，由于加大了人為選擇的強度，很可能降低了群體遺傳多樣性水平。實際上多個樹種的研究發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性變化不大，如Fageria等(2014)認為白云杉(Piceaglauca)人工表型選優(yōu)群體的遺傳多樣性雖然較天然群體低，但差異不顯著； Szmidt(1984)研究了歐洲赤松(Pinussylvestris)天然群體與種子園子代的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)后者的多樣性并沒有顯著下降； Chhatre等(2013)發(fā)現(xiàn)火炬松一代和二代育種群體期望雜合度和觀測雜合度非常接近； 于大德等(2014)發(fā)現(xiàn)華北落葉松1～3代種子園遺傳多樣性略有增加，子代群體與親代群體間分化較小； 而對于北美云杉(Piceasitchensis)的研究則認為改良群體的遺傳多樣性非但沒有變小，反而還略高于天然群體(Chaisurisrietal.， 1994)。在火炬松(Isiketal.， 2019)、馬尾松(馮源恒等， 2018)和油松(李悅等， 2000)等樹種高輪次育種中，普遍認為在系統(tǒng)分析親本育種值及育種群體遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，有針對性地設(shè)計育種群體結(jié)構(gòu)及制定選擇策略，能夠有效地兼顧遺傳增益與遺傳多樣性，合適的育種措施還有可能對遺傳多樣性的提高起到促進作用。

本研究中日本落葉松3個群體的Shannon多樣性指數(shù)分別為0.911、1.017和1.009，多態(tài)性信息含量PIC值分別為0.432、0.484和0.488，表明一代和二代育種群體的遺傳多樣性并不低于種源群體，該結(jié)果與北美云杉(Chaisurisrietal.， 1994)以及油松(李悅等， 2000)的研究結(jié)果類似。這一方面是由于本研究中種源群體來源于原產(chǎn)地35°30′—36°45′N、138°10′—139°45′E的區(qū)域(易敏， 2014)，從地理來源上看，該群體不足以代表天然群體的整體遺傳多樣性，這可能是改良后代遺傳多樣性略高于種源群體的原因； 另一方面，二代育種群體除了包括一代種子園子代測定林入選的優(yōu)樹外，還包括從日本各育種場、種子園引進的家系試驗林中選出的47個單株，這可能包含一代群體所不具備的相關(guān)基因，也在一定程度上影響了等位基因頻率的分布。本研究結(jié)果表明隨著改良水平的提高，并未出現(xiàn)遺傳基礎(chǔ)變窄的問題，只要育種策略和措施得當，改良代群體仍可以具有較高的遺傳變異水平，這一結(jié)果也進一步表明目前該區(qū)域日本落葉松遺傳改良策略在維持遺傳多樣性方面是合適的。

雖然改良代群體與種源群體的遺傳多樣性參數(shù)值比較接近，但從等位基因頻率比較和PCoA分析的結(jié)果可以看出群體間的遺傳組成存在明顯的差異。一代育種群體主要來自遼寧地區(qū)早期引種的日本落葉松人工林優(yōu)樹，與種源群體來源可能存在一定的差異。另外，落葉松屬種間隔離不明顯，日本落葉松在長期引種栽培過程中容易與長白落葉松(Larixolgensis)等其他鄉(xiāng)土落葉松發(fā)生天然種間雜交，花粉污染會造成育種群體之外的基因交流(Chenetal.， 2018)，外來花粉攜帶的等位基因異于種源群體或者親本群體(李悅等， 2000)，而這些雜種后代由于表現(xiàn)出較強的雜種優(yōu)勢極大可能被選擇進入育種群體(楊秀艷等， 2011)。針葉樹遺傳改良主要采用輪回選擇的方式，通過快速積累有利基因的頻率來獲取遺傳增益(康向陽， 2019)，在高強度的人工定向選擇壓力的作用下，群體中的基因型頻率也必然會發(fā)生一定程度的定向改變，人工選擇同時還會造成部分等位基因的缺失(馮源恒等， 2018)。這些都可能是導(dǎo)致種源群體與改良代群體之間遺傳基礎(chǔ)存在差異的原因。

3.2 拓寬日本落葉松高輪次育種群體遺傳多樣性的策略

為提升高世代育種群體遺傳多樣性水平，常常從原始基本群體選擇優(yōu)樹，引入原育種群體并不具備的相關(guān)基因，或者從育種區(qū)外引進優(yōu)樹資源，以彌補育種群體資源的不足(康向陽， 2019)。美國東南部濕地松(Pinuselliottii)與新西蘭輻射松(Pinusradiata)遺傳改良中，通過建立結(jié)構(gòu)化的育種群體平衡遺傳多樣性和遺傳增益，主群體中大部分的資源主要用于基因保存，隨時準備補充進入精選群體； 火炬松二輪育種中則在未改良的人工林中選出新一批材料，作為育種群體中專門的遺傳多樣性群體，以保持廣泛的遺傳基礎(chǔ)、獲得長期遺傳進展(Writeetal.， 2014)； 馬尾松遺傳改良中(馮源恒等， 2018)，利用核心種質(zhì)對育種群體選擇中損失的等位基因進行補充，有效避免了損失稀有等位基因。而對于外來引進樹種，拓寬高世代育種群體的遺傳基礎(chǔ)更為重要。輻射松引入澳大利亞之后，一代育種群體主要選自早期引種的人工林，遺傳基礎(chǔ)相對較窄(Burdon， 1992)，在進入第3輪育種時，注重引入新的遺傳資源，從5個原產(chǎn)地收集并通過種源試驗研究的資源補充進入育種群體，明顯提高了遺傳多樣性(饒龍兵， 2009)。

構(gòu)建北亞熱帶亞高山區(qū)日本落葉松二代育種群體的過程中，在對營建于該區(qū)的一代育種群體子代測定林開展廣泛選優(yōu)的基礎(chǔ)上，通過選擇性地引入?yún)^(qū)域外的人工群體和天然群體資源的育種策略，一方面對引進的日本各育種場和種子園的優(yōu)良家系的子代進行選優(yōu)，另一方面嘗試將引自原產(chǎn)地天然群體中遺傳基礎(chǔ)與國內(nèi)改良代群體差異較大的部分優(yōu)樹補充進入二代育種群體中，有效地拓寬二代育種群體的遺傳基礎(chǔ)，確保長期遺傳增益，有利于實現(xiàn)該區(qū)日本落葉松的持續(xù)遺傳改良。

4 結(jié)論

北亞熱帶亞高山區(qū)日本落葉松引進的種源群體、一代育種群體和二代育種群體均具有較高的遺傳多樣性，一代、二代育種群體的遺傳多樣性與種源群體相比不存在顯著差異，說明目前該區(qū)域日本落葉松的育種策略在維持遺傳多樣性方面是合適的； 種源群體與一代和二代育種群體間的遺傳距離逐漸增大，但一代和二代育種群體間的分化不大，變異主要來源于群體內(nèi)； 種源群體的遺傳基礎(chǔ)與一代和二代群體之間存在著明顯的差異，將種源群體的部分優(yōu)樹補充到二代育種群體之中，可有效提高二代育種群體的遺傳多樣性水平，這對像日本落葉松這樣的外來樹種高輪次育種群體的構(gòu)建尤為重要。