王璐 劉勤 張紅宇 王瑋

【摘 要】 目的：從與注射用燈盞花素功能主治相關(guān)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法中篩選合適的生物活性測(cè)定指標(biāo)。方法：選取不同規(guī)格不同批號(hào)的注射用燈盞花素從與其功能主治相關(guān)的小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)、小鼠凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)中篩選1～2種設(shè)計(jì)合理，操作簡(jiǎn)便，指標(biāo)明確，靈敏度高，重現(xiàn)性好的方法作為其生物活性測(cè)定指標(biāo)。結(jié)果：不同批號(hào)的注射用燈盞花素生物活性測(cè)定結(jié)果有所不同，小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)和小鼠凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)符合要求，可以作為其生物活性測(cè)定指標(biāo)。結(jié)論：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定項(xiàng)并不能全面反映中藥注射劑產(chǎn)品的有效性，在注射用燈盞花素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中建立生物活性測(cè)定項(xiàng)是必要和可行的。

【關(guān)鍵詞】 注射用燈盞花素;生物活性測(cè)定;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號(hào)】R917【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）07-0040-04

Resarch on Bioactivity Assay in Injection of Breviscapine

WANG Lu LIU Qin ZHANG Hongyu WANG Wei

Yunnan Institute for Food and Drug Control，Kunming 650031，China

Abstract：Objective To select appropriate methods as the bioactivity assay methods which are relevant to Injection of Breviscapines major function. Methods To select three experiments which are relevant to Injection of Breviscapines major function.Including mouse atmospheric anoxia experiment，mouse in vivo thrombosis experiment，mouse blood clotting time experiment.One or two appropriate methods were selected as the bioactivity assay methods which were reasonably designed，and simple to operate with clear indicators，high sensitivity and good reproducibility.Results Different batch number Injection of Breviscapine show difference bioactivity.Mouse acute cerebral ischemia and anoxia experiment， mouse blood clotting time experiment were selected as the bioactivity assay methods. Concluions The content determination in the quality standard cannot guarantee the effectiveness of Chinese medicine injection.Estabilshng bioactivity determination is necessary and feasibility in the quality standards on Injection of Breviscapine.

Key：words：Injection of Breviscapine;Bioactivity Determination;Quality Standard

注射用燈盞花素是燈盞花素加入適宜的賦形劑，經(jīng)冷凍干燥制成的無(wú)菌制品，其功能主治為活血化瘀、通絡(luò)止痛，是《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄》中藥注射劑品種，臨床廣泛用于中風(fēng)及其后遺癥，冠心病、心絞痛等缺血性心腦血管疾病。注射用燈盞花素的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，其中將野黃芩苷的含量測(cè)定作為質(zhì)量控制指標(biāo)，但由于中藥所含活性成分非常復(fù)雜，而且藥效的發(fā)揮往往是多種活性成分共同作用的結(jié)果，因此中藥檢測(cè)任何一種活性成分均不能完全體現(xiàn)其整體療效，為了使中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能更好地保證每批藥品的臨床使用安全有效，有必要在現(xiàn)有含量測(cè)定的基礎(chǔ)上增加生物活性測(cè)定檢測(cè)項(xiàng)目[1-2]，根據(jù)注射用燈盞花素的功能主治，選取小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)、小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、小鼠凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選適宜的生物活性測(cè)定指標(biāo)。

1 試藥與動(dòng)物

1號(hào)樣品：規(guī)格10mg，批號(hào)20151126-2;2號(hào)樣品：規(guī)格10mg批號(hào)20170302-2 ; 3號(hào)樣品：規(guī)格25mg批號(hào)20151125-2;4號(hào)樣品：規(guī)格25mg 批號(hào)20160927-1;5號(hào)樣品：規(guī)格50mg，批號(hào)20161104-1;6號(hào)樣品：規(guī)格50mg，批號(hào)20161020-1;以上樣品野黃芩苷含量測(cè)定分別為標(biāo)示量的98.75%、98.60%、100.35%、99.62%、99.71%、100.17%。注射用燈盞花素最大人用劑量0.83mg·kg-1。

膠原蛋白I型，酷爾生物，批號(hào)：B264565，規(guī)格1g;鹽酸腎上腺素注射液，上海和豐制藥有限公司，批號(hào) 10151101，規(guī)格1mL∶1mg;注射用鹽酸川芎嗪，合肥平光制藥有限公司，批號(hào)201509073，規(guī)格80mg;尼莫地平注射液，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)16051541，規(guī)格20mL∶4mg;血塞通注射液，規(guī)格5mL∶250mg批號(hào)ZKC1501，昆明制藥有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，ICR，SPF級(jí)別，雌雄兼有，體重18～22 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)[3] 取健康小鼠96只（雌雄兼有），體重18～20g，隨機(jī)分為注射用燈盞花素組（6個(gè)批號(hào)共6組），氯化鈉注射液組（陰性對(duì)照組）、鹽酸川芎嗪組（陽(yáng)性對(duì)照組）共8組，每組12只。注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量（臨床人用劑量的30倍）給藥，陽(yáng)性藥組給予60 mg·kg-1的鹽酸川芎嗪（臨床人用劑量的30倍）。各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30min后，尾靜脈注射血栓誘導(dǎo)劑造成小鼠血栓模型，血栓混合誘導(dǎo)劑含膠原蛋白0.60mg·mL-1和腎上腺素0.02 mg·mL-1，給藥體積0.1 mL/10g，觀察小鼠死亡個(gè)數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)（15min內(nèi)），偏癱率=（死亡個(gè)數(shù)+15min偏癱未恢復(fù)個(gè)數(shù)）/總個(gè)數(shù)，保護(hù)率=（未偏癱個(gè)數(shù)+15min內(nèi)偏癱恢復(fù)個(gè)數(shù)）/總個(gè)數(shù)，陰性組偏癱率大于等于80%說(shuō)明造模成功。

陽(yáng)性藥組及4個(gè)批號(hào)的注射用燈盞花素與陰性組比較，小鼠死亡個(gè)數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)（15min內(nèi)）減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2個(gè)批號(hào)的注射用燈盞花素與陰性組比較小鼠死亡個(gè)數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)（15min內(nèi)）減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 小鼠凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)[4] 取健康小鼠96只（雌雄兼有），體重18～20g，隨機(jī)分為注射用燈盞花素組（6個(gè)批號(hào)共6組），氯化鈉注射液組（陰性對(duì)照組）、鹽酸川芎嗪組（陽(yáng)性對(duì)照組）共8組，每組12只。注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量（臨床人用劑量的30倍）給藥，陽(yáng)性藥組給予200mg·kg-1的血塞通注射液（臨床人用劑量的30倍），各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，用玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢，深約4～5 mm，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)至有血液流出，于載玻片兩端各滴一滴血，血滴直徑約5 mm，立即用秒表計(jì)時(shí)，每隔10s用清潔牙簽自血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)一次，并觀察有無(wú)血絲挑起，從計(jì)時(shí)起至挑起血絲止，所歷時(shí)間即為凝血時(shí)間。

陽(yáng)性藥血塞通注射液組及5個(gè)批號(hào)注射用燈盞花素與陰性組比較凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1個(gè)批號(hào)注射用燈盞花素與與陰性組比較凝血時(shí)間延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 小鼠常壓耐缺氧作用[4] 取18～20g小鼠96只（雌雄兼有），按體重隨機(jī)分為陰性組、陽(yáng)性藥組以及6個(gè)批號(hào)的注射用燈盞花素組，共8組，每組12只。陰性組給予氯化鈉注射液，陽(yáng)性藥組給予1.65mg·kg-1的尼莫地平注射液（臨床人用劑量的25倍），注射用燈盞花素組按25mg·kg-1的劑量（臨床人用劑量的30倍）給藥。各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶?jī)?nèi)（每瓶放1只小鼠），用凡士林涂抹瓶口蓋嚴(yán)，使之不漏氣，開(kāi)始計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。

陽(yáng)性藥組尼莫地平注射液及4個(gè)批號(hào)注射用燈盞花素與陰性組比較喘息時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2個(gè)批號(hào)注射用燈盞花素與與陰性組比較喘息時(shí)間延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定的局限性 生物活性測(cè)定法是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定藥物有效性的一種方法，從而達(dá)到控制藥品質(zhì)量的作用，其測(cè)定方法包括生物效價(jià)測(cè)定法和生物活性限值測(cè)定法[5]。

中藥的藥材來(lái)源廣泛、多變，制備工藝復(fù)雜，使得中藥制劑的質(zhì)量控制相對(duì)困難。目前中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定的建立與研究多半只是對(duì)中藥產(chǎn)品成分的穩(wěn)定性和可控性實(shí)行改進(jìn)，并沒(méi)有與中藥的藥效建立直接的內(nèi)在聯(lián)系[6]。尤其是用于臨床的中藥注射劑和危重病癥治療的中藥制劑，更應(yīng)該保證每批產(chǎn)品具有可靠的生物活性[7]。本研究表明，雖然6批注射用燈盞花素中野黃芩苷含量均符合目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但生物活性測(cè)定結(jié)果有所不同，顯示不同的生產(chǎn)工藝或同一企業(yè)不同的原料對(duì)中藥注射劑的有效性存在明顯影響。因此單純控制某些指標(biāo)成分的理化分析并不能全面反映中藥注射劑產(chǎn)品的有效性，應(yīng)該結(jié)合“生物活性測(cè)定”方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

3.2 分析結(jié)果和比較方法 本試驗(yàn)研究根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部附錄“中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則”[5]設(shè)計(jì)，根據(jù)藥品的功能主治篩選生物活性測(cè)定方法。作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的生物活性測(cè)定方法，所選擇的檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)當(dāng)客觀、專屬性強(qiáng)，與功能主治相關(guān)，給藥途徑一般應(yīng)與臨床用藥途徑一致，還應(yīng)當(dāng)操作簡(jiǎn)便、成本低廉、檢測(cè)指標(biāo)明確、靈敏度高、重現(xiàn)性好[8]。

小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)，膠原蛋白和腎上腺素都是血小板聚集誘導(dǎo)劑，小鼠尾靜脈注射后誘發(fā)體內(nèi)肺栓塞，血栓形成，導(dǎo)致偏癱和死亡。6個(gè)批號(hào)的注射用燈盞花素對(duì)血栓混合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的急性血栓小鼠死亡個(gè)數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)（15min內(nèi)）減少，說(shuō)明其對(duì)注射血栓混合誘導(dǎo)劑形成體內(nèi)血栓模型的小鼠有一定的保護(hù)作用，但程度各不相同。該實(shí)驗(yàn)中血栓誘導(dǎo)劑膠原蛋白和腎上腺素是微量注射，實(shí)際操作時(shí)對(duì)小鼠尾靜脈注射給藥要求較高，如果漏液實(shí)驗(yàn)結(jié)果易出現(xiàn)偏差。

小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)，缺氧對(duì)機(jī)體是一種劣性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化供能，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡。野黃芩苷可提高機(jī)體的血氧利用率，降低機(jī)體耗氧量。同時(shí)可擴(kuò)張血管（特別是冠脈和軟腦膜血管）[9]，改善微循環(huán)，增加供氧量，從而改善機(jī)體缺氧狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)以小鼠在常壓缺氧條件下呼吸停止死亡為指標(biāo)，研究注射用燈盞花素的耐缺氧作用。該實(shí)驗(yàn)受人為因素影響小且較敏感。

小鼠凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)，血瘀癥常有“濃粘凝聚“的血液流變異常，血瘀證患者血液運(yùn)行不暢，易致血栓形成，血管栓塞，燈盞花素能改善血瘀證患者的血液流變性[10]，能夠抑制血小板功能，抑制血小板的粘附聚集和釋放，改善淤血癥高凝狀態(tài)，6個(gè)批號(hào)的注射用燈盞花素均可不同程度延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，該實(shí)驗(yàn)操作方法簡(jiǎn)單易行，不需要復(fù)雜儀器。

綜上所述，篩選出適宜的注射用燈盞花素生物活性測(cè)定指標(biāo)為小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)和小鼠凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)。生物活性測(cè)定方法的建立作為一項(xiàng)新的內(nèi)容還應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括精密度考察、方法適用性考察，如果經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，能基本達(dá)到綜合控制與有效性相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)目的，則應(yīng)將“生物活性測(cè)定”項(xiàng)目正式收載于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，并在今后的工作中不斷完善提高。

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（收稿日期：2020-09-27 編輯：程鵬飛）