劉東亮 馬秀嵐

中耳膽脂瘤的病理特征是異常強大的增殖和失調(diào)的凋亡。目前在增殖方面已經(jīng)基本達成共識，但在凋亡方面的觀點尚未達成一致，有學(xué)者認為膽脂瘤中促進凋亡因素起了主要作用，而另一些研究卻發(fā)現(xiàn)抗凋亡也發(fā)揮了作用(kojima,1998)。DAPI廣泛用于細胞的凋亡指數(shù)檢測和評定[1,2]，其通過藍色熒光強度反映核凋亡的情況和周期，正常細胞核染色后呈弱藍色，而凋亡小體可見近于白色的強光。故本研究利用DAPI核染色判定膽脂瘤細胞中的凋亡情況。

人類叉頭框O3(forkhead box O3,FOXO3)是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族(forkheadbox，F(xiàn)OX)的O亞族一員，參與調(diào)節(jié)細胞周期、促進凋亡、抗氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種生物學(xué)行為調(diào)控[3,4]，其廣泛表達于成人的各種組織器官中。FOXO3發(fā)揮其功能的方式主要是通過對其靶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)來完成的[5]。唯BH3域蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)作為僅含有一個BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2蛋白，通過與Bcl-2家族其他成員相互作用，形成同源或異源二聚體發(fā)揮抗凋亡或促凋亡作用[6]。本研究擬通過免疫組化、免疫熒光及Western blot方法檢測中耳膽脂瘤組織和正常皮膚中FOXO3、Bim及DAPI的表達情況，并分析它們之間的相關(guān)性，探討其在中耳膽脂瘤形成過程中對細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1中耳膽脂瘤及正常皮膚標本采集 選取2019年7～12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科確診并行手術(shù)的中耳膽脂瘤標本30例，其中，男18例，女12例；年齡16～80歲，平均55.57±18.67歲；左耳14例，右耳16例；病程2～30年，平均17.63±12.33年；術(shù)后均經(jīng)病理診斷為中耳膽脂瘤。同時回收耳甲腔成形術(shù)中廢棄及不能使用的耳后正常皮膚或皮膚碎塊15例作為對照組(術(shù)前已告知患者同意并簽署知情同意書)，其中男9例，女6例；年齡30～55歲，平均46.73±10.67歲；左耳7例，右8例；病程5～25年，平均14.56±9.83年。

1.2研究方法

1.2.1免疫組化染色檢測FOXO3、Bim表達和定位 從液氮桶取出標本立即甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，每個標本切片3張。按照SABC試劑盒說明書操作。已知陽性切片作陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。主要步驟：將石蠟切片放入60 ℃烤箱1小時，二甲苯脫蠟三次，每次10分鐘。梯度酒精水化，蒸餾水沖洗，PBS液浸泡10分鐘。3%過氧化氫去離子水室溫孵育10分鐘，PBS沖洗4次×2分鐘。采取胃蛋白酶行酶修復(fù)抗原修復(fù)20分鐘，之后PBS沖洗3次×3分鐘。滴加試劑A(封閉用山羊血清工作液)室溫孵育15分鐘，傾去勿洗。滴加適當比例的一抗，4 ℃冰箱過夜。次日取出后PBS沖洗3次,每次3分鐘，滴加試劑B(二抗)，37 ℃孵育15分鐘，PBS沖洗3次,每次3分鐘。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15分鐘，PBS沖洗3次×3分鐘。滴加立即配制的DAB顯色液，在顯微鏡下控制背景，顯色約3.5分鐘左右用水充分沖洗，蘇木素復(fù)染半分鐘，蒸餾水沖洗，自來水返藍30分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察顯色情況并在100、200及400倍下照相，400倍顯微鏡下隨機取5個不重疊視野進行陽性細胞計數(shù)，計算陽性細胞占比率。結(jié)果判定：在出現(xiàn)棕黃色顆粒的陽性細胞標準基礎(chǔ)上，綜合染色強度及陽性細胞數(shù)2個方面進行分析：①染色強度計分：沒有染色0分，微弱棕黃色1分，中等強度棕黃色2分，深棕色3分；②陽性細胞計數(shù)：每個視野計數(shù)200個細胞，計算5個視野的陽性細胞的占比率：沒有細胞著色0分，<20%細胞著色1分，21%～50%細胞著色2分，>50%細胞著色3分；③染色強度計分和陽性細胞占比計分相乘結(jié)果作為該樣本最終結(jié)果，得分為0～2分為陰性樣本(—)，≥3分者為陽性樣本(+)。每一個標本都由不同的三名技術(shù)人員計數(shù)，綜合統(tǒng)計三個報告得出結(jié)果。

1.2.2免疫熒光染色檢測Bim、DAPI的表達和定位 將上述切片取出，在切片上直接滴加少量DAPI染液，覆蓋住標本即可，避光室溫孵育10 min。玻片置于脫色搖床上的PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察保存圖像(DAPI紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍光)并用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行半定量分析。結(jié)果判讀：Bim陽性表達為綠光。DAPI染色的細胞核在紫光的激發(fā)下為藍色，正常細胞中僅有部分染色質(zhì)出現(xiàn)輕度濃縮，熒光顯微鏡下可見弱藍光，凋亡亢進的細胞核出現(xiàn)凋亡小體，可見白藍色強光，凋亡低下的細胞核染色呈深藍色。

1.2.3Western blot免疫印跡法檢測FOXO3和Bim蛋白的表達 組織塊用PBS洗滌3次，剪成小塊置于勻漿器中。徹底勻漿后轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中冰浴30 min，期間反復(fù)吹打，確保細胞完全裂解。12 000 rpm離心10 min，收集上清。干凈玻璃板灌膠與上樣，玻璃板放入卡夾，對齊擠緊以免漏膠。配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠。45 min后倒去膠上封水并用吸水紙將殘留水吸干。配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠，待剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠。加足夠的電泳液。將樣品加入電泳孔中，電泳。濃縮膠電壓75 V，分離膠用120 V。待電泳剛跑出至溴酚藍即可終止電泳。準備6張8 cm×9 cm的濾紙和一張大小適中的預(yù)先甲醇活化PVDF膜。將轉(zhuǎn)模夾子打開使黑的一面保持水平，在墊子上墊海綿及三層濾紙，小心剝下分離膠蓋在濾紙上，將膜蓋于膠上，在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡，最后蓋上另一個海綿墊。25 V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜。次日將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下5%的脫脂牛奶封閉1 h。稀釋一抗4 ℃孵育抗體3小時。用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次×5 min。加稀釋二抗室溫下孵30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次×5 min。將PVDF膜的蛋白面朝上與ECLA和ECLB混合液充分接觸，1～2 min后，去盡殘液，放入暗匣中曝光。根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件。將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料兩兩比較用卡方檢驗，計量資料比較用兩樣本t檢驗，運用Pearson檢驗進行兩兩的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1免疫組化染色結(jié)果(圖1) FOXO3在中耳膽脂瘤和正常皮膚中的細胞核及胞質(zhì)均有著色。30例膽脂瘤樣本中細胞核FOXO3陽性11例(36.7%，11/30)，15例正常皮膚中細胞核FOXO3陽性樣本13例(86.7%，13/15)，前者陽性率低于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.04，P<0.05)；30例膽脂瘤樣本細胞質(zhì)中FOXO3陽性樣本10例(30.0%，10/30)，正常皮膚細胞質(zhì)中FOXO3陽性樣本12例(80.0%，12/15)，前者陽性率低于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.72，P<0.05)。Bim著色于膽脂瘤和正常皮膚的細胞質(zhì)，30例膽脂瘤標本中有16例陽性(53.3%，16/30)，明顯低于正常皮膚組織的93.3%(14/15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.20，P<0.05)。

圖1 FOXO3和Bim免疫組化染色結(jié)果(SABC法×200) a.膽脂瘤中FOXO3染色情況，F(xiàn)OXO3在細胞核及胞質(zhì)均有著色，其中細胞核FOXO3陽性率為36.7%，細胞質(zhì)FOXO3陽性率為30.0%；b.正常皮膚中FOXO3染色情況，F(xiàn)OXO3著色在細胞核及胞質(zhì)，細胞核FOXO3陽性率為86.7%，細胞質(zhì)FOXO3陽性率為80%；c.膽脂瘤中Bim染色情況，著色于細胞質(zhì)，陽性率為53.3%；d.正常皮膚中Bim染色情況，細胞質(zhì)染色，陽性率為93.3%

2.2免疫熒光染色結(jié)果(圖2) 熒光顯微鏡下，Bim顯色在細胞質(zhì)，膽脂瘤中為暗綠色，在正常皮膚呈亮綠色；DAPI染色于細胞核，膽脂瘤中為深藍色，在正常皮膚呈亮藍色；用Image-Pro Plus 6.0 圖像軟件分析熒光值發(fā)現(xiàn)Bim在中耳膽脂瘤的熒光值(35.16±4.21)明顯弱于正常皮膚(82.51±7.34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.71,P<0.05)；DAPI在中耳膽脂瘤的熒光值(25.37±3.67)弱于正常皮膚(91.45±10.14)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.93,P<0.05)。

圖2 Bim與DAPI免疫熒光染色圖 a.Bim在膽脂瘤標本染色情況，熒光為暗綠色，著色于細胞質(zhì)；b.DAPI在膽脂瘤的染色情況，染色于細胞核，熒光深藍色；d.Bim在正常皮膚染色情況,熒光為亮綠色；e.DAPI在正常皮膚的染色，亮藍色，染色于細胞核；c.a、b的融合圖；f為d、e的融合圖

2.3Western blot檢測結(jié)果(圖3) FOXO3在膽脂瘤的相對灰度值為0.43±0.04，明顯低于正常皮膚(0.94±0.11)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.01,P<0.05)；Bim在膽脂瘤的相對灰度值(0.59±0.05)也低于正常皮膚(1.05±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.99,P<0.05)。

圖3 FOXO3和Bim在膽脂瘤和正常皮膚的表達

2.4Bim和DAPI的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，Bim和DAPI在中耳膽脂瘤中表達呈顯著正相關(guān)(r=0.501,P<0.01)，F(xiàn)OXO3和Bim的表達呈正相關(guān)(r=0.362,P<0.05)。

3 討論

細胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的有序死亡，是一個主動過程，涉及一系列基因的激活、表達和調(diào)控等。關(guān)于膽脂瘤的凋亡，目前存在兩種觀點，即凋亡加強和凋亡受抑制，表現(xiàn)在信號傳導(dǎo)因子的作用即促凋亡和抗凋亡。

贊成中耳膽脂瘤凋亡加強的學(xué)者認為，膽脂瘤之所以不是惡性腫瘤就在于不僅增殖異常，同時凋亡也增強，這樣維持膽脂瘤不會惡性生長。Park等[7]發(fā)現(xiàn)中耳膽脂瘤中腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)劑(TWEAK)通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)表達起到促細胞凋亡的作用。Zhang等[8]證明微小RNA let-7a通過下調(diào)微小RNA21促進G0/G1期細胞周期停滯來誘導(dǎo)膽脂瘤細胞凋亡。而另一些研究卻發(fā)現(xiàn)抑制凋亡的信號因子在中耳膽脂瘤中出現(xiàn)或者提高了，如：Kim等[9]比較中耳膽脂瘤和耳后皮膚中甘菊酯gankyrin蛋白、抑癌基因p53蛋白和核蛋白Ki-67表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gankyrin表達上調(diào)抑制了凋亡；Szczepanski等[10]研究高遷移率族蛋白HMGB1對人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaTs)增殖、遷移和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)HMGB1阻止HaCaT細胞凋亡，促進其形成膽脂瘤細胞。

本研究通過DAPI染色，發(fā)現(xiàn)中耳膽脂瘤細胞總體呈現(xiàn)凋亡被抑制的狀態(tài)，表現(xiàn)為膽脂瘤中DAPI呈深藍色，熒光值明顯弱于正常皮膚，所以認為膽脂瘤總體表現(xiàn)為抑制凋亡的情況；且膽脂瘤中DAPI的減弱程度與Bim呈顯著的正相關(guān)，所以考慮膽脂瘤的凋亡受抑制與Bim通路相關(guān)。

FOXO3主要作用為抑制細胞生長、促凋亡、抗氧化應(yīng)激等[3,4]。FOXO3蛋白活性主要受亞細胞的定位影響[11]，作為轉(zhuǎn)錄因子，在細胞核的FOXO3才能發(fā)揮作用。而蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)可磷酸化FOXO3，磷酸化的FOXO3與DNA親和力下降，同時與蛋白14-3-3結(jié)合，移出胞核轉(zhuǎn)到胞質(zhì)被泛素化降解，從而失去轉(zhuǎn)錄作用[12]。文中結(jié)果顯示，膽脂瘤中細胞核、細胞質(zhì)FOXO3的表達均低于正常皮膚。核FOXO3主要負責凋亡的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)下游的Bim[13]與其關(guān)系最為密切。

Bim屬于B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族中的一個亞族，即僅含有一個BH結(jié)構(gòu)域且促凋亡的BH-3亞族[14]，被稱為“唯BH3域蛋白”，在多種疾病中都表現(xiàn)異常，如乳腺癌[15]、前列腺癌[16]以及非小細胞肺癌細胞[17]等，是近年來研究較多的促凋亡蛋白。Bim主要在胞質(zhì)，確切的說在線粒體周圍，通過同源結(jié)構(gòu)域直接或間接的方式激活同屬Bcl-2家族的Bax(Bcl-2-associated X proten)蛋白和Bak(Bcl-2 homologous antago-nist/killer)蛋白。激活的Bax/Bak插入線粒體外膜，引起膜通透性改變，釋放細胞色素C(cyt C)，后者通過和接頭蛋白Apaf1發(fā)生寡聚化而與半胱天冬氨酸蛋白酶9(caspases-9)形成凋亡小體，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡[18]。本研究顯示，Bim在膽脂瘤中的表達明顯低于正常皮膚，且與FOXO3的低表達呈正相關(guān)，同時也與DAPI的減弱呈正相關(guān)。再結(jié)合之前的研究[19]發(fā)現(xiàn)膽脂瘤中磷酸化的AKT(P-AKT)表達增加，所以推測，在中耳膽脂瘤的形成過程中，P-AKT的增加導(dǎo)致細胞核FOXO3因被磷酸化后移入胞質(zhì)而減少，出核的FOXO3又容易被降解，所以膽脂瘤細胞核和細胞質(zhì)中的FOXO3都比正常細胞少。而核FOXO3的減少導(dǎo)致Bim轉(zhuǎn)錄水平下降，Bim無法達到正常皮膚中的水平，則難以激活Bax/Bak誘發(fā)細胞凋亡，所以膽脂瘤中DAPI熒光也會變?nèi)酢＞C上所述，F(xiàn)OXO3/Bim通路對中耳膽脂瘤起到了抑制凋亡的作用。