吳金松，徐美娟，王曉芳，陳曉培，楊新玲，任聰，王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

我國生豬產(chǎn)量位居世界前列，每年的生豬屠宰量在6.89 億頭以上，隨之產(chǎn)生的豬血量在90 萬噸以上，豬血若不經(jīng)加工利用而被直接排放入環(huán)境中，會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，影響人體的健康[1]。 豬血中蛋白質(zhì)含量18.9%，比雞蛋高6.2%，比大米高12.7%，因此豬血被人們譽(yù)為“液態(tài)肉”[2-4]，豬血中的血紅蛋白由珠蛋白和血紅素兩部分構(gòu)成，是豬血中重要的營養(yǎng)成分。 從上世紀(jì)90 年代以來，國內(nèi)企業(yè)研發(fā)人員開始探究生產(chǎn)血紅素粉、血漿蛋白粉、血紅蛋白粉、超氧化物歧化酶等產(chǎn)品，它們是食品添加劑、生物制劑、保健食品的重要原料，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-6]。 國內(nèi)外關(guān)于豬血中主要功能成分的研究主要集中在血紅蛋白粉、血紅素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及生物活性肽的制備工藝及開發(fā)上，關(guān)于對豬血中功能成分的修飾以及應(yīng)用方面報(bào)道較少。

1 豬血中功能成分的制備工藝研究

1.1 血紅蛋白粉

豬血紅蛋白主要提取工藝流程[7]：新鮮抗凝豬血→紗布過濾除雜→離心（4 000 r/min）→取下層血細(xì)胞→血細(xì)胞超聲波破碎→酶解（調(diào)節(jié)pH 值）→滅酶→酶解血紅蛋白粉成品。

血紅蛋白粉產(chǎn)品的開發(fā)， 其分離提取工藝是關(guān)鍵，在獲得較高血紅蛋白提取率的基礎(chǔ)上，要考慮不同工藝處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生的影響（如血紅素是否從蛋白疏水空穴游離，卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)是否完整），為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考[8-10]。 張敏等[11]對豬原血通過不同飽和度的硫酸銨進(jìn)行沉淀， 并分步收集沉淀，分離到的粗豬血紅蛋白于50%和60%飽和度的硫酸銨中進(jìn)行沉淀， 該條件沉淀得到粗豬血紅蛋白用DEAE-Sephrose 陰離子交換色譜進(jìn)一步分離， 均獲得了單一蛋白峰，對出峰處各管樣品進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）， 均為分子量為16.4kDa 的單一條帶，為豬血紅蛋白的單亞基分子量，經(jīng)PDQuest 軟件分析純度為95.2%，比市售的豬血紅蛋白純度（約為85%）高。 周勃等[12]為了從豬血中分離純化高純度的豬血紅蛋白， 建立了通過超濾、SephadexG-75 凝膠排阻色譜和DEAE-Sepharose Fast Flow 離子交換色譜三步法，并通過高效凝膠排阻色譜、反相高效液相色譜和SDS-PAGE， 同時(shí)對純化后的豬血紅蛋白進(jìn)行了純度鑒定，經(jīng)純化工藝后，豬血紅蛋白的純度達(dá)到99%以上，含量為1.328 g/L。 隨著生物技術(shù)和化學(xué)分離純化技術(shù)的不斷提高，高效、高純度的豬血蛋白產(chǎn)品被開發(fā)出來，為豬血紅蛋白在食品藥品中的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1.2 血紅素

血紅蛋白進(jìn)一步分解為珠蛋白和血紅素，經(jīng)過酶解可以得到氨基酸、小肽和血紅素的混合物。 血紅素是一種由吡咯環(huán)組成亞鐵卟啉化合物，4 個(gè)吡咯環(huán)由4個(gè)α-碳原子通過4 個(gè)次甲基（-CH=）橋相連形成，F(xiàn)e2+位于環(huán)中， 與吡咯環(huán)上的N 原子結(jié)合成4 個(gè)配位鍵，從而形成亞鐵卟啉環(huán)， 血紅素分子式為C34H33FeN4O4，相對分子質(zhì)量為633.49[4，13]。

血紅素的主要制備工藝如下。

尤鑫等[14]通過超聲波輔助酶解法水解血紅蛋白制備血紅素，探究了超聲波破胞技術(shù)對血紅素提取效果的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件為：超聲60 次，間歇比2 ∶5，血紅素與水的體積比1 ∶7，超聲功率300 W，破胞后經(jīng)過酶解，測得血紅素提取率為652.7 μg/mL。 劉夢然[15]選擇丙酮、鹽酸、水以體積比為40 ∶9 ∶1 的混合液分離提取， 制備的亞硝基血紅素穩(wěn)定性和溶解性較好，色澤與亞硝酸鈉接近，適合代替亞硝酸鹽在肉制品工業(yè)中的應(yīng)用。

1.3 生物活性肽

生物活性肽是由20 個(gè)天然氨基酸以不同組成和排列形式組成的復(fù)雜線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的統(tǒng)稱，具有增強(qiáng)免疫、抑菌、激素調(diào)節(jié)、抗病毒、降血脂、降血壓等功效[5]。 傳統(tǒng)的豬血紅蛋白肽的分離提取方法主要是通過胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等酶解成小分子肽[16]。 例如張鳳英[17]通過不同酶水解豬血紅蛋白制備抗氧化肽的比較，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶分離提取效果明顯高于胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。王鵬[18]進(jìn)一步通過優(yōu)化酶解條件結(jié)合納米纖維素膜、超濾膜等分離工藝優(yōu)化提純到小分子肽， 而且膜通量回復(fù)率高，適合用于血紅蛋白粉制備降血壓活性肽的工業(yè)化生產(chǎn)。

除此之外，豬血紅蛋白肽的提取純化工藝還有超聲輔助酶法、發(fā)酵法以及超濾脫鹽和大孔樹脂吸附法等。 王巖等[19]利用發(fā)酵法水解豬血粉制備蛋白肽的最佳發(fā)酵條件為：豬血粉作為發(fā)酵底物，發(fā)酵底物濃度5.0%，接種量3.0%，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵起始pH8.0，在此條件下，蛋白肽得率33.15%。 蔡紅燕等[20]通過大孔吸附樹脂對豬血紅蛋白肽脫鹽，經(jīng)過脫鹽處理后的血紅蛋白肽的蛋白質(zhì)含量由84.49%上升到95.10%，肽含量由62.5%提高到81.89%，灰分由11.69%降低到0.27%，脫鹽效果明顯。 唐雯倩等[21]利用超聲波處理胰蛋白酶溶液，其酶活力和蛋白酶溶解度分別提高104.9%和2.4%，酶解2 h 即可達(dá)到常規(guī)酶解6 h 的酶解度。 CARLOS 等[22]提出了一種用豬血紅蛋白生產(chǎn)多肽的新水解方法，有別于目前的工藝是通過使用昂貴的酶或高靜水壓，該法廉價(jià)有效，將純化的血紅蛋白溶液在不同的溫度下加熱，并在4 MPa 的壓力下加壓，同時(shí)將氮?dú)庾⑷敕磻?yīng)器中，共82%的初始血紅蛋白被轉(zhuǎn)化為肽，平均大小為3.2 kDa，在不同的時(shí)間和溫度下評價(jià)肽分子的大小分布，該技術(shù)產(chǎn)生了大量具有良好抗氧化性能的肽，與通過酶法獲得的血紅蛋白肽相比， 該方法從血紅蛋白中產(chǎn)生更高的肽產(chǎn)率。

通過超聲波輔助處理可以大大提高酶解效率，縮短工作時(shí)間，采用現(xiàn)代化學(xué)分離技術(shù)和生物工程技術(shù)制備功能性肽可以大大提高生物活性肽純度和提取效率，擴(kuò)大了生物活性肽的應(yīng)用范圍，避免了因酶解過程較長而導(dǎo)致生物活性的降低及原材料變質(zhì)。

1.4 超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)的金屬酶， 其在體內(nèi)的主要功效是清除超氧陰離子自由基（·），具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射以及消炎等作用[23]。目前國內(nèi)外豬血中超氧化物歧化酶的分離提取技術(shù)主要有熱變性和等電點(diǎn)除雜技術(shù)、 有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)、超聲波輔助提取技術(shù)、超濾濃縮技術(shù)、柱層析純化等。 豬血中分離提取SOD 的主要工藝[24]：抗凝→離心除去上層血漿→洗滌紅血球→沉淀蛋白雜質(zhì)→收集上清液（SOD 粗酶液）。

王保全等[25]從豬血液中分離提取出超氧化物歧化酶粗液，經(jīng)離子交換柱層析、凝膠過濾層析以及殼聚糖親和柱層析分級純化，再經(jīng)過SDS-PAGE 后均呈現(xiàn)一條單一條帶，單亞基的相對分子量為16 kDa，其比活力分別為5 585、6 148、4 739 U/mg，產(chǎn)品得率分別為18.1%、13.7%、15.5%， 進(jìn)而表明殼聚糖親和柱層析方法純化效率較高，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

2 豬血主要功能成分的修飾及應(yīng)用

為了充分利用豬血資源，利用現(xiàn)代化分離純化技術(shù)和生物工程技術(shù)制備豬血中的血紅蛋白、 血紅素、生物活性肽等主要功能成分， 通過分子修飾制備、基因重組改造等技術(shù)擴(kuò)大其應(yīng)用范圍是未來豬血資源利用的一個(gè)新的方向，據(jù)統(tǒng)計(jì)2016 年全球全年有30%的血液衍生制品應(yīng)用到食品工業(yè)中（約220 萬噸）[26]。

2.1 血紅蛋白及其修飾成分的應(yīng)用

從豬血中制備的血漿蛋白粉、血紅蛋白粉等不僅可以作為富含蛋白質(zhì)氨基酸食物的重要來源，而且具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。 除此之外，血紅蛋白還具有特殊的生理功能， 目前對血紅蛋白的修飾主要有微囊化、重組型和化學(xué)修飾型，例如可以將血紅蛋白制成殼聚糖-海藻酸鈉-血紅蛋白微囊，一種可供靜脈注射用的具有緩釋作用的人工攜氧治療劑[27]。

近幾年國內(nèi)外關(guān)于戊二醛聚合血紅蛋白（polymerized porcine hemoglobin，pPolyHb）作為一種新型的具有攜帶氧和釋放氧功能聚合血紅蛋白體在藥物研究開發(fā)方面報(bào)道越來越多。馬慧婭[28]通過探究在化療貧血動物模型中運(yùn)用戊二醛聚合血紅蛋白， 觀察化療貧血動物自身造血相關(guān)生理功能或狀態(tài)和條件化療貧血動物體內(nèi)血紅蛋白（porcine hemoglobin，pHb）水平，結(jié)果表明1 mg/kg 戊二醛聚合血紅蛋白可以顯著提高貧血小鼠外周pHb 濃度， 對化療藥物引起的骨髓抑制貧血小鼠有著較好治療作用。 LIU 等[29]為探究pPolyHb 在等容性血液稀釋（anemia caused by normovolemic hemodilution，ANH）致急性貧血大鼠模型中的恢復(fù)能力，老鼠被注入聚合豬血紅蛋白或紅細(xì)胞， 根據(jù)ANH 程序結(jié)果顯示pPolyHb 可以攜帶足夠多的氧氣來維持正常的組織有氧代謝和血動力學(xué)穩(wěn)定，根據(jù)病理和生化分析，對腎和肝功能沒有顯著的毒性，ZHU 等[30]通過分析pPolyHb 對于大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行安全評價(jià)， 發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞和動物沒有免疫毒性。 因而在未來的臨床試驗(yàn)中pPolyHb 可能是一個(gè)很好治療急性貧血的候選藥物。XIE 等[31]測定了聚合豬血紅蛋白pPolyHb 對短暫性局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用， 認(rèn)為戊二醛聚合豬血紅蛋白是一種基于血紅蛋白的氧載體， 目前正被開發(fā)為一種潛在的紅細(xì)胞替代品。

此外，李新波[32]通過哌啶氮氧自由基修飾血紅蛋白氧載體，通過細(xì)胞試驗(yàn)考察該分子對氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，胺基-哌啶氮氧容易修飾于血紅蛋白且毒性較低，當(dāng)修飾比例達(dá)到哌啶氮氧自由基∶血紅蛋白=3 ∶1 時(shí)，在氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型中，哌啶氮氧自由基-血紅蛋白相對于對照組明顯提高了對細(xì)胞的保護(hù)作用，從而為聚合血紅蛋白氧載體提供了一種抗氧化應(yīng)激損傷的思路。 彭倩[33]探究了豬血蛋白磷酸化及其超聲輔助合成工藝的最佳條件，并且對磷酸化前后的起泡性及其起泡穩(wěn)定性、溶解性、乳化性及其乳化穩(wěn)定性功能特性隨氯化鈉濃度和酸度條件的變化進(jìn)行研究，在大部分條件下，各功能性指標(biāo)均高于未磷酸化的豬血紅蛋白，因此可以擴(kuò)展磷酸化豬血紅蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

2.2 血紅素及其修飾成分的應(yīng)用

由于豬血中的血紅素在低pH 值、 高溫或游離金屬陽離子存在下，導(dǎo)致豬血液的顏色從紅色到棕色不等，因此探究一種保持穩(wěn)定豬血液顏色的方法就顯得尤為重要，ZHOU 等[34]探究豬血在25 ℃和pH7.3 時(shí)，L-組氨酸通過與游離鐵（Fe2+或Fe3+）配位能夠提高血紅素濃縮物的穩(wěn)定性。 SALVADOR 等[35]通過在新鮮豬血紅素中加入螯合劑（如煙酸或煙酰胺和葡萄糖）作為還原劑，以穩(wěn)定其在噴霧干燥和室溫下粉末儲存過程中的紅色，結(jié)果表明雖然聯(lián)合處理對血紅素的影響很小， 但在脫水和后續(xù)貯藏過程中對色素自氧化有效，因此葡萄糖是血紅素顏色穩(wěn)定的主要因素。

從血液中分離提取到的血紅素鐵常被用做食品補(bǔ)充劑， 用來干預(yù)缺鐵性貧血或者營養(yǎng)性貧血等疾病，如何通過膳食攝入提高鐵的吸收和利用率非常重要。 目前國內(nèi)關(guān)于血紅素鐵添加到餅干、米粉、糕點(diǎn)等食品中的報(bào)道越來越多，此外國外也有關(guān)于以血紅素鐵為載體添加到水產(chǎn)品、肉制品、海產(chǎn)品以及調(diào)味料中的報(bào)道[33-37]。

血紅素可以作為著色劑廣泛應(yīng)用于肉品加工中。SORIVAN 等[38-39]研究表明，從豬血紅蛋白中分離得到的血紅素鐵有用作肉制品色素新型配體的潛力。 亞硝酸鈉的5 種替代品被確定為血紅素紅構(gòu)象的穩(wěn)定劑和配體。 在溶液中研究了4-甲基咪唑、煙酸甲酯、吡咯烷、哌啶、吡嗪和亞硝酸鈉（作為比較基準(zhǔn)）對半鐵提物和純半鐵標(biāo)準(zhǔn)品顏色的影響。 通過紫外-可見吸收光譜和三維顏色空間參數(shù)隨時(shí)間變化評估配體親和力和配體穩(wěn)定性。 使用國際照明委員會（Commission Internationale de l’Eclairage，CIE） 的紅度評分a*作為單一測量指標(biāo)，基于以下參數(shù)提出預(yù)測模型：血紅素來源（血紅素-）鐵提取物或血紅素標(biāo)準(zhǔn)，血紅素與配體的摩爾比率（1 ∶20～1 ∶3000），儲存時(shí)間（最多32 d），從而確定了每種配體可加入任一血紅素源的最佳濃度，以及形成的血紅素配體在溶液中的紅色穩(wěn)定性。 因此，血紅素鐵具有部分替代亞硝酸鹽在肉制品加工中的作用。

血紅素及其修飾加工后的功能成分在醫(yī)藥品中也有著廣泛的應(yīng)用，吳梧桐等[40]應(yīng)用生化轉(zhuǎn)化法由血紅素制備膽紅素，而膽紅素是制備抗癌藥和人工牛黃的重要原料。

2.3 生物活性肽及其修飾成分的應(yīng)用

生物活性肽的開發(fā)是保健功能食品研究較活躍的方向之一，從豬血液中可以分離提取到抗氧化活性肽、降血壓肽、抗菌肽、抗疲勞肽等[41]不同功能的生物活性肽，或者通過金屬螯合等修飾，擴(kuò)大豬血紅蛋白肽的應(yīng)用范圍。

吳浪[42]通過對豬血進(jìn)行胰蛋白酶酶解優(yōu)化分離提取血紅蛋白肽工藝， 并進(jìn)行了5 種標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌性試驗(yàn)，血紅蛋白肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌平均10 min 內(nèi)的殺滅率達(dá)到90%以上，再以此為抑菌劑，加上基質(zhì)卡波姆和甘油開發(fā)了具有良好殺菌效果的免洗洗手液。 鄭炯[43]探究了血紅蛋白肽與氯化亞鐵反應(yīng)制備鐵螯合肽的最佳工藝條件，并且在此條件下制備出了豬血紅蛋白肽螯合鐵飼養(yǎng)缺鐵性貧血大鼠，其抗貧血效果明顯好于氯化亞鐵和葡萄糖酸亞鐵，因此豬血多肽螯合鐵可以作為一種理想的補(bǔ)鐵制劑，用于改善營養(yǎng)性貧血。劉騫等[44]研究經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后的豬血漿蛋白抗氧化肽，其溶解性、起泡及起泡穩(wěn)定性、乳化及乳化穩(wěn)定性隨反應(yīng)時(shí)間增加而逐漸增大，表面疏水性則隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而降低。 同時(shí)，各功能性質(zhì)均隨環(huán)境體系中pH值改變而變化，因此美拉德反應(yīng)修飾可有效改善豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性，可為抗氧化肽有效利用提供新途徑。

2.4 豬血超氧化物歧化酶（SOD）及其修飾成分的應(yīng)用

豬血超氧化物歧化酶（SOD）由于其抗氧化、抗衰老、抗炎癥等功效廣泛應(yīng)用到食品、藥品和化妝品中，比如可以作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到保健食品中，加工成抗衰老保健食品[45]，張又[46]對從豬血中提取到的超氧化物歧化酶的工藝進(jìn)行改進(jìn)， 并且以乙基纖維素和糊精為原料， 采用了淀粉內(nèi)外同加的方法制備了具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效的腸溶小丸膠囊， 該小丸膠囊中SOD 酶活力保持較好，有望開發(fā)成一個(gè)副作用小、服用和攜帶方便的療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)代膠囊制劑。 豬血超氧化物歧化酶（SOD）也可以添加到化妝品中避免皮膚自由基受到損害進(jìn)而起到防曬抗炎的效果[47]。

國內(nèi)外關(guān)于豬血超氧化物歧化酶（SOD）修飾成分及其應(yīng)用方面的報(bào)道較少。 何毅[48]選用了具備清除自由基、增強(qiáng)免疫等功能的褪黑素作為修飾劑對SOD 進(jìn)行改造，以甲醛作為偶聯(lián)劑，將褪黑素（melatonin，MT）連接到SOD 分子表面的游離氨基上， 修飾反應(yīng)完成后，用丙酮沉淀、透析等方法將反應(yīng)物分離純化表明MT 已成功與SOD 偶聯(lián)，MT-SOD 同時(shí)具備了MT 以及SOD 的生理活性。 將豬血SOD 和MT-SOD 在75 ℃下保溫不同時(shí)間，測定兩者的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保溫70 min，MT-SOD 還保留有61.3%的活性，而天然SOD的活性只剩余35.2%。說明MT-SOD 與天然的SOD 相比，對溫度有更強(qiáng)的抗性，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。 劉婧[49]先對分離提取到的豬血SOD 進(jìn)行聚乙二醇修飾，得到最優(yōu)反應(yīng)條件后， 通過葡聚糖凝膠層析純化， 修飾后的SOD 的酶活有所下降，但是耐酸耐堿耐熱能力均強(qiáng)于天然SOD，在抑制酶解方面，修飾SOD 的穩(wěn)定性也有顯著提高， 從而將豬血SOD 更合理地運(yùn)用到食品、藥品、化妝品等行業(yè)中。

3 發(fā)展趨勢

我國擁有世界上最為豐富的豬血資源，為豬血主要功能成分的開發(fā)利用提供了廣闊的空間，國內(nèi)外關(guān)于豬血中主要功能成分的提取分離純化工藝日也趨成熟，新產(chǎn)品的開發(fā)利用領(lǐng)域也不斷擴(kuò)寬，但同時(shí)也存在以下問題：1）豬血中某一功能成分的分離提純工藝技術(shù)比較單一，綜合利用率不高，豬血中各功能成分的之間的系統(tǒng)化分離提取，利用現(xiàn)代生物分離集成技術(shù)程度不高，有待于進(jìn)一步的開發(fā)。 2）豬血中主要功能成分的精深加工程度不高，分離提取到的功能成分純度不高，或者提取到的功能成分純度很高但是效率太低導(dǎo)致成本過高。 3）利用現(xiàn)代化分離純化技術(shù)和生物工程技術(shù)制備豬血中的血紅蛋白、血紅素、生物活性肽等主要功能成分的研究報(bào)道較多，但是對于結(jié)合基因重組技術(shù)、微囊化和化學(xué)改造技術(shù)修飾生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，進(jìn)一步提高生物活性的研究報(bào)道較少，這也是未來豬血資源利用的一個(gè)新方向。

未來， 科研人員應(yīng)綜合利用現(xiàn)代化學(xué)生物分離提純技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、基因重組技術(shù)等多種技術(shù)開發(fā)高純度低成本的功能性豬血生物制品，以期擴(kuò)大豬血功能成分在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，延長產(chǎn)業(yè)鏈，提升豬血制品的附加值。