馬 騫，朱 軍，蔡夢珊，郝 俊，章屹然，陳 睿

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710021；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安710032；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032)

惡性腫瘤作為全球嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題之一，極大地危害著人類的健康，已成為世界范圍內(nèi)首要死因，占全世界死因的13%[1]。而結(jié)直腸癌(Colorectal carcinoma，CRC)是世界上第三大常見癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第四大原因，在前期診斷、醫(yī)療保健費(fèi)用和衛(wèi)生服務(wù)利用等方面造成了沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[2-3]。CRC發(fā)病率和病死率總體呈上升趨勢，有效地實(shí)施篩查技術(shù)和減少接觸高危因素是降低CRC發(fā)病的根本措施。雖然臨床診斷和治療技術(shù)不斷提高，但由于缺乏有效的干預(yù)措施和早期診斷的特異性生物標(biāo)志物，CRC患者預(yù)后不理想(尤其是晚期CRC患者)且5年生存率低的狀況并沒有明顯改變[4-5]。因此，更好地探索CRC發(fā)病機(jī)制，尋找更敏感、更高效的診斷標(biāo)志物是CRC領(lǐng)域的一個(gè)重要目標(biāo)[6]。

組織活檢是目前診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但單個(gè)活檢提供的腫瘤在空間和時(shí)間上的信息是有限的，無法反映腫瘤的異質(zhì)性，因此需要尋找一種早期診斷、監(jiān)測CRC發(fā)生和發(fā)展過程的新型診斷技術(shù)。液體活檢可以提供所有癌癥病變基因圖譜(包括原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶)，可作為組織活檢的代替或者補(bǔ)充檢測手段[7]。外泌體是液體活檢的主要靶標(biāo)之一，并且外泌體具有濃度高、易富集和生物學(xué)活性穩(wěn)定的優(yōu)勢，因此外泌體在臨床診療應(yīng)用中具有很好的未來前景。外泌體是由所有細(xì)胞產(chǎn)生并存在于所有體液中的小細(xì)胞外囊泡[8]，細(xì)胞釋放多種不同大小的細(xì)胞外小泡，包括凋亡小體(1000～5000 nm)、中間微泡(200～1000 nm)和最小的外泌體(30～150 nm)[9]。腫瘤細(xì)胞比正常增殖細(xì)胞產(chǎn)生和分泌更多的外泌體，并且癌癥患者血漿和其他體液中的外泌體水平普遍是升高的[10-11]。因此，外泌體內(nèi)容物對(duì)癌癥早期診斷以及治療可能有著很好的幫助。

本研究通過exoRBase數(shù)據(jù)庫獲得CRC患者和正常人血漿樣本RNA信息，應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選CRC差異表達(dá)的外泌體RNA[包括信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)]表達(dá)譜，并構(gòu)建CRC發(fā)生相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)網(wǎng)絡(luò)，分析與CRC相關(guān)的mRNA、lncRNA、circRNA，并對(duì)mRNA進(jìn)行功能富集分析。將CRC患者血漿外泌體中多種功能RNA聯(lián)合起來進(jìn)行分析為挖掘出更多新的CRC腫瘤標(biāo)志物提供了可能性，并且對(duì)CRC早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有著指導(dǎo)意義，為臨床醫(yī)生治療決策的選擇提供了更多可能性。

1 資料與方法

1.1 資料下載 從exoRBase(http://www.exorbase.org/)下載CRC和正常人血標(biāo)本外泌體RNA(包括mRNA、lncRNA、circRNA)表達(dá)譜，其中CRC患者血標(biāo)本12例，正常人血標(biāo)本32例，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行格式預(yù)處理。

1.2 差異表達(dá)基因(DEGs)篩選 使用“l(fā)imma”和“sva”R包來鑒定DEGs。符合|log2FC|>0且P<0.05的RNA被篩選為DEGs(包括DEmRNAs、DElncRNAs、DEcircRNAs)，并繪制相應(yīng)的火山圖。

1.3 微小RNA(miRNA)預(yù)測及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究通過Target Scan Human 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRanda(http://cbio.mskcc.org/microrna_data/miRanda-aug2010.tar.gz)預(yù)測mRNA相對(duì)應(yīng)的miRNA；使用ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)對(duì)circRNA進(jìn)行預(yù)測得到其miRNA；在miRcode(http://www.mircode.org/)對(duì)lncRNA進(jìn)行預(yù)測。最后，將相關(guān)mRNA、circRNA、lncRNA和其相對(duì)應(yīng)的miRNA預(yù)測數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，根據(jù)共同靶向miRNA構(gòu)建miRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 功能富集分析 為了評(píng)估在外泌體中差異表達(dá)的mRNAs潛在生物學(xué)功能，我們用clusterProfiler、enrichplot和ggplot2軟件包進(jìn)行基因本體論(GO)注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。GO富集分析主要包括生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)三組，基于GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行顯著性分析。KEGG富集分析依據(jù) KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行通路顯著性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的統(tǒng)計(jì)分析均在R 3.63統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中完成。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)或方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs篩選結(jié)果 共篩選出125個(gè)差異表達(dá)的mRNAs(DEmRNAs)(上調(diào)基因118個(gè)，下調(diào)基因7個(gè))、53個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs(DElncRNAs)(均為下調(diào)基因)和81個(gè)差異表達(dá)的circRNAs(DEcircRNAs)(其中上調(diào)47個(gè)，下調(diào)34個(gè))。DEGs火山圖見圖1。

圖1 CRC患者與正常人血漿外泌體中三種差異RNAs火山圖

2.2 miRNA相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于CRC差異性表達(dá)的mRNA、lncRNA、circRNA及相對(duì)應(yīng)的miRNA預(yù)測數(shù)據(jù)，本研究構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)，共25個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)、16個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、13個(gè)circRNA節(jié)點(diǎn)和62個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)(圖2)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b、miR-17等可以輔助診斷CRC[12]；miR-6家族成員可以作為診斷癌癥的潛在生物標(biāo)志物[13]；miR-429失調(diào)參與了多種癌癥上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥等過程[14]；miR-218、miR-497可以作為癌癥預(yù)后標(biāo)志物[15-16]；miR-135可以作為一種新的消化道腫瘤標(biāo)志物[17]。

圖2 mRNA相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 Go注釋及KEGG通路富集分析 為了進(jìn)一步檢測ceRNA網(wǎng)絡(luò)中所有差異表達(dá)mRNA在CRC中的潛在功能，我們進(jìn)行了GO和KEGG功能富集分析。GO注釋富集分析顯示，外泌體mRNA主要富集在高爾基組織、高爾基體網(wǎng)、高爾基池、高爾基順行池、高爾基堆、核孔、高爾基池膜、富含ficolin-1顆粒腔、黏著斑[18]、細(xì)胞基質(zhì)黏附連接、細(xì)胞-基底連接、GTP結(jié)合蛋白R(shí)AN通路(圖3)。KEGG通路富集分析顯示，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)的mRNAs主要富集在志賀菌病、FcγR介導(dǎo)的光細(xì)胞增多癥、胰高血糖素信號(hào)通路、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)通路、多種壽命調(diào)節(jié)途徑、腎細(xì)胞癌、沙門氏菌感染[19]、癌癥中心碳代謝、胞吞作用、上皮細(xì)胞侵襲、胰腺癌通路(圖4)。其中，GTP結(jié)合蛋白R(shí)AN與整體癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[20]；MAPK上調(diào)是CRC發(fā)展過程中的必需環(huán)節(jié)[21]；VEGF對(duì)CRC患者生存率有重要影響[22]；癌癥中心碳代謝會(huì)在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPKC)協(xié)調(diào)下促進(jìn)癌細(xì)胞生長[23]。上述結(jié)果表明，血漿外泌體中差異表達(dá)mRNA在CRC發(fā)生與發(fā)展中可能起著重要作用。

圖3 GO注釋富集分析柱狀圖(A)與氣泡圖(B)

圖4 KEGG通路富集分析柱狀圖(A)與氣泡圖(B)

3 討 論

CRC是我國常見的消化道惡性腫瘤之一[24]，預(yù)后與分期密不可分。CRC早期患者5年生存率可達(dá)90%，而晚期患者卻不到10%，因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療對(duì)于CRC患者顯得十分重要。目前已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)新模式，從分子層面探索和發(fā)現(xiàn)CRC新的診斷標(biāo)志物將有望為CRC的診斷提供新思路和新策略。

外泌體中富含多種生物活性物質(zhì)，包括核酸、蛋白、脂質(zhì)等，其中核酸包括miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等[25]，這為我們建立多種RNA聯(lián)合的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了很好的數(shù)據(jù)來源。與傳統(tǒng)液體活檢所檢測的細(xì)胞游離核酸相比，外泌體具有濃度高、易富集和生物學(xué)活性穩(wěn)定的優(yōu)勢，因此外泌體在臨床診療應(yīng)用中具有很好的未來前景。已有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中miRNAs可以成為一種特別有前途的生物標(biāo)志物候選物。miRNAs在細(xì)胞生長、分化、增殖、發(fā)育、凋亡和代謝等多種過程中發(fā)揮著重要作用[26]，某些miRNA，如miR-21，被發(fā)現(xiàn)在實(shí)體瘤患者的血漿外泌體中高表達(dá)，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌[27]，并且miR-21表達(dá)水平與疾病的存在、進(jìn)展和對(duì)治療的反應(yīng)相關(guān)[28-29]。在非小細(xì)胞肺癌中，外泌性miRNA與無病生存率和總生存率相關(guān)。

ceRNA在包括CRC、前列腺癌、黑色素瘤、惡性膠質(zhì)瘤、肝癌和乳腺癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。各種類型的RNA分子，如mRNA、lncRNA、假基因和circRNA，通過共享共同的miRNA反應(yīng)元件(MRE)形成一個(gè)相互調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)ceRNA假說，共享一個(gè)或多個(gè)MRE的RNA分子可以充當(dāng)ceRNA；兩個(gè)RNA共享的MRE越多，它們之間的關(guān)系就越密切。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的假說為更全面地理解基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)?；蛲蛔?、表觀遺傳修飾和染色體重排經(jīng)常出現(xiàn)在腫瘤的非編碼基因組中，由于mRNA中的3-UTR序列相對(duì)較短，MREs相對(duì)較小的突變或缺失可改變非編碼RNA(ncRNA)的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后控制，進(jìn)一步破壞ceRNA網(wǎng)絡(luò)的平衡。反過來，ceRNA網(wǎng)絡(luò)的不平衡可能促進(jìn)腫瘤中多種惡性生物學(xué)行為。然而，目前對(duì)于CRC ceRNA網(wǎng)絡(luò)的研究主要集中在lncRNA上，對(duì)假基因、circRNA或tRNA的研究相對(duì)較少。因此，本研究更全面地發(fā)現(xiàn)和整合了CRC ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA結(jié)合起來構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于認(rèn)識(shí)CRC發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療的調(diào)控分子機(jī)制，為將來CRC的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療提供了借鑒和依據(jù)。

本研究共篩選出125個(gè)mRNAs、53個(gè)lncRNAs和81個(gè)circRNAs，并與其對(duì)應(yīng)的miRNA預(yù)測數(shù)據(jù)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，再對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的25個(gè)共同差異表達(dá)mRNA進(jìn)行富集分析。GO注釋富集分析顯示，CRC ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的外泌體mRNA與癌癥相關(guān)通路主要富集在GTP結(jié)合蛋白R(shí)AN通路。KEGG通路富集分析顯示主要富集于MAPK和VEGF信號(hào)通路。

綜上所述，本研究確定了CRC發(fā)生相關(guān)的外泌體RNA并構(gòu)建了相應(yīng)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究CRC轉(zhuǎn)移、進(jìn)展提供了分子基礎(chǔ)，同時(shí)為CRC早期診斷提供了新型的液體活檢生物學(xué)標(biāo)志物。但是還存在以下不足：外泌體樣本量少，需要進(jìn)一步進(jìn)行臨床多中心驗(yàn)證；缺乏與其他數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合分析；缺乏進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。