張成林，錢怡霖，劉尊英

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），也稱 2-羥基-3-苯基丙酸，是一種微生物通過(guò)次級(jí)代謝產(chǎn)生的新型天然抗菌物質(zhì)，對(duì)多種食源性致病菌和食品腐敗菌有很強(qiáng)的抑制作用，具有安全、高效、廣譜等特點(diǎn)。苯乳酸是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于各種發(fā)酵食品中，在食品工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。前期研究表明，培養(yǎng)基成分對(duì)植物乳桿菌的苯乳酸產(chǎn)量會(huì)產(chǎn)生一定的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基組成能夠促進(jìn)苯乳酸的生成[4-5]；另外，酵母菌代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)[6]，向植物乳桿菌培養(yǎng)基中添加適量的代謝產(chǎn)物也有利于提高有機(jī)酸產(chǎn)量[7]。

本研究以植物乳桿菌AB-1（Lactobacillus plantarum AB-1）為研究對(duì)象，使用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分、外源添加酵母菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free supernatant，CFS）的方式，探究不同因素對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)代謝以及苯乳酸產(chǎn)量的影響，以期為苯乳酸的生物法高效制備提供基礎(chǔ)性研究數(shù)據(jù)，為開(kāi)發(fā)新型食品生物防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

植物乳桿菌AB-1：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平教授團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng)；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 606（E1）、釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 626（E2）：中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)品高值化利用實(shí)驗(yàn)室保存菌種。苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：Sigma公司；苯丙氨酸、α-酮戊二酸、葡萄糖、蛋白胨、吐溫80、牛肉浸粉、KH2PO4（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、三氟乙酸（色譜純）：Merck公司；初始MRS培養(yǎng)基（葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉8.0 g/L、吐溫 80 1.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L）、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）（葡萄糖 20.0 g/L、蛋白胨20.0g/L、酵母浸粉10.0 g/L）、LB培養(yǎng)基（蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、氯化鈉10.0g/L）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

SpectrumLabS23A紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱：美國(guó)安捷倫公司；TSQ 280恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設(shè)備有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱：寧波東南儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苯乳酸含量測(cè)定

采用反相高效液相色譜法（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）測(cè)定苯乳酸含量，參考楊小院等[8]的方法略作修改。發(fā)酵液預(yù)處理：發(fā)酵液先經(jīng)過(guò)10 000 r/min離心處理10 min，將上清液用微濾膜 （0.22 μm）過(guò)膜。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相：A為0.05%三氟乙酸的甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸的水溶液；梯度洗脫條件：0～20 min（10%A→100%A），20 min～23 min（100%A→100%A），23 min～25 min（100%A→10%A）。

1.2.2 初始MRS培養(yǎng)基成分優(yōu)化

配制不同含量的葡萄糖（G）（20.0、22.5、25.0、27.5、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、100.0 g/L）、蛋白胨（P）（10.0、15.0、20.0、30.0、35.0、40.0、50.0 g/L）、 吐溫 80（1.0、3.0、6.0、9.0、13.0、15.0、18.0 g/L）、牛肉浸粉（8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 g/L）的 MRS 培養(yǎng)基，將植物乳桿菌AB-1按照1%接種量接種，37℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)定PLA含量。

根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別增加初始MRS培養(yǎng)基中葡萄糖和蛋白胨的含量均有利于苯乳酸產(chǎn)量的提高，繼續(xù)探究同時(shí)增加兩種組分對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)分為4組，以初始MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照組Ⅰ。試驗(yàn)過(guò)程中其它組分的含量均與對(duì)照組Ⅰ相同，僅改變葡萄糖、蛋白胨的含量，不同組別培養(yǎng)基組分添加量見(jiàn)表1。

表1 不同組別培養(yǎng)基組分添加量Table 1 Addition of medium components in different groups

1.2.3 植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)曲線繪制

采用光密度法繪制植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)曲線。將菌株接種在MRS固體培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)14 h后，挑取單菌落進(jìn)行固體平板劃線分離純化，長(zhǎng)出單菌落后接種至MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，然后用移液槍吸取50 μL穩(wěn)定期菌液分別接種至5 mL優(yōu)化MRS培養(yǎng)基和初始MRS培養(yǎng)基中（組別見(jiàn)表1），靜置培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定1次菌液在600 nm下的光密度值（OD600），每組3個(gè)平行，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（h），繪制生長(zhǎng)曲線，以初始MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照組Ⅰ。

1.2.4 苯丙氨酸含量測(cè)定

參照楊立志等[9]的方法并略作修改，檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.6%乙酸水溶液；流動(dòng)相B為甲醇；柱溫：30℃；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；分離柱型號(hào)：C18 Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6×250 mm，5 μm）； 檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm。 洗脫程序： 0～12 min（80%A→80%A），12 min～15 min（80%A→40%A），15 min～27 min（40%A→40%A），27 min～30 min（40%A→80%A）。

1.2.5 α-酮戊二酸含量測(cè)定

檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器；流動(dòng)相：采用0.08 mol/L KH2PO4（pH 3.00）；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；色譜柱：Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.6 酵母菌CFS的制備

將酵母菌E1、E2在YPD固體培養(yǎng)基中活化2代，挑取單菌落接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)20、40h，分別收集發(fā)酵液，10000r/min 離心 10min，再經(jīng)0.22 μm濾菌器過(guò)濾除菌，得到酵母菌CFS，于-80℃保存待測(cè)[10]。

1.2.7 酵母菌CFS對(duì)植物乳桿菌AB-1生產(chǎn)PLA的影響

植物乳桿菌AB-1按照1%的接種量接種至優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中，保證初始菌體濃度一致，分別將YPD培養(yǎng)基與發(fā)酵20、40 h的兩株酵母菌E1、E2的上清液按照5%、10%、15%、20%、30%的比例添加到優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中，同時(shí)以YPD培養(yǎng)基作為對(duì)照組Ⅱ，測(cè)定24 h后苯乳酸含量。

1.2.8 酵母菌CFS對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)的影響

植物乳桿菌AB-1按照1%的接種量接種至優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中，保證初始菌體濃度一致，然后外源添加15%經(jīng)40 h發(fā)酵的酵母菌E1 CFS作為CFS組，同時(shí)以添加等量的YPD培養(yǎng)基作為對(duì)照組Ⅱ，分別測(cè)定植物乳桿菌AB-1的生長(zhǎng)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)處理3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理分析及作圖采用O－rigin 2017及SPSS 24.0，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，單因素方差分析采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD），P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌AB-1培養(yǎng)基優(yōu)化研究

葡萄糖作為植物乳桿菌生長(zhǎng)代謝中的碳源[11]，在苯乳酸合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此，研究不同葡萄糖含量的MRS培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌AB-1產(chǎn)生苯乳酸的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同培養(yǎng)基成分對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different medium concentrations on the phenyllactic acid production of L.plantarum AB-1

如圖1（A）所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨初始MRS培養(yǎng)基中葡萄糖含量增加，植物乳桿菌AB-1苯乳酸產(chǎn)量顯著提高，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到27.5 g/L時(shí)，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到峰值96.5 mg/L。葡萄糖作為糖酵解的重要底物，適當(dāng)增加葡萄糖濃度可以促進(jìn)糖酵解途徑[5]，從而產(chǎn)生更多檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，促進(jìn)苯乳酸產(chǎn)生。隨著葡萄糖濃度的進(jìn)一步增加，苯乳酸產(chǎn)量開(kāi)始降低，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是過(guò)高的糖含量并不利于植物乳桿菌AB-1的生長(zhǎng)，從而影響其次級(jí)代謝途徑。

蛋白胨富含氨基酸，是植物乳桿菌生長(zhǎng)代謝中的重要氮源，其中苯丙氨酸可作為苯乳酸合成的底物。如圖1（B）所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著蛋白胨添加量的提高，植物乳桿菌AB-1的苯乳酸產(chǎn)量增加，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0 g/L時(shí)，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到93.0 mg/L。由此可見(jiàn)，適當(dāng)增加蛋白胨的濃度，提供更多苯丙氨酸底物[12-13]，可促進(jìn)苯乳酸的產(chǎn)生。

吐溫80作為一種表面活性劑，對(duì)培養(yǎng)基成分的均勻分布具有顯著影響。如圖1（C）所示，隨著吐溫80濃度的增加，苯乳酸的產(chǎn)量出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，該現(xiàn)象可能是由于吐溫80改變了植物乳桿菌AB-1細(xì)胞壁的通透性，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的流出導(dǎo)致苯乳酸無(wú)法正常合成[14]。

牛肉浸粉是發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)氮源，但牛肉浸粉濃度的增加對(duì)苯乳酸產(chǎn)量并未產(chǎn)生顯著影響。如圖1（D）所示，初始MRS培養(yǎng)基的氮源已基本達(dá)到飽和，無(wú)需更多氮源的添加。

葡萄糖和蛋白胨聯(lián)合添加對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)和苯乳酸產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖和蛋白胨聯(lián)合添加對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)和苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of combined glucose and peptone on the growth and PLA production of L.plantarum AB-1

如圖2（A）所示，相對(duì)于單獨(dú)增加葡萄糖、蛋白胨的結(jié)果，同時(shí)增加兩組分的含量更能顯著促進(jìn)植物乳桿菌AB-1的生長(zhǎng)；圖2（B）所示，兩組分的共同添加進(jìn)一步提高了植物乳桿菌AB-1的苯乳酸產(chǎn)量，由初始的81.2 mg/L提高至103.8 mg/L，說(shuō)明同時(shí)增加葡萄糖和蛋白胨可促進(jìn)植物乳桿菌AB-1的生長(zhǎng)繁殖、提高細(xì)菌總量，從而達(dá)到提高苯乳酸產(chǎn)量的目的，此時(shí)得到優(yōu)化MRS培養(yǎng)基（葡萄糖濃度27.5 g/L，蛋白胨濃度30 g/L，其余組分與初始MRS培養(yǎng)基相同）。

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間和酵母菌CFS添加量對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)趨勢(shì)及苯乳酸產(chǎn)量的影響

前期研究表明，酵母菌CFS中的代謝產(chǎn)物對(duì)植物乳桿菌生成有機(jī)酸具有一定的促進(jìn)作用，但詳細(xì)機(jī)理尚未表征。在優(yōu)化MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究不同培養(yǎng)時(shí)間和不同添加量酵母菌CFS對(duì)植物乳桿菌AB-1生產(chǎn)苯乳酸的影響見(jiàn)圖3。

由圖3A、圖3B可知，對(duì)比相同添加量下不同發(fā)酵時(shí)間的影響，發(fā)酵40 h后的CFS均比發(fā)酵20 h的CFS更能提高總PLA含量，說(shuō)明適當(dāng)延長(zhǎng)酵母菌的培養(yǎng)過(guò)程可積累更多的代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物進(jìn)一步促進(jìn)了植物乳桿菌AB-1代謝生成苯乳酸；當(dāng)添加量為15%時(shí)，酵母菌E1、E2 CFS對(duì)苯乳酸的促進(jìn)作用均顯著優(yōu)于對(duì)照組Ⅱ，此時(shí)酵母菌CFS能最好的發(fā)揮作用，比例繼續(xù)提高時(shí)促進(jìn)作用反而減弱，推測(cè)是因?yàn)榻湍妇鶦FS的添加稀釋了原本的培養(yǎng)基，使得植物乳桿菌AB-1可直接利用的碳源和氮源減少，從而減少了苯乳酸的生成；由圖3（C）可知，在酵母菌CFS發(fā)酵時(shí)間為40 h，添加量為15%的條件下，酵母菌E1比E2更能促進(jìn)植物乳桿菌AB-1生產(chǎn)苯乳酸，說(shuō)明酵母菌E1可能在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生更多有利的次級(jí)代謝產(chǎn)物。綜上，在優(yōu)化MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，以15%的比例添加酵母菌E1發(fā)酵40 h的CFS，對(duì)植物乳桿菌AB-1苯乳酸的生成產(chǎn)生最大的促進(jìn)作用，使PLA含量達(dá)到130.2 mg/L，相較于不加酵母菌CFS的優(yōu)化MRS培養(yǎng)基和初始MRS培養(yǎng)基分別提高了25.4%和60.3%。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間和酵母菌CFS添加量對(duì)植物乳桿菌AB-1苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of yeast CFS with different fermentation time and content on the production of PLA by L.plantarum AB-1

根據(jù)以上結(jié)果，在優(yōu)化MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以外源物添加15%經(jīng)40 h發(fā)酵的酵母菌E1 CFS作為CFS組，外源添加等量的YPD培養(yǎng)基作為對(duì)照組Ⅱ，探究酵母菌CFS對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4所示，從12 h起，CFS組與對(duì)照組Ⅱ的生長(zhǎng)趨勢(shì)產(chǎn)生差異，這種差異隨著時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸加大，表明酵母菌CFS可通過(guò)促進(jìn)植物乳桿菌AB-1的生長(zhǎng)提高苯乳酸的產(chǎn)量。

圖4 酵母菌CFS對(duì)植物乳桿菌AB-1生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響Fig.4 Effects of yeast CFS on the growth of L.plantarum AB-1

2.3 酵母菌CFS促進(jìn)植物乳桿菌AB-1產(chǎn)苯乳酸的機(jī)制探究

利用反相高效液相色譜檢測(cè)酵母菌CFS中的苯乳酸，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酵母菌CFS苯乳酸檢測(cè)Fig.5 Determination of phenyllactic acid in yeast CFS

結(jié)果表明，酵母菌E1、E2 CFS中均未發(fā)現(xiàn)苯乳酸在12.25 min處的特征吸收峰，說(shuō)明酵母菌自身代謝不會(huì)產(chǎn)生苯乳酸，植物乳桿菌AB-1培養(yǎng)基內(nèi)PLA含量的增加并不是外源引入導(dǎo)致的。

排除了外源引入苯乳酸的干擾，對(duì)苯乳酸的生物合成過(guò)程進(jìn)行探究。苯乳酸生物合成的核心途徑主要包括兩個(gè)步驟：1）苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨作用生成苯丙酮酸 （phenylpyruvic acid，PPA），其α-氨基通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)移到合適的受體，如α-酮戊二酸（α-KG）；2）PPA 被乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）進(jìn)一步還原成為 PLA[8]。

TACHIBANAS等通過(guò)代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌代謝產(chǎn)物中含有包括苯丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等多種氨基酸[15]，其中Phe是PLA生物合成的重要底物。因此，分別測(cè)定了酵母菌E1和E2在發(fā)酵40 h的CFS中Phe的含量，見(jiàn)圖6。

如圖6（A）所示，酵母菌E1發(fā)酵40 h的CFS中Phe的含量為379.6 mg/L，顯著高于其它3組，由圖6（C）可知，在一定濃度范圍內(nèi)，Phe的濃度與PLA的產(chǎn)量呈正相關(guān)。酵母菌CFS中確實(shí)含有Phe，且Phe有促進(jìn)植物乳桿菌AB-1產(chǎn)生PLA的作用。

圖6 酵母菌代謝產(chǎn)物成分分析及驗(yàn)證Fig.6 Analysis and validation of the yeast metabolites

房峻等[16]的研究表明，部分酵母菌具有積累α-KG的能力，累積的α-KG可以作為α-氨基的受體推動(dòng)苯丙氨酸的轉(zhuǎn)氨過(guò)程，從而加速苯乳酸的產(chǎn)生。因此，分別測(cè)定酵母菌E1和E2在發(fā)酵40 h的CFS中α-KG的含量。如圖6（B）所示，酵母菌E1發(fā)酵40 h的CFS中α-KG的含量為148.3 mg/L，顯著高于其它3組。由圖6（D）可知，在一定濃度范圍內(nèi)，α-KG的濃度與PLA的產(chǎn)量呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，酵母菌CFS中確實(shí)含有α-KG，且α-KG有促進(jìn)植物乳桿菌AB-1產(chǎn)生PLA的作用。

綜上，酵母菌CFS中本身并不含有PLA，但含有一定濃度的Phe和α-KG，兩者均是苯乳酸生物合成過(guò)程中的重要底物。當(dāng)酵母菌CFS加入到優(yōu)化MRS培養(yǎng)基后，Phe和α-KG濃度的增加促進(jìn)了苯乳酸的快速合成，提高了植物乳桿菌AB-1代謝生成苯乳酸的效率。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基組成影響植物乳桿菌AB-1生產(chǎn)苯乳酸，優(yōu)化MRS培養(yǎng)基組分有助于提高苯乳酸產(chǎn)量，當(dāng)把初始MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度由20 g/L提高至27.5 g/L，蛋白胨濃度由10 g/L提高至30 g/L時(shí)，植物乳桿菌AB-1的苯乳酸產(chǎn)量可提高27.8%。外源添加酵母菌CFS有助于提高植物乳桿菌AB-1的PLA產(chǎn)量，當(dāng)以15%的比例向優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基中添加E1酵母菌發(fā)酵40 h的CFS，PLA產(chǎn)量會(huì)大幅提高，由初始培養(yǎng)基的81.2 mg/L提高至130.2 mg/L，相較于優(yōu)化MRS培養(yǎng)基和初始MRS培養(yǎng)基分別增長(zhǎng)了25.4%和60.3%。酵母菌CFS包含較高濃度的Phe和α-KG，兩者均是苯乳酸的生物合成過(guò)程的重要底物，酵母菌CFS可能通過(guò)加快PLA的生物合成過(guò)程來(lái)促使植物乳桿菌AB-1產(chǎn)生苯乳酸。

綜上所述，本研究通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，顯著的增加了植物乳桿菌AB-1的苯乳酸產(chǎn)量，為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)苯乳酸提供了參考，也為后續(xù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)提供了借鑒。