袁琳， 朱昱蓉， 林琳， 黃霜， 姜旭淦， 陳盛霞

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是一種重要的人獸共患食源性病原，被WHO列為四大食源性病原菌之一。免疫力低下的人群(如老人、嬰幼兒、孕婦等)，Lm感染會造成致命的腦膜炎、敗血癥，孕婦早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等[1]，死亡率可高達(dá)20%～30%，危害很大，已成為一種全球性疾病。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體和細(xì)胞焦亡與多種感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病以及心血管疾病等密切相關(guān)[2]。細(xì)胞焦亡是細(xì)胞程序性死亡機(jī)制中的一種特殊方式，主要通過炎癥小體介導(dǎo)包含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)在內(nèi)的多種caspase的激活，造成包括消化道皮膚素D(gasdermin D，GSDMD)在內(nèi)的多種gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化，表現(xiàn)為GSDMD前體蛋白(pro-GSDMD)剪切，釋放氨基端裂解片段(GSDMD-NT)，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。相比于細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡發(fā)生得更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是目前研究較為透徹的炎癥小體之一，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1三部分組成，可以被多種微生物、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號和環(huán)境刺激物激活[3]。MCC950是針對NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑，主要通過改變NLRP3的構(gòu)象來抑制炎癥小體的形成[4]。目前，炎癥小體對Lm感染引起的免疫調(diào)控機(jī)制仍不清晰。本研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，檢測Lm感染C57B/6小鼠和人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡及相關(guān)炎癥小體的表達(dá)水平，并通過NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950來探討NLRP3炎癥小體在Lm感染過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物 單核細(xì)胞增生李斯特菌EDG株由天津醫(yī)科大學(xué)申艷娜教授惠贈，THP-1細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫，5～6周齡雌性C57B/6小鼠購于江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清(以色列BI公司)；腦心浸出液肉湯(BHI，北京路橋技術(shù)股份有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)所用引物由上海生工合成；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑(南京諾唯贊公司)；LPS、ATP(美國Sigma公司)；人IL-1β ELISA 試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司)；NLRP3 抗體(美國Abcam公司)；ASC抗體(美國Santa Cruz公司)；caspase-1前體蛋白(pro-caspase-1)、IL-β前體蛋白(pro-IL-β)、caspase-1裂解片段蛋白20(caspase-1 p20)和IL-1β裂解片段蛋白17(IL-1β-17)抗體(沈陽萬類公司)，GSDMD抗體(美國CST公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠二抗(北京康為世紀(jì)公司)；Alexa Fluor488羊抗小鼠熒光二抗(南京福麥斯公司)；CoraLite594羊抗兔熒光二抗(武漢Proteintech公司)；MCC950(美國MCE公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)；PCR儀(上海天能公司)；qRT-PCR StepOne Plus(美國ABI公司)；電泳儀(美國Bio Rad公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 Lm培養(yǎng) 挑取Lm單個(gè)菌落接種于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min于恒溫空氣浴搖床培養(yǎng)16 h，在無菌條件下離心去除BHI培養(yǎng)液，并用PBS清洗2次，使用分光光度計(jì)調(diào)整細(xì)菌懸液光密度至D(600 nm)=1，此時(shí)對應(yīng)細(xì)菌濃度約為1×109CFU/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Lm感染C57B/6小鼠及組織蛋白提取 C57B/6小鼠隨機(jī)分為Lm感染組(Lm組)和陰性對照組(NC組)，每組3只，分別經(jīng)尾靜脈注射等體積Lm菌液(5×104CFU/只)及無菌PBS，24 h后斷頸處死，收集小鼠脾臟、肝臟和腦組織，用組織蛋白提取試劑盒提取蛋白。

1.2.3 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及THP-1源巨噬細(xì)胞誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基在5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到約90%時(shí)，1 ∶3進(jìn)行傳代。取6代以內(nèi)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用佛波酯(100 ng/mL)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)時(shí)間為48 h。

1.2.4 Lm感染THP-1源巨噬細(xì)胞 體外實(shí)驗(yàn)包括Lm組、NC組、LPS+ATP組(陽性對照組)、Lm+MCC950組(感染+抑制劑組)和LPS+ATP+MCC950組(陽性對照+抑制劑組)。用6孔或24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入1×106個(gè)或2×105個(gè)THP-1源巨噬細(xì)胞。Lm組按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=10接種Lm于細(xì)胞中，孵育1 h后加入10 μL慶大霉素殺胞外菌，殺菌1 h后換無抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。NC組加等體積PBS。LPS+ATP組先加100 ng/mL LPS，3 h后再加5 mmol/L ATP孵育30 min，吸棄培養(yǎng)基加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。Lm+MCC950組和LPS+ATP+MCC950組均先加40 μmol/L MCC950抑制劑于細(xì)胞中，2 h后分別進(jìn)行細(xì)菌刺激或陽性對照刺激。從加入Lm開始記為0 h，于6 h和24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用于ELISA檢測；0 h、1 h、3 h和6 h收集細(xì)胞用于qRT-PCR檢測，3 h收集細(xì)胞用于蛋白質(zhì)印跡法及免疫熒光檢測。

1.2.5 qRT-PCR檢測細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表達(dá) 加入Trizol試劑裂解細(xì)胞，按照說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用SYBR Green Ⅰ染料法進(jìn)行定量PCR。引物序列如下，內(nèi)參GAPDH：上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游5′- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物169 bp。NLRP3：上游5′-GCTGCGATCAACAGGCGAGAC-3′，下游5′-AAGGCTGTCCTCCTGGCATACC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物108 bp。ASC：上游5′-CTCAAGAAGTTCAAGCTGAAGC-3′，下游5′-TAGGTCTCCAGGTAGAAGCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物134 bp。Caspase-1：上游5′-GAAGAAACACTCTGAGCAAGTC-3′，下游5′-GATGATGATCACCTTCGGTTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物112 bp。IL-1β：上游5′-ACAGTGGCAATGAGGATGAC-3′，下游5′-AGGTGCATCGTGCACATAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物311 bp。IL-18：上游5′-ACAGTGGCAATGAGGATGAC-3′，下游：5′-AGGTGCATCGTGCACATAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物121 bp。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。分析基因擴(kuò)增的平均Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，按照公式2-ΔΔCt進(jìn)行相對定量計(jì)算。

1.2.6 ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-1β含量 收集處理后的THP-1源巨噬細(xì)胞上清液，按照說明書進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出標(biāo)本濃度。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠和細(xì)胞炎癥小體及焦亡蛋白表達(dá) 試劑盒提取小鼠組織蛋白，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，甲醇-氯仿濃縮細(xì)胞上清蛋白，各樣本蛋白濃度調(diào)整一致后，進(jìn)行SDS-PAGE約2 h，然后350 mA、90 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h，一抗(GAPDH 1 ∶2 000，NLRP3 1 ∶1 000，ASC 1 ∶100，pro-IL-β 1 ∶1 000，pro-caspase-1 1 ∶500，IL-1β-17 1 ∶300，caspase-1 p20 1 ∶500，GSDMD 1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，用相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗(羊抗小鼠1 ∶3 000，羊抗兔1 ∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL曝光液曝光，拍照記錄結(jié)果。Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度掃描分析。

1.2.8 免疫熒光檢測ASC斑點(diǎn)及與NLRP3的共定位 24孔板內(nèi)放置細(xì)胞玻片，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，按MOI=10接種Lm 3 h后，加4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100 4 ℃下透膜5 min后，用含5% BSA的PBS室溫封閉1 h，一抗(NLRP3 1 ∶100，ASC 1 ∶50)4 ℃孵育過夜，二抗(羊抗小鼠1 ∶250，羊抗兔1 ∶250)37 ℃孵育1 h。DAPI 1 ∶300稀釋，染核5 min，熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lm感染C57B/6小鼠和THP-1源巨噬細(xì)胞均發(fā)生焦亡

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與NC組比較，Lm組小鼠脾、肝、腦組織以及THP-1細(xì)胞GSDMD蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05)，且出現(xiàn)GSDMD-NT，見圖1。

*：P<0.05，與NC組比較

2.2 Lm感染C57B/6小鼠激活靶器官NLRP3炎癥小體

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與NC組比較，Lm組小鼠脾、肝、腦組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β及裂解片段caspase-1 p20、IL-1β-17蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)，見圖2。

①：NLRP3蛋白；②：pro-caspase-1蛋白；③：caspase-1 p20蛋白；④：pro-IL-1β蛋白；⑤：IL-1β-17蛋白；*：P<0.05，與NC組比較

2.3 Lm感染THP-1源巨噬細(xì)胞激活NLRP3炎癥小體

qRT-PCR結(jié)果顯示，Lm感染1 h、3 h、6 h后NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表達(dá)量均較0 h呈上升趨勢(P<0.05)，且3 h升高最明顯，而ASCmRNA表達(dá)量變化不明顯，見圖3。收集6 h和24 h培養(yǎng)上清液，ELISA檢測結(jié)果顯示，Lm感染組及陽性對照組6 h和24 h IL-1β表達(dá)水平均升高(P<0.05)，見圖4。

*：P<0.05，與0 h比較

*：P<0.05，與NC組比較

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，Lm感染組及陽性對照組細(xì)胞裂解液中NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達(dá)量較陰性對照組明顯升高(P<0.05)；ASC略微升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞上清液中出現(xiàn)pro-caspase-1及pro-IL-1β的活化裂解片段caspase-1 p20及IL-1β-17，見圖5。免疫熒光染色結(jié)果顯示，Lm感染后有明顯的ASC斑點(diǎn)形成，細(xì)胞中有炎癥小體的激活，同時(shí)ASC蛋白與NLRP3蛋白存在共定位，表明激活的是NLRP3炎癥小體。Lm組結(jié)果與LPS+ATP組一致，見圖6。

①：NLRP3蛋白；②：ASC蛋白；③：pro-caspase-1蛋白；④：pro-IL-1β蛋白；⑤：caspase-1 p20蛋白；⑥：IL-1β-17蛋白；

2.4 MCC950抑制劑處理后細(xì)胞焦亡減少

特異性抑制劑MCC950處理后，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與Lm組比較，Lm+MCC950組裂解片段GSDMD-NT明顯減少(P<0.05)，總片段pro-GSDMD基本不變；與LPS+ATP組比較，LPS+ATP+MCC950組GSDMD-NT明顯也減少(P<0.05)，pro-GSDMD基本不變，見圖7。

DAPI(藍(lán))染細(xì)胞核，F(xiàn)ITC(綠)染ASC，TRITC(紅)染

①：NC組；②：Lm組；③：LPS+ATP組；④：Lm+MCC950組；⑤：LPS+ATP+MCC950組；a：P<0.05，與Lm組比較；b：P<0.05，與LPS+ATP組比較

3 討論

細(xì)胞焦亡可通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡，將細(xì)菌從細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制生態(tài)位中驅(qū)逐出去[5-6]，或通過直接的抗菌作用來減少細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量，是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌清除的有效機(jī)制[2]。這一過程調(diào)節(jié)宿主對病原體的防御，但另一方面，過度的炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡可誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，引起組織器官損傷，導(dǎo)致宿主死亡。NLRP3炎癥小體作為先天免疫的重要成分，通過激活caspase-1加工分泌成熟的促炎因子IL-1β、IL-18[7]，在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用[8]。感染豬鏈球菌流行株導(dǎo)致的鏈球菌中毒性休克樣綜合征(STSLS)中，NLRP3炎癥小體被證實(shí)發(fā)揮了重要作用，使用MCC950抑制劑及NLRP3基因敲除鼠，小鼠STSLS癥狀明顯緩解[9]。NLRP3炎癥小體在感染過程中可以被病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)激活，但損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)的慢性激活對宿主是有害的。已有研究表明，在致死性甲型流感病毒感染的不同階段，阻斷NLRP3的激活可能具有保護(hù)作用，也可能是有害的[10]。目前大多數(shù)研究僅基于體外實(shí)驗(yàn)證明NLRP3炎癥小體在Lm感染的巨噬細(xì)胞中具有清除細(xì)菌的作用，表明Lm感染可誘導(dǎo)caspase-1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡[11]，激活多種炎癥小體[12-15]。但具體哪一種炎癥小體發(fā)揮主要作用尚無定論，爭議集中在NLRP3和AIM2兩者之中[16-17]，并且大多僅僅基于巨噬細(xì)胞體外模型的研究，對體內(nèi)感染的研究較少。

本研究表明，Lm感染小鼠及巨噬細(xì)胞后均會引起細(xì)胞焦亡，且NLRP3炎性小體在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮了重要的作用。Lm感染巨噬細(xì)胞后能誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生和分泌，ASC斑點(diǎn)的形成，及裂解片段caspase-1 p20、IL-1β-17的釋放，充分證明了NLRP3炎癥小體的激活。同時(shí)，在體內(nèi)感染模型中，Lm感染的主要靶器官，脾、肝、腦組織均檢測到NLRP3炎癥小體的激活以及焦亡的發(fā)生。NLRP3炎癥小體特異性抑制劑MCC950能夠抑制Lm誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

本研究中GSDMD抗體能夠同時(shí)檢測出總片段和剪切后的活性片段，在小鼠組織中pro-GSDMD表達(dá)升高，同時(shí)發(fā)生剪切，產(chǎn)生具有活性的GSDMD-NT蛋白；而在THP-1巨噬細(xì)胞中，僅GSDMD-NT發(fā)生變化，這可能與THP-1巨噬細(xì)胞系有關(guān)，THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)貼壁后，激活了某些炎癥通路，導(dǎo)致本底偏高，因此在Lm感染和MCC950加入后總蛋白表達(dá)變化不明顯。另外，由于ASC主要通過寡聚化聚合使炎癥小體激活，其表達(dá)量的變化與炎癥小體無直接聯(lián)系；炎癥小體是否激活主要看ASC斑點(diǎn)是否形成，對ASC蛋白表達(dá)的檢測不是必需的，因此未在小鼠組織中檢測ASC蛋白表達(dá)。

Lm是一種可穿越血腸屏障、血胎屏障、血腦屏障的病原菌，而NLRP3作為該菌的主要傳感器之一，可能在單核細(xì)胞增生李斯特菌相關(guān)的流產(chǎn)[18]、腦膜炎[19]、敗血癥等病理過程中發(fā)揮重要作用。對細(xì)胞焦亡及炎癥小體的深入研究，有助于更好地了解李斯特菌病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，特異性抑制劑MCC950的作用提示NLRP3可作為李斯特菌病治療新靶點(diǎn)。