于智慧，郭艷，周麗媛，朱迎春

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

骨是肉加工中的副產(chǎn)物，大多被拋棄或作為加工飼料的原料，占動物體質(zhì)量的15%左右，含有豐富的蛋白質(zhì)（膠原蛋白）、脂肪、礦物質(zhì)（如鈣、磷、鐵）等人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)。骨中蛋白質(zhì)和脂肪含量可與鮮肉媲美，并且其含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸[1]。因此，骨資源利用對于提高動物性食品附加值具有重要的指導(dǎo)意義。

國內(nèi)外針對動物性骨再加工利用已有許多報道。國外已率先開發(fā)出骨泥和骨蛋白粉等制品以及可溶性蛋白制品。在我國也出現(xiàn)了一批研制骨泥加工機械的單位，研制出骨頭專用成套碎骨機、骨泥磨、超微粉碎設(shè)備、超微研磨設(shè)備，并且開發(fā)出骨髓粉、骨精、鈣磷制劑和食用明膠，其主要用于食品調(diào)味劑和添加劑。近年來，國內(nèi)眾多研究者致力于通過酶解法和微生物發(fā)酵法降解骨資源，以期開發(fā)出生物態(tài)補鈣制品。

我國是世界上養(yǎng)驢最多的國家，驢的飼養(yǎng)量和屠宰量以每年11%～12%的速度遞增[2]。隨著驢肉生產(chǎn)和屠宰加工的快速發(fā)展，驢骨作為其主要副產(chǎn)物數(shù)量也在不斷增加。據(jù)報道，驢骨營養(yǎng)價值較高，富含蛋白質(zhì)、脂肪和豐富礦物質(zhì)等，具有很高的開發(fā)利用價值[3-4]。繆?？〉萚5]將新鮮驢骨經(jīng)過預(yù)處理后采用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解確定出制備驢骨多肽的最佳酶解條件。劉楚怡等[3]以驢骨粉為原料，采用風(fēng)味蛋白酶酶解制備不同分子量驢骨肽，確定具有抗骨質(zhì)疏松活性的不同分子量驢骨肽的制備方法。由于酶法水解溫和，大量骨礦化的鈣磷存在于骨渣中，對骨鈣的轉(zhuǎn)化效果僅為1/6[6-7]。且由于酶的專一性，單酶水解方法并不適用于完整的蛋白質(zhì)大分子。

為了提高底物的轉(zhuǎn)化率，本試驗根據(jù)不同蛋白酶的特定催化位點不同，采用雙酶分段水解的方法，將蛋白質(zhì)水解成更多的氨基酸和多肽，從而達(dá)到酶解蛋白質(zhì)的效果。隨后以水解度、可溶性多肽得率為評價指標(biāo)，從5種不同的蛋白酶中篩選出水解驢骨泥蛋白效果較好的兩種酶，進(jìn)行雙酶分段水解驢骨泥，通過正交試驗優(yōu)化雙酶酶解工藝，并測定其氨基酸的組成和抗氧化性能，從而為驢骨蛋白的綜合利用和深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮完整的剔肉驢骨：山西太谷縣小常驢肉廠家；酚酞、甲醛、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、牛血清蛋白、蛋白胨、牛肉膏、無水乙酸鈉、吐溫80、檸檬酸二銨：天津化學(xué)試劑一廠；復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（2 000 U/mg）：上海金穗生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（1 200 U/mg）：四川樂山井研食品有限公司；無水葡萄糖、磷酸氫二鉀、酵母粉、硫酸錳、氯化鈉、鉻黑T、三乙醇胺、鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PGJ-850強力破骨機：廊坊市惠友機械有限公司；GN-130不銹鋼骨泥磨：滎陽市恒盈建筑機械廠；LD5-2B低速離心機：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；JM-L膠體磨：溫州市龍灣永興華威機械廠；HY-2調(diào)速多用振蕩器：常州國華電器有限公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；BSA-124S-CW電子天平：上海精密科學(xué)儀器公司；ZKW-4電熱恒溫水浴鍋：常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；YE4D350189移液槍：上海求精生化試劑儀器有限公司；PB-10酸度計：瑞典Sartorius公司；WFJT200可見分光光度計：尤尼科儀器有限公司；YXQ-LS-S2立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司；L-8800氨基酸自動分析儀：日立（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 驢骨泥的制備

將驢骨洗干凈后按固液比1∶3（g/mL）加水，放入滅菌鍋中經(jīng)121℃蒸煮30 min，取出后瀝干，剔除骨頭上的碎肉，去除骨髓，加沸水煮制棄掉上層油脂，瀝干。用強力破骨機將驢骨塊破碎至直徑5 mm～10 mm的骨塊；將碎骨塊投入骨泥磨進(jìn)行磨制，制得骨泥，磨制過程中加入冰屑，使骨泥處于低溫；將制得的骨泥投入膠體磨再次磨制，得到超微粉碎的骨泥，手感細(xì)膩柔滑，冷凍貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 骨泥酶解工藝流程

冷凍骨泥→解凍→加水勻漿→加酶→調(diào)pH值→恒溫酶解→100℃滅酶15 min→冷卻→5 000 r/min離心20 min→蛋白酶解液

1.3.3 最適蛋白酶的篩選

稱取適量骨泥，按固液比為1∶2（g/mL）加入蒸餾水，在恒溫水浴中不斷攪拌，分別添加胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶，加酶量1.5%，在各自最佳酶解溫度和pH值下，酶解3 h測水解度、可溶性多肽得率，選出合適的蛋白酶。風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶的最適溫度分別為50、45、50、55、37℃，最適pH值分別為7.0、6.5、7.0、8.0、3.0。

1.3.4 雙酶添加順序的選擇

從1.3.3中選出水解度和可溶性多肽得率最高的兩種酶A和B。設(shè)定雙酶添加方式為：先加A后加B；先加B后加A；A與B同時加入。計算水解度、可溶性多肽得率，比較不同雙酶組合酶解的效果。

雙酶酶解時，先利用酶A進(jìn)行酶解，其最佳條件已有許多研究報道，本文通過預(yù)試驗也得以證實，故不再做深入分析。但是酶A酶解結(jié)束后再加入酶B進(jìn)行酶解時，由于酶解的介質(zhì)已經(jīng)發(fā)生改變（是以酶A作用之后的酶解液為基礎(chǔ)），因此需研究酶B的最適酶解條件。

本試驗以水解度、可溶性多肽得率為指標(biāo)，首先對酶B的加酶量、酶解時間、固液比進(jìn)行單因素試驗，之后采取正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝。

1.3.5 水解度的測定

采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》）[8]測定總氮含量。酶解液中游離氨基酸態(tài)氮測定采用甲醛電位滴定法[9]。水解度[10]的計算公式如下。

1.3.6 可溶性多肽得率的測定

采用三氯乙酸法結(jié)合雙縮脲法測定可溶性多肽得率[11]。樣液與10%的三氯乙酸等體積混合，4 000 r/min離心10 min，取上清液測540 nm處的吸光值?？扇苄远嚯牡寐视嬎愎饺缦隆?/p>

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

參考Pedro等[12]的方法并稍作改進(jìn)。用無水乙醇制備1×10-4mol/L的DPPH溶液，避光保存。將2 mL的待測液和2 mL的DPPH溶液加入同一試管中。搖勻后，避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度Ai。同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇溶液混合后的吸光度A0和2 mL試樣溶液與2 mL無水乙醇溶液混合后的吸光度Aj。計算公式如下。

1.3.8 羥自由基清除率的測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定羥自由基清除率[13-14]。將2 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸溶液、6 mmol/L H2O2等體積（1 mL）混合振蕩，測定在510 nm處的吸光度A0。向反應(yīng)體系中加入1 mL酶解液，搖勻后立即測定吸光度Ai。計算公式如下。

1.3.9 超氧陰離子自由基清除率的測定

采用趙濤等[15-16]的方法，略有改進(jìn)。取0.05 mol/L Tris-HCl（pH 8.2）5.0 mL ，置于 25℃水浴 20 min，加入0.5 mL蒸餾水和0.5 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻，在25℃水浴反應(yīng)5 min，用1 mL 8 mmol/L HCl溶液立即終止反應(yīng)，在299 nm處測吸光度A0，向反應(yīng)體系中加入不同濃度待測液0.5 mL，搖勻后立即測定吸光度Ai。計算公式如下。

1.3.10 總還原能力的測定

采用文獻(xiàn)[17-20]的方法并稍作改進(jìn)。取2 mL待測溶液，依次加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2 mL 1.0% K3[Fe（CN）6]溶液，放置在試管中，混合，迅速放入50℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，用蒸餾水代替空白樣品液。冰水降溫后加入2 mL 10%三氯乙酸，混勻，去除2 mL上清液，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，靜置10 min后，在700 nm下測定吸光值。

1.3.11 游離氨基酸含量的測定

采用氨基酸自動分析儀測定驢骨泥蛋白水解液中的氨基酸成分及含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗均設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Microsoft Excel 2007軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，Sigma plot 10.0繪圖軟件繪圖，并應(yīng)用statistics 8.1中Turkey HSD程序進(jìn)行顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解效果比較

圖1為不同蛋白酶酶解效果比較。

圖1 不同蛋白酶酶解效果比較Fig.1 The comparison of the hydrolysis effects by different proteases

由圖1可知，5種蛋白酶在各自最適反應(yīng)條件下，水解度差異顯著（P<0.05）。在加酶量相同的條件下，根據(jù)5種蛋白酶的酶解效果按由弱到強的順序排列為：胃蛋白酶＜木瓜蛋白酶＜胰蛋白酶＜風(fēng)味蛋白酶＜復(fù)合蛋白酶。其中風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶有較高的水解度（5.01%、5.28%）和可溶性多肽得率（5.89%、6.23%）。因此，綜合考慮酶解效果，選擇風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行下一步試驗。

2.2 雙酶添加順序?qū)γ附庑Ч挠绊?/h3>

表1為雙酶添加順序?qū)γ附庑Ч挠绊憽?/p>

由表1可知，方案2的酶解效果顯著高于方案1和方案3（P<0.05），在此條件下水解度和可溶性多肽得率分別達(dá)到（15.12±0.36）%和（14.82±0.28）%，結(jié)合圖1可知，雙酶酶解比單酶酶解驢骨泥蛋白效果要好。因此，選擇先添加風(fēng)味蛋白酶，再添加復(fù)合蛋白酶的酶解方法用于后續(xù)試驗。

表1 雙酶添加順序?qū)γ附庑Ч挠绊慣able 1 The effects of added sequence of proteases on protein hydrolysis

2.3 雙酶酶解時復(fù)合蛋白酶酶解條件優(yōu)化

基于前期單因素試驗結(jié)果，固定復(fù)合蛋白酶酶解溫度為50℃、pH7.0，以加酶量、酶解時間、固液比為因素，以水解度、可溶性多肽得率作為評價指標(biāo)設(shè)計正交試驗，正交試驗的因素與水平見表2，結(jié)果與分析見表3。

表2 正交試驗的因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

從表3可以看出，以水解度為評價指標(biāo)，影響酶解效果因素的主次關(guān)系為B>A>C，也就是固液比>酶解時間>加酶量，最優(yōu)組合是A2B1C3，即酶解時間4 h、固液比1∶2（g/mL）和加酶量2.5%。以可溶性多肽得率為評價指標(biāo)，影響酶解效果的主次因素為B>A>C，也就是固液比>酶解時間>加酶量?？扇苄远嚯牡寐首罡叩拿附夤に嚍锳1B1C3，即酶解時間3 h、固液比為1∶2（g/mL）和加酶量2.5%。

在正交設(shè)計的9組試驗中，第5組（A2B2C3）的水解度最高，達(dá)到15.56%，第4組（A2B1C2）的可溶性多肽得率最高，達(dá)到22.94%。通過驗證試驗，結(jié)果表明組合A2B1C3的水解度達(dá)到15.74%，可溶性多肽得率為20.34%；組合A1B1C3的水解度為14.50%，可溶性多肽得率為24.12%。為了得到最優(yōu)組合，選取組合A2B1C3和組合A1B1C3進(jìn)行后續(xù)抗氧化性及游離氨基酸測定試驗。

2.4 驢骨泥酶解前后游離氨基酸含量測定結(jié)果

酶解液和酶解前的驢骨泥原液中游離氨基酸的種類和含量如表4所示。

表4 酶解液中的游離氨基酸含量Table 4 The content of free amino acids of enzymatic hydrolysis solution mg/100 mL

從表4可以看出，A2B1C3組合的酶解液與酶解前的驢骨泥原液比較，氨基酸總量增加至528.35 mg/100 mL，酶解后的驢骨泥所含的游離氨基酸總量高于酶解前的游離氨基酸總量。且經(jīng)酶解后的骨泥幾乎含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，構(gòu)成膠原蛋白的重要組成氨基酸如甘氨酸和脯氨酸在酶解液中含量較高，分別為44.28 mg/100 mL和33.92 mg/100 mL，這表明酶解后的驢骨泥含有豐富的氨基酸，可作為制備氨基酸螯合物良好的氨基酸源[21]；與A1B1C3組合的酶解液相比，A2B1C3組合的酶解液中所有氨基酸的含量均較高，說明酶解時間延長至4 h時酶解效果更為理想。

2.5 驢骨泥蛋白酶解物抗氧化能力測定

2.5.1 不同濃度的驢骨泥酶解液的DPPH自由基清除率

不同濃度的驢骨泥酶解液的DPPH自由基清除率見圖2。

圖2 不同濃度酶解液DPPH自由基清除率Fig.2 The clearance rate of DPPH radical of different concentration of enzymatic solution

從圖2可以看出，與酶解前相比，同濃度下酶解液對DPPH自由基清除能力皆顯著高于酶解前；濃度在10 mg/mL～100 mg/mL時，隨著酶解液濃度的增加，對DPPH自由基清除能力增強，其中濃度在20 mg/mL～70 mg/mL，酶解液的DPPH自由基清除能力呈較緩上升趨勢。之后，兩組酶解液DPPH自由基清除率均隨著濃度的繼續(xù)升高呈直線上升趨勢，且A2B1C3組合酶解液增幅較大，當(dāng)濃度為100 mg/mL時，A2B1C3組合的酶解液的DPPH自由基清除率為71.43%。因此，驢骨泥酶解物對DPPH自由基具有較強的清除能力。

2.5.2 不同濃度的驢骨泥酶解物總還原能力的測定

不同濃度的驢骨泥酶解液的總還原能力見圖3。

由圖3可知，酶解液的總還原能力均隨濃度的升高而增大，但酶解前的總還原能力隨著濃度的增大基本呈平緩趨勢（P>0.05），且酶解液的總還原能力顯著高于酶解前。與A1B1C3組合的酶解液相比，A2B1C3組合的酶解液的總還原能力更強，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖3 不同濃度酶解液總還原能力Fig.3 The total reducing capacity of enzymatic hydrolysates at different concentrations

2.5.3 不同濃度驢骨泥酶解液的羥自由基清除率

不同濃度驢骨泥酶解液的羥自由基清除率見圖4。

圖4 不同濃度酶解液羥自由基清除率Fig.4 The clearance rate of hydroxyl radical of different concentration of enzymatic solution

從圖4中可以看出，在10 mg/mL～100 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，酶解液的羥自由基清除率顯著高于酶解前，當(dāng)濃度為100 mg/mL時，A2B1C3組合的酶解液對羥自由基清除率是酶解前的2.18倍，說明酶解液的抗氧化性有極大提高。

2.5.4 不同濃度驢骨泥酶解液的超氧陰離子自由基清除率

不同濃度驢骨泥酶解液的超氧陰離子自由基清除率見圖5。

圖5 不同濃度酶解液超氧陰離子自由基清除率Fig.5 The scavenging rate of superoxide anion radical of different concentration of enzymatic solution

由圖5可知，酶解液對超氧陰離子自由基清除能力明顯高于酶解前。A2B1C3組合酶解液的清除能力略高于A1B1C3組合酶解液，當(dāng)濃度為100 mg/mL時，A1B1C3組合酶解液和A2B1C3組合酶解液對超氧陰離子自由基清除率分別31.28%和31.65%，與酶解前相比，酶解液對超氧陰離子自由基的清除能力有所提高。

綜上所述，A2B1C3組合的酶解液具有更高的DPPH自由基清除率、總還原能力、羥自由基清除率，且游離氨基酸含量及種類豐富，因此，最優(yōu)的酶解條件為酶解時間 4 h、固液比 1∶2（g/mL）、加酶量 2.5%。

3 結(jié)論

通過驢骨泥蛋白的酶解試驗優(yōu)化，獲得最佳的雙酶復(fù)合酶解工藝：首先添加風(fēng)味蛋白酶，在50℃，pH值7.0，加酶量1.5%，固液比1∶2（g/mL）條件下酶解3 h后，然后添加復(fù)合蛋白酶，固液比為 1∶2（g/mL），加酶量2.5%，酶解時間4 h，水解度、可溶性多肽得率分別可以達(dá)到15.74%和20.34%；抗氧化試驗表明，酶解液對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有良好的清除能力，并具有較強的總還原能力。驢骨泥酶解液中含有豐富的游離氨基酸，氨基酸總量由酶解前的20.51mg/100mL增加到酶解后的528.35 mg/100 mL。結(jié)果表明，風(fēng)味蛋白酶結(jié)合復(fù)合蛋白酶雙酶復(fù)合酶解工藝可用來制備高氨基酸含量和高抗氧化性的驢骨泥酶解液。