曹穎，鄭玉娟，劉龍祥，3*，趙望鋒，張韓杰，滿強

（1.山東省黃河三角洲野生植物資源工程技術研究中心，山東 濱州 254300；2.濱州學院生物環(huán)境與工程學院，山東 濱州 254300；3.山東省黃河三角洲脆弱生態(tài)帶工程技術研究中心，山東 濱州 254300）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒釀造過程中一個重要的生物學過程，被認為是釀造優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒和部分白葡萄酒必不可少的環(huán)節(jié)[1-2]。MLF可以提高葡萄酒的微生物學穩(wěn)定性、降低酸度和苦澀感、豐富酒體結構，使其更加飽滿馥郁[3-4]。酒酒球菌（Oenococcus oeni）作為這一過程的主要承擔者，對葡萄酒釀造過程具有重要意義，尤其是葡萄原料酸度較高的地區(qū)[5-6]。

我國葡萄種質(zhì)資源豐富多樣，包括毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd.）、山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）及刺葡萄（Vitis davidii var.davidii）等[7]。 它們具有極強的抗逆性，果實中的花色苷、白藜蘆醇等物質(zhì)含量也很高，是我國特有的潛在優(yōu)質(zhì)葡萄釀酒原料。雜交品種公釀一號是用玫瑰香葡萄與山葡萄雜交育成的優(yōu)良釀酒葡萄品種，該品種具有抗性強、適宜栽培地區(qū)廣、豐產(chǎn)性能好、易管理等優(yōu)點[8]。用其釀制的紅葡萄酒酒質(zhì)優(yōu)良，富含有機酸、維生素等多種益生成分[9]。

雖然具有上述優(yōu)點，但由于其果實含酸量很高，其中公釀一號蘋果酸含量占總有機酸的37.67%，而市場上又沒有降酸能力強的優(yōu)良MLF商業(yè)菌株，因此這些品種至今沒有得到很好的利用，致使我國目前的葡萄酒主要是用國外引進的歐亞種（Vitis vinifera L.）釀造的，同質(zhì)化嚴重，缺乏特色與市場競爭力。

本項目擬從山東地區(qū)種植面積較廣的山葡萄品種公釀一號中分離蘋果酸-乳酸發(fā)酵菌株，并對其進行脅迫耐受性及發(fā)酵性能分析，從而獲得優(yōu)良蘋果酸-乳酸菌株，為后期進行脅迫應答機制及葡萄酒優(yōu)良生產(chǎn)菌株的國產(chǎn)化、差異化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 酒樣

公釀一號干紅葡萄酒：山東密水酒業(yè)有限公司。葡萄酒樣品的理化指標參照王華[10]的方法進行測量。測得各指標值為：酒精度13.68%、殘?zhí)?.6 g/L、總酸10 g/L、揮發(fā)酸 0.32 g/L、總硫 66 mg/L、游離硫 13 mg/L、干浸出物31.8 g/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

酸性番茄培養(yǎng)基（acidic tomato broth，ATB）（1 L）：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO·44H2O 0.05 g、鹽酸半胱氨酸0.5 g、番茄汁250 mL，pH4.8。配制固體培養(yǎng)基時添加1.2%（質(zhì)量分數(shù)）的瓊脂粉，篩選培養(yǎng)基需在倒平板前加入終濃度50 mg/L的放線菌酮[11]。

模擬酒培養(yǎng)基（1 L）：無水乙醇100 mL（酒精濃度10%）、葡萄汁 10 g、L-蘋果酸 3 g、D-葡萄糖 2 g、D-果糖 2g、CaCl20.13g、KCl0.45g、（NH4）2SO41g、（CH3COO）Na 2 g、KH2PO40.6 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO40.05 g、酵母浸粉4 g，pH3.8。滅菌后添加100 mL無水乙醇[12]。

1.1.3 儀器設備

JA2003C電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析分析儀器公司；SWCJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；Auegra X-30R高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；FE20K臺式酸度計：梅特勒-托利多集團；T100 PCR儀：美國Bio-Rad公司；Aglient1220高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；GenoSens1860凝膠成像儀：上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘋果酸-乳酸發(fā)酵菌株的篩選

取酒精發(fā)酵結束的公釀一號干紅葡萄酒0.1 mL，在優(yōu)選的分離培養(yǎng)基（ATB）上，采用平板涂布法分離酒酒球菌，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為5 d～7 d。

根據(jù)菌落形態(tài)挑取單菌落進行純化操作[13]。

1.2.2 酸脅迫耐受性初篩

將純化獲得的菌株接種至ATB種子培養(yǎng)基中，活化3 d～5 d，活化完成后以1%的接種比例接種至酸脅迫耐受性篩選培養(yǎng)基中（ATB，pH 3.2），28℃靜置培養(yǎng)7 d，以蒸餾水為對照，測量600 nm處吸光度值，并記錄[14]。

1.2.3 復篩

不同菌株對pH值和酒精的抗性存在著很大差異。通過研究初篩菌株對酒精、pH值的耐受性，從中選擇了吸光度較大的菌株進行酸脅迫耐受性（pH值為2.8、3.0、3.2）、乙醇脅迫耐受性（乙醇濃度為10%、12%、14%）復篩。

1.2.4 菌株鑒定

收集對數(shù)生長期的菌液1 mL，提取基因組DNA，以基因組總DNA為模板，16S rRNA基因通用引物，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增產(chǎn)物送Life Technologies公司進行測序。測序獲得序列提交至NCBI進行Blast比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并使用MEGA 5進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建[15]。

1.2.5 發(fā)酵性能分析

1.2.5.1 β-葡萄糖苷酶樣品制備及活性測定

取對數(shù)生長中期（OD600=1.0）菌液各1 mL，于9 000 r/min離心10 min收集菌體，加入0.85%NaCl溶液洗滌2次，并懸浮于0.5 mL 0.85%NaCl溶液。

β-葡萄糖苷酶活力測定方法參照Barbagallo等的方法[16-17]。

β-葡萄糖苷酶活力定義為以對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（4'-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，p-NPG）為底物，每克菌體（干質(zhì)量）每分鐘水解該底物生成對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）的量，單位為μmol/（g·min）。

標準曲線由濃度為10 μmol/L～60 μmol/L的p-NP溶液在400 nm下比色獲得。

1.2.5.2 模擬酒環(huán)境下菌株的蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力

配制模擬酒培養(yǎng)基，并使模擬酒培養(yǎng)基的酒精濃度為10%，pH3.8，以4%接種量接種于模擬酒中，分別在0、2、4、6、8 d取樣采用高效液相色譜法測定蘋果酸和乳酸含量[18-19]。參數(shù)為色譜柱：安捷倫ZORBAX SBAq色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：1% 甲醇，99% 磷酸鹽緩沖液（pH2.8），流速 1mL/min，柱溫 35℃，檢測波長210 nm，進樣量20μL，各樣品分析時間均為10 min，并重復2次。

1.2.5.3 模擬酒環(huán)境下菌株存活率

分別在 0、2、4、6、8 d 吸取待測菌株的模擬酒培養(yǎng)基進行梯度稀釋，取不同梯度的稀釋液各5 μL點在ATB平板的指定位置處，每個菌株做4個重復，28℃正置培養(yǎng)，待液滴消失后倒置培養(yǎng)，約5 d，拍照觀察結果[20]。

1.3 DNA測序數(shù)據(jù)

菌株16SrRNA基因序列提交NCBI。編號：GM1038為MT368004，GM1041為MT368005，GM1039為MT368006，GM1023為 MT368007，GM1048為 MT368008。

2 結果與分析

2.1 初篩結果

分離菌株在酸脅迫培養(yǎng)基中的生長情況見表1。

表1 分離菌株在酸脅迫培養(yǎng)基中的生長情況Table 1 The growth of isolated strains in acid stress medium

如表1所示，共從酒樣中分離出63株酸脅迫耐受性各異的 菌株。 其中，GM1023、GM1038、GM1039、GM1041和GM1048在初篩中表現(xiàn)出較好的生長性能，被選定進行復篩。

2.2 復篩結果

對初篩獲得的5個菌株進行單因素脅迫耐受分析。生長情況如圖1所示。

圖1 待測菌株在不同脅迫條件下的生長情況Fig.1 The growth of the tested strains under different stress conditions

在pH值為2.8、3.0和3.2條件下，菌株GM1023、GM1038、GM1039、GM1041 和 GM1048 具有較高的酸性脅迫耐受性，累計生物量較大的是GM1039和GM1041，與對照菌株SD-2a存在顯著差異。

復篩菌株及對照菌株的生長情況隨乙醇濃度的變化而變化，且不同菌株的生長情況也不相同。在10%乙醇濃度下，GM1041的生物量最大，是對照菌株的1.5倍，其它菌株與對照菌株之間無顯著差異。在12%乙醇濃度的條件下，各菌株的生長性能均顯著優(yōu)于對照菌株，其中GM1041的生長性能最好。在14%乙醇濃度條件下，GM1038、GM1041和GM1048的生長性能顯著優(yōu)于對照菌株，其中GM1041和GM1048較好，GM1023和GM1039與對照菌株無顯著差異。

2.3 菌種鑒定

為了對菌株進行鑒定，進行了16S rRNA基因擴增、測序、基因比對和系統(tǒng)發(fā)育分析（見圖2）。

圖2 待測菌株基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tress of the tested strains based on 16S rRNA

16S rRNA基因序列提交NCBI進行Blast分析，所有菌株與Oenococcus oeni均具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有菌株與酒酒球菌屬于同一分支。因此，5株均鑒定為Oenococcus oeni。

2.4 β-葡萄糖苷酶活性

待測菌株的β-葡萄糖苷酶活性見圖3。

在生長過程中，Oenococcus oeni代謝并產(chǎn)生糖苷酶，特別是β-葡萄糖苷酶，可以促進葡萄酒中香氣物質(zhì)的釋放，豐富香氣的濃度和復雜性[17，21]。β-葡萄糖苷酶有利于提高葡萄酒的感官質(zhì)量。因此，β-葡萄糖苷酶活性和MLF能力是篩選優(yōu)良菌株的重要指標[22]。如圖3所示，菌株GM1039的β-葡萄糖苷酶活性是對照菌株的1.6倍，菌株GM1041的β-葡萄糖苷酶活性與對照菌株無顯著差異，其它菌株的β-葡萄糖苷酶活性均低于對照菌株。

圖3 待測菌株的β-葡萄糖苷酶活性Fig.3 The β-glucosidase activity of the tested strains

2.5 降酸能力

除了β-葡萄糖苷酶的活性外，MLF對葡萄酒質(zhì)量影響最大的方面就是將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的能力，從而降低葡萄酒中的總酸[23-24]。因此，本研究測定了菌株在模擬酒中的蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力，結果見圖4。

圖4 待測菌株在模擬酒中降解蘋果酸與生成乳酸能力Fig.4 The ability of the tested strains to degrade malic acid and produce lactic acid in simulate wine

如圖4所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，模擬酒中的蘋果酸濃度逐漸降低。由第8天蘋果酸濃度數(shù)據(jù)可知，菌株GM1039和GM1041的蘋果酸消耗能力顯著優(yōu)于對照菌株。其中，GM1041降酸能力最強，第8天可以降低到0.63 g/L。模擬酒中乳酸濃度的變化規(guī)律與蘋果酸相反，隨著培養(yǎng)時間的延長，蘋果酸逐漸轉(zhuǎn)化為乳酸。培養(yǎng)至第8天時，除GM1048外，其它菌株產(chǎn)生的乳酸濃度都顯著高于對照菌株。

2.6 存活率

在MLF中Oenococcus oeni的另一個關鍵指標是存活率，MLF需要足夠的活細胞來維持其運行[25-26]。菌株的存活率如圖5所示。

圖5 待測菌株在模擬酒中活菌數(shù)變化Fig.5 The changes in the number of viable bacteria of the tested strains in simulated wine

如圖5所示，每天取各菌株5個梯度的稀釋液點平板，由生長出菌苔的最高稀釋倍數(shù)可判斷不同培養(yǎng)時間菌體濃度變化情況。所有菌株在接種后存活率都呈下降趨勢。其中菌株GM1039、GM1041和GM1048與對照菌株存活率相近，活菌數(shù)在第2天后趨于穩(wěn)定，保持在10-4稀釋度水平。

3 結論

本研究分離獲得63株細菌，其中5株為耐酸、耐乙醇菌株。通過16S rRNA基因序列分析鑒定為Oenococcus oeni。在發(fā)酵性能分析中，菌株GM1039和GM1041在模擬葡萄酒中的降酸能力顯著優(yōu)于對照菌株，在發(fā)酵過程中保持了較高的活細胞數(shù)。這些結果表明，它們將是很好的候選發(fā)酵菌株。這些分離菌株將做進一步發(fā)酵性能研究，以期用于工業(yè)生產(chǎn)。