張 妞，王 東，趙遠(yuǎn)征，項(xiàng) 鵬，邱廷艷，趙 鑫，高騰達(dá)，高志超，周洪友

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特010018；2內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，呼和浩特010031；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黑河分院，黑龍江黑河164312；4內(nèi)蒙古喀喇沁旗農(nóng)牧局植保植檢站，內(nèi)蒙古喀喇沁旗024409）

0 引言

馬鈴薯腐爛莖線蟲Ditylenchusdestructor，屬于遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，是國(guó)際公認(rèn)的檢疫性線蟲[1-2]。該線蟲主要為害馬鈴薯和甘薯，侵染薯塊后，薯塊表皮皺縮、龜裂，內(nèi)部褐色并逐漸變黑，后期伴有細(xì)菌和螨類二次侵染，導(dǎo)致整薯腐爛變質(zhì)[3]。馬鈴薯腐爛莖線蟲病在北京、天津、山東、河北、河南、江蘇、新疆、甘肅等地均有發(fā)生，并以山東、河北兩省最為嚴(yán)重，已成為北方甘薯最嚴(yán)重的病害之一[4]。該病害可造成甘薯和馬鈴薯減產(chǎn)30%～50%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)80%以上，甚至絕收[5-7]，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前利用生物防治措施控制植物線蟲病害已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，張國(guó)鋒等[8]研究表明，利用30 kg/hm2的厚孢輪枝菌（孢子2.5億個(gè)/g）和45 kg/hm2的淡紫擬青霉顆粒劑（5億/g孢子）可有效防治甘薯莖線蟲病，防治效果分別達(dá)70.94%和67.56%。高春梅等[9]研究表明叢枝菌根真菌(AMF)和暗隔內(nèi)生真菌(DSE)組合菌劑抑制南方根結(jié)線蟲的發(fā)育，降低線蟲繁殖量、根內(nèi)定殖數(shù)、發(fā)病率和根結(jié)指數(shù)。Lax等[10]研究發(fā)現(xiàn)接種根內(nèi)球囊霉Glomus intraradices能有效地減輕南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita對(duì)番茄根系的傷害，降低線蟲繁殖量。Noor等[11]研究發(fā)現(xiàn)，來源于馬鈴薯根及塊莖的內(nèi)生細(xì)菌能夠抑制馬鈴薯胞囊線蟲的胞囊和二齡幼蟲(J2)形成，其中對(duì)胞囊數(shù)量的抑制率為51.7%～65.4%，對(duì)J2數(shù)量的抑制效果達(dá)到48.6%～76.4%。芽胞桿菌是用于防控植物線蟲病害的重要生防因子。有研究表明，蘇云金芽胞桿菌B.thuringiensis和巨大芽胞桿菌B.megaterium對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲均具有較高的殺線活性[12-13]。Zeng等[14]分離獲得的芽胞桿菌菌株SMrs28的發(fā)酵液粗提物表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺線蟲活性，其主要化合物對(duì)腐爛莖線蟲具有毒殺作用。Jonathand等[15]利用蠟狀芽胞桿菌B.cereus等根際細(xì)菌防治南方根結(jié)線蟲M.incognita，使根結(jié)指數(shù)由94%下降至25%～31%。生物防治具有對(duì)非靶標(biāo)生物安全、致毒作用小、環(huán)境兼容性好、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已成為防控腐爛莖線蟲病害的重要手段。本研究通過利用34個(gè)細(xì)菌菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的殺線活性進(jìn)行測(cè)定，篩選出具有高效觸殺活性的生防細(xì)菌菌株并明確其分類地位，為微生物殺線劑的研發(fā)與應(yīng)用提供思路，旨在為生產(chǎn)上防治馬鈴薯腐爛莖線蟲病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、線蟲

供試細(xì)菌菌株共34個(gè)，-80℃條件下保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植保學(xué)院植物病理研究室；馬鈴薯腐爛莖線蟲D.destructor分離自發(fā)病的馬鈴薯病薯，并轉(zhuǎn)接于健康的馬鈴薯薯塊中進(jìn)行擴(kuò)繁，室溫條件下保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植保學(xué)院植物病理研究室。

1.2 主要試劑、藥品

細(xì)菌基因組DNA試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；EasyTaqPCR supermix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×TaqPCR Mix購(gòu)自生物工程大連有限公司；TAE緩沖液，購(gòu)自購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；核酸染料，購(gòu)自百泰克生物科技有限公司；瓊脂粉，購(gòu)自上海致化化學(xué)科技有限公司；瓊脂，購(gòu)自BioFroxx公司；葡萄糖、氯化鈉分析純，購(gòu)自天津永晟精細(xì)化工有限公司；LP0021酵母浸粉，購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.3 主要儀器

NSZ-606體視顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；5424離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；KGSX-500蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司生產(chǎn)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海-恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；S1000 PCR擴(kuò)增儀、Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)；JY-ECP3000電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)；XPH-160BSH-III恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)；JY2002電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司生產(chǎn)；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；Eco-Q30純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司生產(chǎn)；VS-840-U凈化工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；3513型12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司生產(chǎn)。

1.4 供試培養(yǎng)基

1.4.1 LB固態(tài)培養(yǎng)基 酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2。

1.4.2 LB液態(tài)培養(yǎng)基 酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2。

1.4.3 碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基 KH2PO42.38 g、K2HPO4·3H2O 5.65 g、(NH4)2SO42.64 g、CuSO45H2O 6.4 mg、MgSO4·7H2O 1 g、ZnSO4·7H2O 1.5 mg、MnCl2·7H2O 7.9 mg、FeSO4·7H2O 1.1 mg、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.4 氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖10 g、K2HPO4·3H2O1g、MgSO4·7H2O5g、NaCl5g、FeSO4·7H2O10mg、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2。

1.4.5 淀粉水解培養(yǎng)基 可溶性淀粉10 g、K2HPO4·3H2O 0.3 g、MgCO30.3 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.6 V-P測(cè)定液態(tài)培養(yǎng)基 胰化蛋白胨7 g、葡萄糖5 g、K2HPO45 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.7 接觸酶培養(yǎng)基 胰化蛋白胨20 g、NaHPO42 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.8 H2S產(chǎn)生培養(yǎng)基 胰化蛋白胨2.5 g、NaCl 5 g、酵母提取物7.5 g、瓊膠120 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.9 吲哚產(chǎn)生液態(tài)培養(yǎng)基 胰化蛋白胨20 g、NaHPO42 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.10 硝酸鹽液態(tài)培養(yǎng)基 胰化蛋白胨10 g、KNO31 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.4.11 明膠培養(yǎng)基 葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、明膠200 g、蒸餾水1000 mL。

1.5 線蟲分離與懸浮液制備

采用改良貝曼漏斗法[16-17]從馬鈴薯病薯中分離馬鈴薯腐爛莖線蟲，用吸管將分離到的線蟲轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入35%的蔗糖溶液后3500 r/min離心2 min；取上層線蟲懸浮液，轉(zhuǎn)移至無菌水中，4000 r/min離心5 min；棄上清液，用0.5%的次氯酸鈉消毒1 min后，4000 r/min離心5 min；棄上清液，加入0.5%硫酸鏈霉素和0.5%青霉素的混合液中消毒6 min，離心后吸出消毒液，用無菌水沖洗3次，線蟲懸浮液（約1000條/mL），4℃保存?zhèn)溆肹18]。

1.6 菌株發(fā)酵液的制備

將34個(gè)菌株于LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，利用9 mm打孔器打成菌餅放入250 mL三角瓶，每瓶裝入100 mL液體培養(yǎng)基中，25℃～28℃下，150 ～180 r/min搖床發(fā)酵2～3天后將菌株的發(fā)酵液6000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.7 菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的室內(nèi)觸殺活性篩選

采用直接觸殺法[19]，將馬鈴薯腐爛莖線蟲懸浮液分裝在2 mL離心管中，每管約含100條線蟲，5000 r/min離心1 min，棄上清液，用移液槍將菌株發(fā)酵液上清液先加入2 mL離心管中，每個(gè)離心管中加入1.5 mL菌液，在微型漩渦混合儀充分震蕩，每個(gè)處理重復(fù)3次，以無菌水為對(duì)照。用橡皮筋固定，放入無菌聚乙烯塑料袋中，25℃恒溫培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，記錄馬鈴薯腐爛莖線蟲的總數(shù)以及死亡數(shù)。

計(jì)算馬鈴薯腐爛莖線蟲的死亡率公式(1)和校正死亡率公式(2)，并使用IBM SPSS Statistics 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

1.8 菌株鑒定

1.8.1 菌株生理生化鑒定 參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株生理生化特征進(jìn)行鑒定，主要有碳素化合物的利用：L-阿拉伯糖、D-木糖、葡萄糖、D-山梨醇、蔗糖、i-肌醇、水楊苷、V.P.試驗(yàn)；氮素化合物的利用：硝酸鉀、硝酸銨、L-羥脯氨酸、硝酸鹽還原、H2S的產(chǎn)生、吲哚的產(chǎn)生；其他反應(yīng)測(cè)定：淀粉水解、接觸酶、明膠液化[20-22]。

1.8.2 菌株的16S rDNA鑒定 篩選獲得的細(xì)菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落放入裝有LB液體培養(yǎng)基的10 mL離心管中，28℃、180 r/min搖培24 h。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，參考使用說明書進(jìn)行DNA提取，-20℃保存?zhèn)溆?。利?6S通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3’)對(duì)菌株 16 S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25 μL：模板DNA 3 μL、dd H2O 7.5 μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，55℃ 1 min，72℃ 90 s，29個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送往華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫在線BLAST比對(duì)分析，并利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)菌菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性結(jié)果

不同細(xì)菌菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性見表1。表1可知，34個(gè)細(xì)菌菌株發(fā)酵液處理馬鈴薯腐爛莖線蟲48 h后，對(duì)該線蟲均表現(xiàn)出一定的致死作用。其中菌株Chi9-7與Xia4-11發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的校正死亡率在80%以上，菌株Xia4-11發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲致死作用最強(qiáng)，校正死亡率達(dá)82.59%；菌株Nong3-5、Z-1、Gu4-7、b5-4、b1-3、Nong5-6和Chi9-2發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的校正死亡率為72.36%～77.94%，且不同菌株間觸殺作用差異并不顯著；另外菌株 X1''、Chitu8-4、Gen7-3、S-6、Gen9-3、Gen6-10和CF4-51發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的校正死亡率為60.53%～69.16%；其余菌株對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲的致死作用較差，校正死亡率均在24.49%～59.42%之間，其中菌株Chi1-15、3-6、C-11發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲正死亡率分別為僅為24.49%、27.04%、29.51%。

表1 不同菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲48 h的觸殺活性

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 9個(gè)細(xì)菌菌株菌落形態(tài)見圖1、表2。圖1、表2可知，對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲校正死亡率大于72.36%的9個(gè)細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定，9個(gè)菌株接種于LB固態(tài)培養(yǎng)基后，于34 h時(shí)觀察各個(gè)菌株的具體形態(tài)特征及生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)菌株Xia4-11、Chi9-2、b5-4、Nong3-5、Chi9-7和Z-1單菌落直徑3～4 mm，Nong5-6、b1-3和Gu4-7單菌落直徑7～8.6 mm，其中菌株Gu4-7生長(zhǎng)速度最快34 h時(shí)8.6 mm，Nong5-6和b1-3生長(zhǎng)速度較快，分別為7 mm和7.5 mm，其余菌株生長(zhǎng)較慢菌落直徑3～4 mm；9個(gè)菌株中Chi9-2菌落邊緣形狀為圓形，其余菌株均不規(guī)則；菌株Xia4-11、Chi9-2、Nong3-5、Nong5-6和Chi9-7的單菌落形態(tài)平滑，其余菌株但菌落形態(tài)隆起；菌株b1-3菌落顏色為乳白色，其余菌株顏色均為淡黃色；菌株Chi9-2、Z-1和Gu4-7菌株質(zhì)地濕潤(rùn)，Nong3-5、Xia4-11、Nong5-6、Chi9-7菌株質(zhì)地干燥，其余菌株質(zhì)地粘稠；菌株Xia4-11和Z-1菌株氣味分別為腥味和臭味，其余7個(gè)菌株均無味，如圖1、表2所示。

圖1 9個(gè)細(xì)菌菌株菌落形態(tài)

表2 9個(gè)細(xì)菌菌株菌落形態(tài)特征

2.2.2 生理生化特征鑒定 9個(gè)細(xì)菌菌株生理生化特征見表3。表3可知，在碳源利用上9個(gè)菌株均能夠利用D-木糖、葡萄糖、蔗糖、D-山梨醇；除菌株Z-1和Gu4-7外，其余7個(gè)菌株均能利用L-阿拉伯糖；除菌株Gu4-7外，其余8個(gè)菌株均能利用i-肌醇；菌株b5-4、Nong5-6和Gu4-7不能利用水楊苷，但其余6株菌均能利用其生長(zhǎng)；在氮源利用上，9個(gè)菌株均能夠利用硝酸銨，除菌株b5-4外，其余8株菌均能利用硝酸鉀；此外，淀粉水解、V-P測(cè)定、接觸酶、硝酸鹽還原、明膠液化、H2S產(chǎn)生、吲哚試驗(yàn)中9個(gè)株菌均為陽性。

表3 9個(gè)細(xì)菌菌株生理生化特征

2.2.3 16S rDNA分子鑒定 利用16S rDNA對(duì)篩選獲得的9個(gè)細(xì)菌菌株進(jìn)行分子鑒定結(jié)果見圖2～3。由圖2可知，PCR擴(kuò)增得到的片段大小為1500 bp左右。由圖3可知，菌株Chi9-7、Nong3-5、Nong5-6、b1-3與枯草芽胞桿菌Bacilluicssubtilis處于同一分支，Chi9-7、Nong3-5與B.subtilis（登錄號(hào)：MT590663.1）相似性均為100%，Nong5-6與B.subtilis（登錄號(hào)：KC1978.5.1）相似性為99.79%，b1-3與B.subtilis（登錄號(hào)：MT487684.1）相似性為99.93%；b5-4菌株與貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis屬于同一分支，相似性為100%；Chi9-2、Xia4-11、Gu4-7和Z-1與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens屬于同一分支，Chi9-2與B.amyloliquefaciens（登錄號(hào)：MT613661.1）相似性 為100%，Xia4-11、Gu4-7和Z-1與B.amyloliquefaciens（登錄號(hào)：KC417346.1）相似性分別為99.93%、99.72%和99.86%。

圖2 9個(gè)細(xì)菌菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 9個(gè)細(xì)菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

經(jīng)細(xì)菌16S rDNA分子鑒定，并結(jié)合各菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，將9個(gè)供試菌株分別鑒定為菌株Chi9-7、Nong3-5、Nong5-6和b1-3為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)，菌株Chi9-2、Xia4-11、Gu4-7和Z-1為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)，菌株B5-4為貝萊斯芽胞桿菌(B.velezensis)。

3 討論與結(jié)論

芽胞桿菌(Bacillusspp.)作為重要的生防因子，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的病害防控，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[23]，已在植物線蟲病害的生物防治領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。近年來，研究人員篩選出多個(gè)解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)菌株對(duì)植物線蟲具有較高的抑制活性。例如，蔣盼盼等[24]室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌菌株B1619粗提液原液分別處理蔬菜根結(jié)線蟲，其24、48 h的線蟲死亡率分別達(dá)78.8481%和82.4923%。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌JK-JS3培養(yǎng)原液濾液對(duì)松材線蟲、擬松材線蟲、大核滑刃線蟲、霍夫曼尼傘滑刃線蟲、李氏長(zhǎng)尾線蟲、吳氏長(zhǎng)尾線蟲和外滑刃科線蟲共7種侵染松樹的植物線蟲具有一定殺線活性；在此基礎(chǔ)上，朱麗梅等[26]對(duì)解淀粉芽胞桿菌JK-JS3分泌的殺線蟲活性物質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在堿性條件下殺線活性較高，且在常溫25℃和冷藏4℃條件下保存60天后仍具有較高的殺線活性。結(jié)合前人的研究結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌對(duì)于多種植物線蟲均具有較強(qiáng)的殺線活性。但是，對(duì)于馬鈴薯腐爛莖線蟲，往往比其他植物線蟲具有更高的抗逆性[27]。因此，篩選出對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲具有高效抑制活性的生防菌株難度較大。夏彥飛[28]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌FZB42和B3培養(yǎng)濾液處理馬鈴薯腐爛莖線蟲48 h的抑制率分別達(dá)到28%和65%；而本研究篩選出4株解淀粉芽胞桿菌Xia4-11、Chi9-2、Gu4-7和Z-1，具有更強(qiáng)的觸殺活性，對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲48 h的抑制率達(dá)到73.28%～82.59%。一般來說，理想的生防微生物除了要具有較高的抑病活性，在田間環(huán)境中的定殖能力往往影響其生防效果，因此今后有必要將繼續(xù)開展田間試驗(yàn)，從而進(jìn)一步篩選獲得更具開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的生防菌株。

研究表明，枯草芽胞桿菌B.subtilis也對(duì)多種植物線蟲具有較高的抑制活性。如夏彥飛等[29]發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌OKB105發(fā)酵液處理南方根結(jié)線蟲、擬松材線蟲、豆傘滑刃線蟲和程氏傘滑刃線蟲，4種線蟲24 h的死亡率均達(dá)到100%。陶樹興等[30]通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌2-3-2發(fā)酵液對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病防效達(dá)89.41%，且明顯增加植株干重。丁國(guó)春等[31]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌AR11稀釋菌懸液對(duì)南方根結(jié)線蟲的二齡幼蟲有抑制作用，且高濃度菌懸液可以強(qiáng)烈抑制卵的孵化，同時(shí)對(duì)番茄具有明顯的促生作用。對(duì)于馬鈴薯腐爛莖線蟲，劉瑋瑋[32]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌BL02和G8產(chǎn)生的揮發(fā)物能夠?qū)υ摼€蟲產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，經(jīng)菌株揮發(fā)物處理后大部分線蟲在1～12 h內(nèi)活動(dòng)逐漸減弱，24 h后完全停止活動(dòng)。本研究利用直接觸殺的測(cè)定方法，發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Chi9-7、Nong5-6、b1-3和Nong3-5發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲具有明顯的抑制活性，48 h抑制率可達(dá)到72.36%～80.02%；但在試驗(yàn)過程中這些菌株是否產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)并對(duì)該線蟲產(chǎn)生熏蒸活性，還有待于后續(xù)試驗(yàn)的驗(yàn)證。

貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis是一種新型的生防因子，具有廣譜抑菌活性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中極具開發(fā)潛力[33]。張文博等[34]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌FZB42稀釋培養(yǎng)液處理松材線蟲48 h的抑制率達(dá)50%。茆振川等[35]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌Bv-25對(duì)根結(jié)線蟲病具有良好的防治效果，利用該菌株進(jìn)行病害的早期防控，從而有助于實(shí)現(xiàn)蔬菜的安全和無公害生產(chǎn)。針對(duì)于馬鈴薯腐爛莖線蟲，之前尚未檢索到具有較高抑制活性的貝萊斯芽胞桿菌菌株；而本研究篩選了一株貝萊斯芽胞桿菌b5-4，對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較強(qiáng)的觸殺效果，48 h時(shí)線蟲的校正死亡率達(dá)76.52%，這一發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了相關(guān)領(lǐng)域的空白。生防微生物資源十分豐富，蘊(yùn)藏其中的代謝產(chǎn)物可以為新型殺線劑的研發(fā)提供新的思路。作為新型生防因子，貝萊斯芽胞桿菌b5-4抑制馬鈴薯腐爛莖線蟲的機(jī)制有待于深入研究。

本研究以馬鈴薯腐爛莖線蟲為靶標(biāo)，從34個(gè)細(xì)菌菌株中篩選出9株芽胞桿菌，表現(xiàn)出較高的觸殺活性，其48 h的抑制率達(dá)到72.36%～82.59%；進(jìn)而利用16S rDNA基因，并結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征，鑒定出4株解淀粉芽胞桿菌、4株枯草芽胞桿菌和1株貝萊斯芽胞桿菌。本研究通過篩選高效殺線蟲生防菌，為微生物殺線劑的研發(fā)提供了新資源，也為馬鈴薯腐爛莖線蟲病的有效防控奠定了基礎(chǔ)。