司華哲 王金銘 馮培祥 張新宇 南韋肖 姜桂苗 趙付偉 李光玉 劉晗璐*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118； 3.國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，東阿252201)

近年來(lái)，毛驢役用價(jià)值逐漸降低，但消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)驢皮、驢肉和驢奶的需求不斷增加，體軀高大、體質(zhì)堅(jiān)實(shí)、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良性狀的德州驢[1]逐漸成為了主要飼養(yǎng)的毛驢品種，在全國(guó)很多地方被廣泛養(yǎng)殖[2]。隨著市場(chǎng)需求的增加，驢的養(yǎng)殖模式已由庭院式養(yǎng)殖逐漸過(guò)渡為標(biāo)準(zhǔn)化、工廠化養(yǎng)殖，但與傳統(tǒng)養(yǎng)殖相比，規(guī)?；B(yǎng)殖加大了驢感染性或傳染性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此飼養(yǎng)管理對(duì)驢駒工廠化養(yǎng)殖尤為重要。有報(bào)道，驢駒腹瀉的發(fā)病率可達(dá)到23.1%[4]，且常規(guī)的抗生素對(duì)驢駒腹瀉治療效果甚微[5]。因此，從改善驢駒腸道微生態(tài)平衡角度，探討外源添加益生菌對(duì)提高驢駒免疫力、改善驢駒腸道健康意義重大。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)廣泛存在于動(dòng)物消化道中[6]，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和免疫力，其還可代謝生成抑菌物質(zhì)如有機(jī)酸、細(xì)菌素和過(guò)氧化氫等[7]，對(duì)維持腸道健康效果良好[8]。研究發(fā)現(xiàn)，豬、雞飼糧中添加植物乳桿菌可改善生長(zhǎng)性能，提高飼料利用率[9-10]。此外，適量的植物乳桿菌可緩解山羊和肉兔腹瀉，并可提高免疫力[11-12]。楊帆[13]和李曉斌[14]研究發(fā)現(xiàn)，在馬駒飼糧中添加枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌復(fù)合菌劑可促進(jìn)馬駒體增重增加，降低糞便中纖維的含量并增加其血漿中細(xì)胞因子含量。然而，植物乳桿菌在驢上尚未有研究。鑒于此，本試驗(yàn)擬在飼糧中添加不同水平的植物乳桿菌，研究其對(duì)德州驢駒生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化指標(biāo)的影響，以期為植物乳桿菌在驢駒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種制備

試驗(yàn)所用植物乳桿菌是本實(shí)驗(yàn)室前期從動(dòng)物腸道中分離鑒定保藏的。使用MRS培養(yǎng)基復(fù)蘇并穩(wěn)定傳代連續(xù)培養(yǎng)，對(duì)菌液每隔2 h進(jìn)行1次菌落計(jì)數(shù)并測(cè)定吸光度(OD)值，制作生長(zhǎng)曲線。每日使用的試驗(yàn)菌種均培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD值后參照生長(zhǎng)曲線計(jì)算活菌數(shù)，加無(wú)菌水稀釋制成濃度為1×108CFU/mL的植物乳桿菌母液活菌制劑。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年4月5日至2019年5月25日在山東省聊城市東阿縣黑毛驢繁育中心進(jìn)行，試驗(yàn)樣品的檢測(cè)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所進(jìn)行。

選取體況良好的雄性驢駒48頭，平均體重(109.57±15.69) kg，隨機(jī)分為4組，包括1個(gè)為對(duì)照組(Ⅰ組)和3個(gè)試驗(yàn)組(Ⅱ～Ⅳ組)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在精料中添加1×108、1×109、1×1010CFU/g植物乳桿菌的試驗(yàn)飼糧。預(yù)試期5 d，正試期45 d。每頭每天06：00和16：00分2次飼喂，先精后粗，精料飼喂量固定為初始體重的1.3%。填飼精料時(shí)，各試驗(yàn)組按照設(shè)定的添加量將植物乳桿菌母液活菌制劑加無(wú)菌水稀釋定容至100 mL，使用噴壺均勻噴灑于精料上，對(duì)照組噴灑等量無(wú)菌水。粗料自由采食，全天自由飲水。每天對(duì)驢的精料和粗料投食量以及剩料量進(jìn)行記錄。精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，粗料為豆秸，其營(yíng)養(yǎng)水平：粗蛋白質(zhì)(CP)含量為8.75%，粗脂肪(EE)含量為1.17%，有機(jī)物(OM)含量為90.03%，中性洗滌纖維(NDF)含量為72.75%，酸性洗滌纖維(ADF)含量為54.63%，鈣(Ca)含量為1.26%，磷(P)含量為0.17%，消化能(DE)水平為7.61 MJ/kg[消化能參照NRC(2007)[16]馬營(yíng)養(yǎng)需要計(jì)算]。

表1 精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

消化試驗(yàn)于2019年5月17日至2019年5月20日進(jìn)行，連續(xù)3 d于地面收集排出的新鮮驢糞用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定。收集糞樣時(shí)嚴(yán)格避免驢毛、沙粒等污染，以免影響到測(cè)定結(jié)果的精確度。按收集驢糞鮮重的5%加入10%硫酸溶液進(jìn)行固氮，先在80 ℃下殺菌2 h，然后在65 ℃烘24～48 h至恒重，用于干物質(zhì)(DM)含量的測(cè)定。粉碎過(guò)40目篩后進(jìn)行粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的測(cè)定。正試期第45天，晨飼前麻醉動(dòng)物，頸靜脈采血10 mL，4 ℃下3 500×g離心10 min，收集上清，保存于-20 ℃用于后續(xù)血清生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

正試期第1天和第45天晨飼前稱量動(dòng)物體重，計(jì)算總增重和平均日增重(ADG)；每天對(duì)驢精料和粗料的投料量和剩料量進(jìn)行記錄，用于計(jì)算干物質(zhì)采食量(DMI)；根據(jù)ADG和DMI計(jì)算料重比(F/G)。

1.4.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定

精料、粗料及糞樣的DM含量采用GB/T 6435—2014方法測(cè)定，CP含量參照GB/T 6432—2018采用凱氏定氮法測(cè)定，EE含量參照GB/T 6433—2006采用索氏抽提法測(cè)定，NDF和ADF含量參照GB/T 20806—2006采用范氏(Van Soest)纖維分析法測(cè)定，鹽酸不溶灰分含量參照GB/T 23742—2009方法測(cè)定。以鹽酸不溶灰為內(nèi)源指示劑測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，計(jì)算公式如下：

某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100-100× [飼糧中鹽酸不溶灰分含量(%)/ 糞樣中鹽酸不溶灰分含量(%)]× [糞樣中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量(%)/ 飼糧中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量(%)]。

1.4.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

血清葡萄糖(glucose，GLU)、尿素(urea，UREA)、甘油三酯(triglycerides，TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)含量以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)活性均使用Beckman AU 480全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒采購(gòu)于中生北控生物科技有限公司。血清球蛋白(globulin，GLOB)含量采用總蛋白與白蛋白含量的差值表示。血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量均使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2013整理后采用SPSS 22.0中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用LSD法進(jìn)行組間的多重比較，以P<0.05為差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒生長(zhǎng)性能的影響

飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)表2。各試驗(yàn)組DMI均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。飼糧中添加1×109CFU/kg植物乳桿菌的試驗(yàn)組的料重比顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，飼糧中添加1×109CFU/kg植物乳桿菌顯著提高了DM、CP和ADF的表觀消化率(P<0.05)；飼糧中添加1×1010CFU/kg植物乳桿菌顯著提高了DM、CP、EE、NDF和ADF的表觀消化率(P<0.05)。

表3 飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.3 飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒血清生化指標(biāo)的影響

飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒血清生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表4。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組驢駒血清ALT和ALP活性均顯著降低(P<0.05)，而血清IgA含量均顯著升高(P<0.05)；同時(shí)，飼糧中添加1×1010CFU/kg植物乳桿菌顯著提高了驢駒血清TP含量(P<0.05)。

表4 飼糧中添加植物乳桿菌對(duì)德州驢駒血清生化指標(biāo)的影響

3 討 論

本試驗(yàn)中，飼糧中梯度添加的植物乳桿菌在德州驢駒末重和增重上僅表現(xiàn)出增加趨勢(shì)，這與楊帆[13]在馬駒上的研究結(jié)果相似。楊帆[13]研究在試驗(yàn)第1～60天時(shí)增重并無(wú)顯著差異，但在第61～90天增重有顯著增長(zhǎng)，這說(shuō)明植物乳桿菌的促生長(zhǎng)效果是一種累積效應(yīng)，應(yīng)長(zhǎng)期飼喂才可獲得較好的效果。因本試驗(yàn)周期(45 d)較短，動(dòng)物的末重和增重并無(wú)顯著差異，但數(shù)值上有增加趨勢(shì)，在后續(xù)的試驗(yàn)中，應(yīng)延長(zhǎng)試驗(yàn)時(shí)間以檢測(cè)是否具有更好的長(zhǎng)期促生長(zhǎng)效果。此外，飼糧中添加植物乳桿菌顯著地提高了德州驢駒的DMI，其中添加1×109CFU/kg植物乳桿菌顯著地降低了德州驢駒的料重比，這些結(jié)果與前人在馬駒上添加植物乳桿菌對(duì)所得結(jié)果[13-14]是一致的。Jaquette等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加嗜酸乳桿菌可顯著提高奶牛采食量。驢駒采食量的增加對(duì)其增重的提高有一定的促進(jìn)作用。

飼糧中添加植物乳桿菌提高了德州驢駒對(duì)DM、EE、CP、NDF和ADF的表觀消化率，消化率的升高會(huì)提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用程度。Goachet等[17]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌的添加會(huì)提高馬對(duì)NDF和ADF的表觀消化率。此外，張永根等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加植物乳桿菌顯著提高了奶牛對(duì)CP和ADF的表觀消化率。王志成等[19]和龐清剛等[20]研究均發(fā)現(xiàn)仔豬飼糧中添加植物乳桿菌可以提高其對(duì)EE和CP的表觀消化率。推測(cè)原因在于植物乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，可降低腸道pH，利于提高消化酶活性[21]。此外，研究認(rèn)為，植物乳桿菌的添加可提高奶牛腸道中擬桿菌門的豐度[18]。擬桿菌門中的細(xì)菌多數(shù)與蛋白質(zhì)、淀粉和纖維降解相關(guān)，有助于提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化水平[22]。本試驗(yàn)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的提高是否是由于改善了微生物菌群，仍需對(duì)驢駒腸道微生物組成進(jìn)行進(jìn)一步研究。

臨床上，血清ALP和ALT活性多用來(lái)反映動(dòng)物的肝臟功能[23]，其活性的增加可能與肝臟損傷有關(guān)[24]。本試驗(yàn)中，植物乳桿菌的添加顯著降低了驢駒血清ALP和ALT活性，這說(shuō)明植物乳桿菌對(duì)德州驢駒肝臟功能具有一定的保護(hù)作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ALT還是動(dòng)物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，與氨基酸的利用相關(guān)[25]。血清TP含量可反映動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的利用與代謝情況，血清TP含量增加，說(shuō)明動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化能力增強(qiáng)[26]。本試驗(yàn)中，隨著植物乳桿菌添加量的增加，驢駒的CP表觀消化率逐漸提高，血清TP含量也逐漸提高，說(shuō)明植物乳桿菌增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的消化。此外，乳酸菌在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面具有重要作用[27-28]。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組驢駒的血清IgA含量均較對(duì)照組顯著提高，這與前人在仔豬[29]和肉雞[30]上的研究結(jié)果是一致的。IgA的分泌可以減少致病性微生物在腸道黏膜表面的附著，維持腸道內(nèi)菌群的平衡[31]。乳酸菌的代謝物能激活Th2細(xì)胞并產(chǎn)生大量的白細(xì)胞介素-5，而白細(xì)胞介素-5是有效的IgA產(chǎn)生因子[32]。因此，植物乳桿菌的添加對(duì)驢駒腸道有害微生物的定植可能存在一定的抑制作用，但仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)確定。

4 結(jié) 論

由此可見(jiàn)，飼糧中添加植物乳桿菌可提高德州驢駒的生長(zhǎng)性能以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，并可改善其肝臟功能，提高免疫力。綜合來(lái)看，以1×109CFU/kg植物乳桿菌的作用效果較好。