侯超凡，陳振家，郝利平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

小米又稱粟，由谷子脫殼而成，是我國(guó)北方廣泛種植的作物之一[1]。小米所含的各種營(yíng)養(yǎng)素豐富，口感良好，深受北方人的喜愛[2]。小米中營(yíng)養(yǎng)素比例比較均衡，是一種良好的飲食來源。相較于其他常見的谷物，小米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更優(yōu)，與水稻、玉米等谷物相比，小米的蛋白質(zhì)含量更高[3]；與大米和小麥等谷物相比，小米中所含的鈣、膳食纖維也更多[4]。同時(shí)，小米蛋白也是優(yōu)質(zhì)蛋白的來源，其消化率高達(dá)83.4%，可用于食品調(diào)味品、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、添加劑等多個(gè)領(lǐng)域[5]。

近年來，許多水解后的植物蛋白被用于加工成各種增加產(chǎn)品風(fēng)味的調(diào)味品[6]，常見的有豆類蛋白[7]和谷類蛋白[8]，這得益于其水解后產(chǎn)生的游離氨基酸。小米中含有豐富的蛋白質(zhì)，其蛋白具有低過敏性的特點(diǎn)，分解后可產(chǎn)生大量的游離氨基酸產(chǎn)物，可用于調(diào)味品及其他添加劑的研究[9]。小米蛋白質(zhì)的氨基酸組成模式中賴氨酸和蘇氨酸是限制性氨基酸，但其必需氨基酸的含量高于稻米和小麥[10]。在實(shí)際的食品生產(chǎn)加工過程中，蛋白質(zhì)容易受到諸多因素的影響，蛋白的加工處理極易破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，發(fā)生聚集行為，從而影響蛋白質(zhì)的功能特性，進(jìn)而影響食品的感官品質(zhì)。其中，蛋白的溶解度作為蛋白與溶劑之間平衡的性質(zhì)，是蛋白功能性質(zhì)中最為重要的性質(zhì)，蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性都會(huì)受到溶解度的影響[11]。離子濃度、pH和溫度對(duì)蛋白質(zhì)的加工影響巨大，然而目前這3種處理對(duì)小米分離蛋白的影響報(bào)道較少。

本試驗(yàn)主要研究不同離子濃度、pH、溫度對(duì)小米分離蛋白溶解性及亞基帶分布的影響，以期為小米分離蛋白及其加工產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

晉谷21號(hào)小米：山西晉中樂民恒星雜糧加工廠；考馬斯亮藍(lán)G250：Solarbio公司；5x非還原型蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒：Servicebio公司。

YS-04A小型高速粉碎機(jī) 北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；KDC-1044L大容量低速離心機(jī)、HC-2064高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 樣品的制備

將小米粉碎、過篩，用石油醚對(duì)小米粉進(jìn)行脫脂，干燥后采用堿提酸沉法提取小米分離蛋白，50 ℃恒溫水浴下用0.1 mol/L的NaOH調(diào)溶液pH為12溶出分離蛋白，再用0.1 mol/L的HCl使蛋白沉淀，中和溶液pH后透析除鹽，用液氮對(duì)蛋白進(jìn)行速凍，再經(jīng)真空冷凍干燥制得小米分離蛋白[12-14]，提取出的小米分離蛋白主要含有谷蛋白、清蛋白和球蛋白[15]。

1.3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用考馬斯亮藍(lán)比色法[16]測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度，以不同質(zhì)量濃度的牛血清蛋白為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為：

A595=0.5451×C+0.0173。

式中：A595為595 nm處的吸光值，C為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，R2=0.9997。

1.4 不同處理對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

1.4.1 鹽離子濃度對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

使用鹽離子濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mol/L的NaCl溶液溶解分離蛋白，測(cè)定不同鹽離子濃度對(duì)小米分離蛋白溶解性的影響。

1.4.2 pH對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的小米分離蛋白溶液，加0.1 mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)整溶液pH為2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，測(cè)定不同pH對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響。

1.4.3 溫度對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的小米分離蛋白溶液，將溶液置于50，60，70，80，90，100 ℃的恒溫水浴鍋中，加熱處理1 h后取出迅速冷卻至室溫，測(cè)定不同溫度對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響。

1.5 分離蛋白SDS-PAGE分析

參考Laemmli[17]的SDS-PAGE法對(duì)小米分離蛋白進(jìn)行分析，將蛋白樣品溶解于非還原型上樣緩沖液中，振蕩完全后離心備用，在非還原型上樣緩沖液中加入20 μL的β-巰基乙醇，制得還原型上樣緩沖液。電泳膠采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制得，在電泳槽位依次加入5 μL的低分子量Marker蛋白標(biāo)樣以及20 μL的蛋白上樣緩沖液(非還原型與還原型)。濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V，條帶距底部1 cm處電泳停止。將電泳膠進(jìn)行染色及脫色操作后掃描成圖分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，并使用Origin 9.1軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

2.1.1 鹽離子濃度對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

圖1 鹽離子濃度對(duì)分離蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of salt ion content on the solubility of protein isolate

由圖1可知，隨著離子濃度的增加，蛋白的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先迅速降低后迅速增高再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，未加鹽離子的蛋白溶液質(zhì)量濃度最高。鹽離子濃度為0.01 mol/L時(shí)，質(zhì)量濃度開始下降，0.05 mol/L時(shí)達(dá)到最低，之后又開始上升，0.3 mol/L時(shí)蛋白質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。這說明低鹽離子濃度對(duì)小米蛋白聚集性影響顯著，而中、高鹽離子濃度會(huì)降低蛋白的溶解度，這種變化可能是由于低鹽離子會(huì)影響蛋白質(zhì)的表面電荷，產(chǎn)生電荷屏蔽效應(yīng)[18]，如果蛋白質(zhì)有較高的非極性區(qū)域，屏蔽效應(yīng)會(huì)引起蛋白質(zhì)抵御外來鹽離子的影響并發(fā)生聚集反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白溶解度迅速降低，許雪兒等[19]發(fā)現(xiàn)低鹽離子濃度會(huì)促進(jìn)玉米醇溶蛋白和負(fù)載生育酚結(jié)合，產(chǎn)生電荷屏蔽效應(yīng)、抵御鹽離子的影響。

2.1.2 pH對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

圖2 pH對(duì)分離蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of pH on the solubility of protein isolate

由圖2可知，隨著pH值的不斷增高，蛋白質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先減小后升高最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在pH值為4，4.5，5時(shí)蛋白質(zhì)量濃度相對(duì)較低，pH為5時(shí)達(dá)到最低，說明小米蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)位于pH 5附近，這與堿提酸沉法的原理相似[20]。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其正負(fù)電荷相等，此時(shí)蛋白質(zhì)分子在溶液中因?yàn)闆]有相同電荷的相互排斥，分子作用力減弱，蛋白質(zhì)分子碰撞幾率增大，隨之凝聚而產(chǎn)生沉淀，而pH不斷偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶電荷數(shù)增多，會(huì)產(chǎn)生靜電作用使蛋白質(zhì)分子之間不容易碰撞結(jié)合[21]。所以，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。高曉莉等[22]同樣發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH處于等電點(diǎn)附近時(shí)，燕麥蛋白的溶解度最低。

2.1.3 溫度對(duì)小米分離蛋白溶解度的影響

圖3 溫度對(duì)小米蛋白溶解度的影響Fig.3 Effect of temperature on the solubility of millet protein

由圖3可知，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)量濃度先升高，在60～80 ℃質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)，80 ℃時(shí)蛋白溶解度達(dá)到最低，90 ℃時(shí)又有所回升。這是由于大多數(shù)蛋白質(zhì)均對(duì)60 ℃以上的溫度敏感，隨著溫度升高，蛋白逐漸變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被打開，蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)分子與界面之間的相互作用力都會(huì)改變，進(jìn)而發(fā)生熱聚集反應(yīng)，致使蛋白質(zhì)溶解度下降[23]。但隨著溫度繼續(xù)升高，高溫條件會(huì)使已經(jīng)形成的熱聚集體發(fā)生熱分解，從而使蛋白溶解度增加。Hussain等[24]發(fā)現(xiàn)高溫條件使乳清蛋白的熱聚集體發(fā)生分解效應(yīng)，因此，溫度在90 ℃之后質(zhì)量濃度又有了一定程度的升高。

2.2 不同處理對(duì)小米分離蛋白亞基分布的影響

2.2.1 鹽離子濃度對(duì)小米分離蛋白亞基分布的影響

圖4 鹽離子濃度對(duì)小米蛋白上清液亞基帶分布的影響Fig.4 Effect of salt ion content on the subunit distribution of millet protein supernatant 注：0為低分子量Marker，1～12依次為不同鹽離子濃度處理后的小米蛋白上清液(0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 mol/L)，N為非還原樣品，R為還原樣品。

圖5 鹽離子濃度對(duì)小米蛋白沉淀亞基帶分布的影響Fig.5 Effect of salt ion content on the subunit distribution of millet protein precipitation 注：0為低分子量蛋白Marker，1～12依次為不同鹽離子濃度處理后的小米蛋白沉淀(0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 mol/L)，N為非還原樣品，R為還原樣品。

由圖4和圖5可知，上清液和沉淀樣品經(jīng)過β-巰基乙醇還原后，電泳中66.2 kDa以上的亞基帶消失不見，31～66.2 kDa之間的亞基條帶顏色加深，這表明蛋白樣品在經(jīng)過還原后，66.2 kDa以上亞基帶的消失與β-巰基乙醇的還原作用有關(guān)，β-巰基乙醇具有極強(qiáng)的還原作用，它可以使部分亞基帶中的二硫鍵打斷，破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，從而造成亞基帶下移[25]。

由圖4和圖5可知，低鹽離子濃度下沉淀樣品的泳帶比上清液更加清晰，這說明在低鹽離子濃度下上清液中溶解的蛋白較少，沉淀中所含的蛋白較多，這恰好對(duì)應(yīng)了圖1中所得的結(jié)果，證實(shí)了低鹽離子濃度會(huì)影響蛋白質(zhì)表面上的電荷，產(chǎn)生電荷屏蔽效應(yīng)，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)的聚集沉淀。

2.2.2 不同pH值下離心后小米蛋白電泳圖譜

圖6 pH對(duì)小米蛋白上清液亞基分布的影響Fig.6 Effect of pH on the subunit distribution of millet protein supernatant 注：0為低分子量蛋白Marker，1～12依次為不同pH處理后的小米蛋白上清液(pH為2,3,4,4.5,5,6,7,8,9,10,11,12)，N為非還原樣品，R為還原樣品。

圖7 pH對(duì)小米蛋白沉淀亞基帶分布的影響Fig.7 Effect of pH on the subunit distribution of millet protein precipitation 注：0為低分子量蛋白Marker，1～12依次為不同pH處理后的小米蛋白沉淀(pH為2,3,4,4.5,5，6,7,8,9,10,11,12)，N為非還原樣品，R為還原樣品。

pH對(duì)分離蛋白上清液的影響見圖6，泳帶4和5(pH為5和6)幾乎沒有亞基帶分布，其他泳帶的亞基帶明顯清晰，這一現(xiàn)象說明當(dāng)溶液pH處于蛋白的等電點(diǎn)附近時(shí)，上清液中絕大多數(shù)的蛋白會(huì)發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致上清液樣品中不含亞基帶分布，這是由于蛋白處于等電點(diǎn)時(shí)分子間作用力減弱，不斷碰撞聚集形成沉淀，而等電點(diǎn)的位置與三級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的組成有關(guān)，上清液電泳帶消失與圖2所得的結(jié)果一致。繼續(xù)觀察圖7中pH對(duì)分離蛋白沉淀的影響，可以發(fā)現(xiàn)沉淀在等電點(diǎn)處的泳帶都有亞基帶，這表明等電點(diǎn)處上清液中的蛋白聚集體整體遷移到了蛋白沉淀中，這進(jìn)一步驗(yàn)證了之前所得到的結(jié)論。通過比較非還原和還原的電泳圖，發(fā)現(xiàn)在樣品經(jīng)過還原后，66.2 kDa以上的亞基帶消失，而14.4～66.2 kDa的亞基帶顏色變深，這說明蛋白在經(jīng)過β-巰基乙醇還原后二硫鍵被打斷，分裂形成了低分子亞基帶。

2.2.3 不同溫度下小米蛋白電泳圖譜

圖8 溫度對(duì)小米蛋白上清液和沉淀亞基帶分布的影響Fig.8 Effect of temperature on the subunit distribution of millet protein supernatant and precipitation 注：0 為低分子量蛋白Marker，1～6依次為不同溫度處理后的小米蛋白上清液(50，60，70，80，90，100 ℃)；①～⑥依次為不同溫度處理后的小米蛋白沉淀(50，60，70，80，90，100 ℃)，N為非還原樣品，R為還原樣品。

由圖8可知，當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí)，上清液亞基帶顏色加深，溫度繼續(xù)升高到80 ℃時(shí)，亞基帶顏色不斷變淺，再將溫度提高到90 ℃時(shí)顏色開始加深，這一現(xiàn)象說明上清液中蛋白濃度先升高再下降最后又回升，這與圖3所得到的結(jié)果一致。造成此現(xiàn)象的原因可能是適當(dāng)?shù)臏囟瓤梢源龠M(jìn)蛋白的溶解度，當(dāng)溫度繼續(xù)升高使得蛋白變性，蛋白會(huì)發(fā)生熱聚集反應(yīng)，再將溫度提高到一定程度，蛋白熱聚集體會(huì)被高溫破壞，從而發(fā)生熱分解。通過比較非還原和還原電泳圖可以發(fā)現(xiàn)，66.2 kDa以上的亞基帶消失不見，31～66.2 kDa間的亞基帶顏色加深，這同樣證實(shí)了β-巰基乙醇有打斷二硫鍵的還原作用。

3 結(jié)論

通過使用離子濃度、pH及溫度對(duì)小米分離蛋白進(jìn)行處理，結(jié)果表明低離子濃度蛋白可能使蛋白發(fā)生電荷屏蔽效應(yīng)，該效應(yīng)會(huì)使小米分離蛋白抵御外來鹽離子的影響，從而聚集在一起產(chǎn)生大量蛋白沉淀，溶解度嚴(yán)重降低，而中、高鹽離子濃度會(huì)降低蛋白的溶解性，當(dāng)?shù)鞍兹芤旱膒H位于等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白所帶電荷相等，分子間作用力減弱，分子不斷碰撞進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈的聚集反應(yīng)，溫度適當(dāng)?shù)靥岣呖梢源龠M(jìn)蛋白的溶解，而中、高溫會(huì)使蛋白發(fā)生變性，產(chǎn)生熱聚集作用，但高溫會(huì)劇烈破壞熱聚集體的結(jié)構(gòu)，一定程度上增加了蛋白的溶解性。蛋白樣品經(jīng)過β-巰基乙醇的還原，大分子量的亞基帶消失，二硫鍵被打斷，形成了新的小分子量亞基帶。