繆云鋒，周 丹，董 彬，趙宏波

（1.浙江農林大學 浙江省園林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 南方園林植物種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，浙江 杭州 311300；3.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300）

NAC(NAM-ATAF1/2-CUC2)是植物中最大的轉錄因子家族之一，成員眾多，功能多樣[1]。NAC轉錄因子參與植物多個生物學過程，如植物莖尖分生組織的形成[2]、植物次生生長[3]、組織愈合過程中的細胞增殖[4]、生物和非生物脅迫響應[5?6]、植物開花時間調節(jié)[7?8]、葉片和花瓣衰老[9]和果實成熟時顏色變化等[10]。花瓣細胞的伸長和擴展也受到NAC轉錄因子的調控。花瓣的擴展是引起植物花開放的重要原因[11?13]，主要受花瓣細胞的膨壓變化、細胞壁代謝變化等影響[14]。研究發(fā)現(xiàn)：NAC轉錄因子NAP可能通過抑制擬南芥Arabidopsisthaliana花瓣細胞擴張而影響花器官生長，且在花發(fā)育細胞分裂向細胞擴展過渡階段發(fā)揮重要作用[15]。RhNAC3可以作為上游調控因子結合具有調節(jié)滲透壓功能的基因從而影響月季Rosahybrida花瓣細胞擴張[16]。桂花Osmanthusfragrans是中國傳統(tǒng)的十大名花之一，花是其最重要的觀賞器官。桂花花的開放受到溫度、濕度等環(huán)境因子的影響，其具體的分子機制至今尚未闡明。本研究通過桂花NAC家族基因鑒定和篩選，預測它們的理化性質，運用熒光定量PCR分析花開放進程中的表達模式，篩選出參與桂花花開放調控的關鍵NAC轉錄因子成員，為明確其在花開放中的功能作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以桂花品種‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhonggui’盆栽植株為材料，種植于浙江農林大學桂花資源圃。選取株齡相同、生長一致的健康植株，分別于起始期(S1)以及花開放不同階段：圓珠期(S2)、頂殼期(S3)、鈴梗期(S4)、初開期(S5)、盛花期(S6)進行取樣[17]。每個時期樣品采集3份，取樣時間均為10:00，液氮速凍后儲藏于?80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 桂花OfNAC轉錄因子的鑒定及理化性質分析 本研究從已構建的桂花‘堰虹桂’轉錄組數(shù)據庫[18]中對NAC轉錄因子進一步進行NCBI-Blast(http://www.ncbi.nLm.nih.gov/BLAST/)比對分析。通過PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)以及Pfam(https://pfam.xfam.org/)查詢候選基因中的NAC的結構域，并通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行保守功能域預測，利用TBtools工具進行桂花NAC保守結構域可視化分析，TBtools-ORF finder分析開放閱讀框[19]，并通過NCBI-Blast獲得開放閱讀框完整的桂花OfNAC序列。運用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預測編碼蛋白質分子量、理論電點、酸堿性等。

1.2.2 桂花OfNAC轉錄因子結構和亞細胞定位預測分析 用DNAMAN對已篩選的桂花OfNAC轉錄因子氨基酸序列進行比對，分析其保守亞結構域；在線分析軟件MEME 5.1.0分析NAC的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme)，對桂花OfNAC蛋白質二級結構以及跨膜結構分別采用在線軟件SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-sopma.html)和 TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行分析。用在線分析軟件 Wolfp sort Genscript(https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)進行亞細胞定位預測。

1.2.3 桂花OfNAC轉錄因子系統(tǒng)進化樹構建 從 PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)中獲取擬南芥、水稻Oryzasativa的NAC序列，使用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰近法(neighborjoining)，1 000 次 Bootstrap 抽樣。

1.2.4 桂花OfNAC轉錄因子表達分析 RNA 提取采用 UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit試劑盒(諾禾致源公司，中國天津)，方法參照說明書。使用核酸分析儀(IMPLEN公司，德國)對RNA的純度與濃度進行檢測，并用質量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。依據說明書使用 PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time(TaKaRa，中國大連)試劑盒對桂花不同花開放時期的cDNA進行合成。利用Primer Premier 5.0對22個OfNAC基因進行定量特異性引物設計，桂花OfACT作為內參基因[20]，引物序列如表 1 所示。熒光定量反應體系如下：SYBR Premix ExTaq10 μL，cDNA 2 μL，上游引物和下游引物 (10 μmol·L?1)各 8 μL，雙蒸水 (ddH2O)補足至 20 μL，每個樣品設置3次生物學重復。反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復性30 s，共40個循環(huán)；然后以 95 ℃ 持續(xù) 5 s，60 ℃ 持續(xù) 1 min，95 ℃ 持續(xù) 15 s作為溶解曲線分析程序。循環(huán)閾值由 Light Cycler 480軟件自動計算。最后根據2???Ct法計算目的基因的相對表達量。

表 1 桂花 OfNAC轉錄因子 RT-PCR 特異性引物Table 1 Specific primers for RT-PCR of OfNAC in O.fragrans

2 結果分析

2.1 桂花OfNAC轉錄因子鑒定及理化性質分析

通過對桂花‘堰虹桂’轉錄組數(shù)據分析，并結合NCBI-Blast篩選，對其中22個桂花OfNAC基因進行分析。結果顯示：它們均含有NAC家族蛋白特有的 NAM保守功能域 (圖 1)。通過 ExPASy對22條桂花OfNAC轉錄因子進行理化性質分析(表2)，結果表明：22條桂花OfNAC基因的氨基酸(OfNAC104～OfNAC91)長度為186～609個；蛋白質(OfNAC104～OfNAC17)相 對分子量為 21 498.77～68 408.12；等電點為 4.59～9.33，其中 OfNAC100-1、OfNAC73、OfNAC56、OfNAC72-1、OfNAC72-2、OfNAC29-1、OfNAC29-2、OfNAC32等8個蛋白質等電點大于7，偏堿性，其余14個OfNAC等電點小于7，偏酸性。OfNAC的不穩(wěn)定系數(shù)為29.27～52.83，OfNAC53、OfNAC73、OfNAC56、OfNAC92、OfNAC29-2等5個蛋白質不穩(wěn)定系數(shù)低于40，為穩(wěn)定蛋白質，其余17個不穩(wěn)定系數(shù)均高于40，為不穩(wěn)定蛋白質。脂溶性指數(shù)為53.37(OfNAC71)～77.70(OfNAC17-X2)，總平均疏水值為?0.816～?0.530，蛋白質的平均疏水指數(shù)均小于0，表明OfNAC均為親水性蛋白質(表2)。

圖 1 桂花 NAC 的 NAM 保守功能域分析Figure 1 NAM conserved functional domain about NAC

表 2 桂花 OfNAC 蛋白質理化性質及二級結構分析Table 2 Physicochemical properties and secondary structure analysis of OfNAC of O.fragrans

2.2 桂花OfNAC轉錄因子結構及亞細胞定位分析

使用DNAMAN軟件對桂花OfNAC轉錄因子的氨基酸序列進行比對，結果顯示(圖2)：22個OfNAC的氨基酸序列均具有保守的亞結構域(A～E)。對這5個亞結構域進行分析發(fā)現(xiàn)：A區(qū)較為保守的氨基酸是甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)；B區(qū)較為保守的氨基酸是脯氨酸(P)；C區(qū)較為保守的氨基酸是苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、甘氨酸(G)；D區(qū)較為保守的氨基酸是甘氨酸(G)、賴氨酸(K)、色氨酸(W)；E區(qū)沒有完全穩(wěn)定的氨基酸。各保守亞域的保守性由強到弱依次為C、A、D、B、E。對所有OfNAC的氨基酸序列進行保守基序分析發(fā)現(xiàn)(圖3)：大多數(shù)OfNAC均含有較保守的元件，除OfNAC73只有2個保守元件(元件1、元件2)外，其余OfNAC均含有4個保守元件(元件1、元件3、元件4、元件5)。另外，22條OfNAC轉錄因子中元件7、元件9和元件10出現(xiàn)在一些OfNAC蛋白質的C端，且對應的序列親緣關系較近。桂花OfNAC蛋白質二級結構分析表明：OfNAC蛋白質的二級結構包括α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲4種結構，且不同結構占比從大到小依次表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-折疊(表3)。OfNAC32的無規(guī)則卷曲占比最高，為67.30%。此外，OfNAC73、OfNAC92、OfNAC29-2結構中α-螺旋占比均小于延伸鏈?？缒そY構預測分析表明(圖4)：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9均在C端有1個跨膜結構。亞細胞定位預測分析表明：OfNAC53定位于內質網，OfNAC50-X2和OfNAC50定位于葉綠體，其余OfNAC蛋白質均定位在細胞核中。

圖 2 OfNAC 轉錄因子氨基酸序列比對Figure 2 Sequence alignment of OfNAC transcription factor

圖 3 桂花OfNAC轉錄因子進化分析及保守基序分析Figure 3 Evolution analysis of 22 OfNAC transcription factors and analysis of conserved motif

表 3 桂花 OfNAC 蛋白質理化性質及二級結構分析Table 3 Secondary structure analysis of OfNAC of O.fragrans

圖 4 桂花 OfNAC 蛋白質跨膜結構預測Figure 4 Transmembrane structure prediction related to OfNAC protein

2.3 桂花 OfNAC轉錄因子系統(tǒng)進化樹

為了進一步研究OfNAC的進化關系，對桂花、擬南芥和水稻的NAC蛋白構建系統(tǒng)進化樹。結果表明：22個桂花OfNAC與擬南芥和水稻的NAC蛋白質共劃分為11個亞族(圖5)，除a、b、c、e、h亞族外，其他亞族均有OfNAC分布。其中i亞族桂花NAC蛋白質較多，有8個OfNAC蛋白質。

圖 5 桂花 OfNAC 與擬南芥、水稻的系統(tǒng)進化樹Figure 5 Phylogenetic tree of OfNAC, A.thaliana and O.sativa

2.4 桂花OfNAC轉錄因子在不同花開放時期的表達分析

為了研究OfNAC在桂花花開放進程中的表達模式，對其進行熒光定量表達分析(圖6)。OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相對表達量在鈴梗期(S4)出現(xiàn)表達高峰，在此之后相對表達量大幅度降低，其中OfNAC43只在鈴梗期(S4)相對表達量最高，其余時期相對表達量很低；OfNAC56從鈴梗期開始呈現(xiàn)上升趨勢，并在盛花期(S6)到達頂峰；OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22從起始期(S1)緩慢上升，在頂殼期 (S3)到達最高，隨后急劇下降；OfNAC29-2在圓珠期(S2)相對表達量達到最大，之后在鈴梗期(S4)相對表達達到最低。OfNAC在花開放不同階段的表達情況說明：OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2可能參與花開放的調控，其中又以OfNAC43和OfNAC29-2關聯(lián)最為緊密。

圖 6 22個 OfNAC 基因在不同花開放時期的表達結果Figure 6 Expression results of 22 OfNAC genes in different flower opening periods

OfNAC50-X2、OfNAC50、OfNAC17-X2整體呈現(xiàn)上升趨勢，并在初開期(S5)達到最高；OfNAC100-1、OfNAC92、OfNAC72-1、OfNAC91、OfNTM1-9、OfNAC53在起始期(S1)表達量較高，整體呈下降趨勢；OfNAC104、OfNAC32、OfNAC2、OfNAC17、OfNAC72-2均呈現(xiàn)先下調后上升的表達趨勢，到盛花期(S6)相對表達量較高。這說明，這些基因成員可能不參與桂花花開放的調控。

3 討論

NAC轉錄因子最初在矮牽牛Petuniahybrida中發(fā)現(xiàn)[21]。在模式植物擬南芥、水稻以及園藝作物中的研究較多。在擬南芥、水稻、黃瓜Cucumissativus、紫花苜蓿Medicagosativa中分別有151、117、91、113個NAC基因被鑒定[22?24]。目前關于桂花OfNAC轉錄因子的報道較少。通過桂花OfNAC轉錄因子的鑒定與分析，可為進一步了解桂花OfNAC的生物學功能及其在花開放過程中的作用奠定基礎。

本研究通過轉錄組測序鑒定出22條開放閱讀框完整的OfNAC轉錄因子，對它們進行跨膜結構預測發(fā)現(xiàn)：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9這5個轉錄因子均在C端有1個跨膜結構，推測它們可能是NAC膜結合轉錄因子。大多數(shù)OfNAC蛋白質預測定位在細胞核中的可能性較高，因此推測，OfNAC轉錄因子可能大多依舊在細胞核內發(fā)揮功能。目前，已經在模式植物中發(fā)現(xiàn)NAC膜結合轉錄因子，如擬南芥和水稻NAC基因組中已發(fā)現(xiàn)分別有18和6個膜結合NAC轉錄因子[25?26]，其中擬南芥膜結合轉錄因子NTM1調節(jié)細胞分裂素信號傳導而參與細胞分裂；NTL8調節(jié)擬南芥開花時間，過表達轉基因植株出現(xiàn)晚花現(xiàn)象；ANAC089被確定為另一個膜結合轉錄因子，也有調控擬南芥開花時間的功能[27?28]。由此推測，桂花OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9可能也具有調控開花時間的功能。

桂花22個OfNAC與擬南芥和水稻NAC蛋白質共同劃分為11個亞族。根據親緣關系推測相關OfNAC基因的功能，如OfNAC100-1、OfNAC100-2與擬南芥At5G6140.1、At5G7680.1、At5G39610.1、At3G29035.1親緣性較高，其中At5G39610.1(ANAC92/ATNAC2)存在于部分或完全開放的花的花器官中，且參與葉和花的衰老過程[29]。在月季中，RhNAC100是At5G39610.1(ANAC92/ATNAC2)的同源基因，乙烯通過微調microRNA164-RhNAC100模塊來調節(jié)細胞的擴張從而影響月季花瓣的擴展[30]，OfNAC100-1和OfNAC100-2與擬南芥At5G39610.1親緣關系較近，所以推測OfNAC100-1與OfNAC100-2可能有調節(jié)花瓣擴展的相關功能。OfNTM1-9與At1G33060.1同源性較高，且At1G33060.1是膜結合轉錄因子，在擬南芥各個器官均有表達，影響葉片衰老[25]，推測OfNTM1-9可能作為NAC膜結合轉錄因子參與細胞衰老。

花開放的主要原因是花瓣細胞的擴展[11?13]，對OfNAC基因在桂花花開放時期的熒光定量表達分析表明：OfNAC在桂花花開放過程中發(fā)揮重要作用，且不同的OfNAC在此過程中表達模式有差異。OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22在頂殼期相對表達到達最大。羅云等[31]發(fā)現(xiàn)：OfEXPA2和OfEXLA1在桂花花開放的頂殼期相對表達急劇增加并到達頂峰，推測此時期的高豐度表達是后續(xù)花開放的基礎。OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22與OfEXPA2和OfEXLA1表達模式相似，推測它們參與花開放進程。OfEXPA4在花芽萌發(fā)期至圓珠期表達量較低，而頂殼期開始急劇上升，鈴梗期表達量達到最大。羅云等[31]推測：OfEXPA4是參與花瓣擴展的關鍵基因，OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相對表達量也在鈴梗期出現(xiàn)峰值，推測它們亦作為關鍵基因參與桂花花瓣擴展。對月季的研究發(fā)現(xiàn)：RhNAC2和RhEXPA4參與月季花瓣細胞擴展，且RhEXPA4的表達可能受到RhNAC2的調控[32]，擬南芥中NAC25和NAC1L被確定是EXPA2(EXPANSIN2)的上游調控因子[33]。以此推測，NAC轉錄因子可能與EXP的啟動子結合，是EXP的上游調控因子，則OfNAC29-2在圓珠期相對表達最大，可能是作為OfEXPA2和OfEXLA1調控因子調節(jié)OfEXP影響花瓣細胞擴張從而為后續(xù)花瓣展開奠定基礎，所以OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2 可能是參與桂花花開放的關鍵基因。由于OfNAC43、OfNAC29-2相對表達差異明顯，推測它們與花開放關系更為緊密，但這些關鍵基因在桂花開花中的具體作用還需要進一步研究。

4 結論

本研究從桂花品種‘堰虹桂’轉錄組數(shù)據中篩選得到22條OfNAC序列，生物信息學分析結果表明：22條OfNAC轉錄因子氨基酸序列含有5個保守的亞結構域(A～E)，其保守性由強到弱依次為C、A、D、B、E；亞細胞定位及跨膜結構預測表明：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9是膜結合轉錄因子，且大多數(shù)OfNAC定位在細胞核。實時熒光定量PCR分析表明：在桂花花開放進程中，22個OfNAC基因表達模式不同，其中OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相對表達量在鈴梗期(S4)達到頂峰，在此之后相對表達降低。OfNAC43在鈴梗期驟然升高，并且在此時期相對表達最大；OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22從起始期呈緩慢上升趨勢，在頂殼期到達最高，隨后整體呈現(xiàn)下降趨勢；OfNAC29-2在圓珠期相對表達量陡然上升，在鈴梗期相對表達最低，推測OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2等成員極有可能參與調控桂花的花開放。