宋時麗,吳 昊,黃鵬偉,孫 凱,張振華,張 勇,戴傳超,*

1 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心,江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023 2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所,南京 210014 3 江蘇省句容藍(lán)天碧水生物科技有限公司,句容 212402

據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年我國農(nóng)作物種植面積達(dá)1.17億hm2[1],作物秸稈總量超過9億t,秸稈利用多以肥料化、飼料化和燃料化為主[2]。但由于技術(shù)普及的困難,大多數(shù)地方還是采用秸稈粉碎后全量直接還田的方式。秸稈主要由纖維素、半纖維和木質(zhì)素組成,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,再加上其較高的C/N比,自然狀態(tài)下降解緩慢,還田一季后田間還有大量殘留,導(dǎo)致秸稈中的養(yǎng)分無法及時還田,長此以往,田間秸稈堆積,極易造成秸稈中的蟲卵孵化,加重作物蟲害[3],降低作物產(chǎn)量[4]。因此研究快速降解直接還田秸稈的方法是重中之重。

目前,多數(shù)研究集中于利用微生物降解還田秸稈上。顏建東[5]等人證明,向田間施加市購秸稈腐熟劑可以使還田麥秸快速腐解,但市購秸稈腐熟劑中所含微生物菌種不詳,難以適用于所有作物,盲目施用會取得相反結(jié)果[6]；錢海燕[7]等人將市購微生物菌劑(主要為腐解菌)與化肥配施,緩解了秸桿的高C/N比,發(fā)現(xiàn)能夠加快秸稈腐解；然而該類微生物菌劑中的菌種多為單一菌種,腐解效率有待提高且是否對作物有負(fù)面影響尚不清楚。一些研究人員轉(zhuǎn)而篩選高效降解纖維素、半纖維、木質(zhì)素相關(guān)細(xì)菌、真菌、放線菌[8- 10],制作成復(fù)合菌劑,證明其能夠進(jìn)一步加快田間還田秸稈的降解,同時對于土壤肥力、土壤微生物和作物產(chǎn)量都有積極影響[11]。然而這些復(fù)合菌劑的效果受到施肥方式、氣候、土壤類型、農(nóng)作物類型的影響,因此,復(fù)合菌劑的成分不是一層不變的,需要因地制宜。

黃河故道沿線受水流沖刷影響,土壤呈堿性砂質(zhì)狀態(tài),該地土壤肥力低下、生物功能弱和微生物多樣性低,導(dǎo)致農(nóng)作物生長受限,產(chǎn)量較低。黃河故道地區(qū)土壤培肥,對于提高糧食產(chǎn)量有重要意義。本課題選擇江蘇省鹽城市濱?？h黃河故道地區(qū)作為試驗(yàn)點(diǎn),開展上述研究。因此本文根據(jù)試驗(yàn)區(qū)作物秸稈全量直接還田及土壤性質(zhì)特點(diǎn),一方面施加復(fù)合菌劑促進(jìn)秸稈快速還田,增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、培育土壤微生物多樣性和生物功能。該復(fù)合菌劑含特色菌種 —一株植物內(nèi)生真菌Phomopsisliquidambaris,其分離自重陽木莖內(nèi)皮,被命名為B3。前期研究表明該菌分泌漆酶的活性很高[12],能有效降解木質(zhì)素并在田間實(shí)驗(yàn)中證明可促進(jìn)水稻生長[13],是一種有益促生菌。除此之外,本復(fù)合菌劑還含枯草芽孢桿菌[14]、蜂房芽孢桿菌[15]和黑曲霉[16],它們均具有較好的纖維素和半纖維降解能力。本文已證明用于加速還田秸稈降解且有植物內(nèi)生真菌B3參與的復(fù)合菌劑不僅能夠較好地降解盆栽玉米秸稈,還有助于改善土壤理化性質(zhì)、增加作物產(chǎn)量[17]；但該種復(fù)合菌劑能否在試驗(yàn)區(qū)田間發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步研究。另一方面,通過集中腐熟且富含有機(jī)質(zhì)的土壤改良培肥基質(zhì)的施加,對該砂質(zhì)堿性土進(jìn)行培肥,提高土壤有機(jī)質(zhì),改善耕地質(zhì)量。通過上述兩個方面,進(jìn)行不同的施肥處理,旨在短期內(nèi)消減中低產(chǎn)農(nóng)田土壤障礙、培育土壤生物功能、提升耕地質(zhì)量和生產(chǎn)力,并選出能夠快速土壤培肥和土壤生物功能培育的最優(yōu)培肥方式進(jìn)行推廣。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017年11月22日至2018年6月15日在江蘇省鹽城市濱?？h界牌鎮(zhèn)黃河灣科技公司試驗(yàn)基地(34°06′08″N, 119°51′16″E)進(jìn)行。該地區(qū)年平均氣溫為14 ℃,年平均降雨量為942.6 mm,最大為1371.9 mm,最少535.8 mm,年平均降雨日數(shù)為100 d左右,多集中在夏季。試驗(yàn)地距離黃河故道7.2 km,土壤為砂質(zhì)堿性土。該地區(qū)的冬小麥和夏水稻秸稈均全部還田；本文主要針對第一季稻茬小麥在上季水稻秸稈全部還田條件下經(jīng)過處理后土壤的理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)和土壤微生物多樣性變化情況進(jìn)行研究。

1.2 菌種及菌劑制作

1.2.1菌種

試驗(yàn)中使用的有機(jī)物料腐熟劑是用實(shí)驗(yàn)室保藏菌種復(fù)配形成的復(fù)合菌劑,包括植物內(nèi)生真菌楓香擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisliquidambaris),編號為B3、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蜂房芽孢桿菌(Bacillusalvei),它們均為能夠降解秸稈并對作物有促生功能的有益菌種；通過平板對峙實(shí)驗(yàn)表明這四種菌兩兩之間沒有拮抗作用,說明它們可以一起復(fù)配制作成復(fù)合菌劑。真菌用4 ℃保藏的斜面進(jìn)行PDA轉(zhuǎn)接,挑取單菌落真菌菌絲用PDA液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁,28 ℃,180 rpm搖床3 d獲得種子液；用-80 ℃甘油保藏的兩種細(xì)菌進(jìn)行平板劃線法復(fù)壯,LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)擴(kuò)繁,37 ℃,180 rpm搖床2 d獲得種子液；取各菌株種子液按接種量5%轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行放大培養(yǎng),培養(yǎng)條件同種子液發(fā)酵條件,獲得發(fā)酵液。接著測定菌液中菌體數(shù)目,細(xì)菌用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù),其中枯草芽孢桿菌為6.15×109菌落數(shù)/mL,蜂房芽孢桿菌為6.25×109菌落數(shù)/mL；真菌用搖勻烘干稱重法,其中B3為3.52×10-2g/mL,黑曲霉為4.1×10-3g/mL。

1.2.2菌劑制作

實(shí)驗(yàn)中所用菌劑劑型均為固體菌劑。按照麩皮：鋸木屑：稻殼=6：3：1,將其混勻后每400 g裝滅菌袋,并向袋中加200 mL水,拌勻后進(jìn)行121 ℃,20 min滅菌處理,待其冷卻后接入50 mL菌種發(fā)酵液單獨(dú)發(fā)酵,整個過程均在超凈工作臺完成。接種完成后真菌放在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),待真菌菌絲長滿整個發(fā)酵袋視為發(fā)酵完成；細(xì)菌則放在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),待有機(jī)物料質(zhì)地粘稠視為發(fā)酵完成。最后將發(fā)酵好的四種菌等量混勻,按照60 kg/ hm2標(biāo)準(zhǔn)均勻撒入田間。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)地長期進(jìn)行水稻-小麥輪作,試驗(yàn)地共分成五個大區(qū),每個大區(qū)長30 m,寬45 m,大區(qū)之間1.5 m間隔,每個大區(qū)面積為1334 m2,整個實(shí)驗(yàn)地塊面積共6670 m2,各個大區(qū)內(nèi)人為分成三塊,作為三個重復(fù),由于地塊較大,實(shí)驗(yàn)重復(fù)不便隨機(jī)分布,但取樣是隨機(jī)的,每個處理取三組重復(fù)。在前季作物水稻秸稈全量還田的條件下,實(shí)驗(yàn)以土壤改良培肥基質(zhì)(Modified organic substrate,MOS,茅峰牌,Q/321183 BLT 001—2017)、復(fù)合微生物菌劑(Compound microbial agent,CMA)和化肥(chemical fertilizer,CF)為要素,設(shè)計(jì)了以下五個處理：①土壤改良培肥基質(zhì)+有機(jī)物料腐熟復(fù)合菌劑+常規(guī)化肥聯(lián)合處理,MOS+CMA+CF；②單獨(dú)有機(jī)物料腐熟復(fù)合菌劑+常規(guī)化肥,CMA+CF；③單獨(dú)的土壤改良培肥基質(zhì)+常規(guī)化肥,MOS+CF；④常規(guī)化肥處理對照,CF；⑤不施肥空白對照,CK。土壤改良培肥基質(zhì)從公司購得,主要是由畜禽糞便、藥渣、蘑菇渣和秸稈等腐熟有機(jī)物料發(fā)酵制成,每克含有效菌落數(shù)(cfu)≥ 2億個,總養(yǎng)分(N、P、K)≤ 3%,pH為6.5—8.5。其中土壤改良培肥基質(zhì)施加7500 kg/ hm2、復(fù)合微生物菌劑施加60 kg/ hm2、化肥用量則參照當(dāng)?shù)亓?xí)慣常規(guī)施加,即施加復(fù)合肥(江蘇中東化肥股份有限公司,綠聚能,N+P205+ K20 ≥ 40%)750 kg/ hm2作為基肥,小麥返青期追氮肥(尿素)105 kg/ hm2,拔節(jié)孕穗期追氮肥(尿素)254 kg/ hm2。小麥為機(jī)器播種,播種密度為 375 kg/ hm2；小麥生長期間沒有進(jìn)行補(bǔ)苗、間苗工作?？紤]到試驗(yàn)區(qū)面積較大,劃分的小區(qū)無法隨機(jī)分布,為了避免各小區(qū)處理前土壤的不均勻,分別測定了劃分后各小區(qū)處理前土壤的基本理化性質(zhì),并與小麥不同生長時期的土壤進(jìn)行比較分析。

1.4 土壤樣品采集與測定

1.4.1土壤樣品采集

試驗(yàn)區(qū)小區(qū)劃分后,用取土鉆通過五點(diǎn)取樣法采取土壤深度為5—20 cm的處理前土壤(S0)、小麥返青期土壤(S1)、小麥拔節(jié)孕穗期土壤(S2)、小麥成熟期土壤(S3),每個處理取三次重復(fù)。土壤采集后,一部分土壤風(fēng)干后過1 mm篩進(jìn)行土壤基本理化性質(zhì)的測定,其中用于土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和全磷測定的土壤需過100目篩。一部分土壤置于4 ℃冰箱進(jìn)行土壤酶活和土壤微生物量碳/氮測定,另一部分放于-80 ℃冰箱用于土壤總DNA的提取。原始土壤(S0)的基本理化性質(zhì)如表1所示,且表中數(shù)據(jù)總體上相對均勻。

表1 處理前土壤(S0)基本理化性質(zhì)

1.4.2土壤樣品理化性質(zhì)的測定

土壤有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定[18],總氮用堿性過硫酸鉀法測定[19],總磷用硫酸-過氧化氫消煮鉬銻抗比色法測定,速效氮用堿解擴(kuò)散法測定[20],速效磷用鉬銻抗比色法測定[21],速效鉀用乙酸銨浸提火焰光度計(jì)(WFX- 200)法測定[22],土壤pH用pH計(jì)測定(土水比1∶2.5,體積分?jǐn)?shù)),容重用環(huán)刀法測定,土壤陽離子交換量用乙酸鈉-火焰光度計(jì)法測定[23]。

1.4.3土壤樣品生物學(xué)性質(zhì)的測定

土壤酶活性的測定主要參照關(guān)松蔭的相關(guān)方法[24]。土壤纖維素酶活性用DNS法測定,脲酶活性用靚酚藍(lán)比色法測定,堿性磷酸酶用苯磷酸二鈉比色法測定,分別用mg glucose 10 g-172 h-1,mg NH4-N g-124 h-1,μg phenol g-124 h-1表示；土壤微生物量碳和土壤微生物量氮均用氯仿熏蒸浸提法測定[25-26]。

1.4.4土壤樣品總DNA提取

土壤總DNA用試劑盒提取(FastDNA Spin Kit),PCR體系為50 μL,其中真菌進(jìn)行18SrRNA擴(kuò)增,引物為NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3′,GCFung 5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCC/GCCGCCCCCGCCC CATTCCCCGTTACCCGTTG- 3′,擴(kuò)增條件為94 ℃變性4 min；94 ℃30 s, 55.5 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min,35個循環(huán),最終再72℃延伸10 min；細(xì)菌進(jìn)行16SrRNA擴(kuò)增,引物為517R:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG- 3′, 357f-GC:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC/GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′, 擴(kuò)增條件為94 ℃變性4 min； 94 ℃1 min, 65 ℃退火1 min, 20個循環(huán),72℃延伸1 min。擴(kuò)增好的PCR樣品進(jìn)行DGGE,其中真菌DGGE使用濃度為20%—50%的變性膠,在60 ℃下電泳10 h,然后剝膠進(jìn)行EB染色,最后掃膠成像進(jìn)行后續(xù)分析；細(xì)菌DGGE使用濃度為35%—65%的變性膠,操作同真菌。

1.4 小麥產(chǎn)量測定

2018年6月15日小麥成熟時,沿各處理小區(qū)對角線取1 m2樣方,每個處理取三組重復(fù),一共15個樣方(5處理×3重復(fù))。實(shí)時分?jǐn)?shù)每個樣方中小麥總穗數(shù),隨后從每個樣方中隨機(jī)抽取30株小麥進(jìn)行穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì),通過加權(quán)平均值確定不同處理的小麥穗粒數(shù)。千粒重則是將樣方中所有小麥脫粒后帶回實(shí)驗(yàn)室,數(shù)小麥千粒于55 ℃烘箱進(jìn)行72 h烘干稱重所得。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,柱狀圖用origin 8.6軟件制作,DGGE聚類用GelCompar II軟件制作。文中數(shù)據(jù)通過單因素方差(one-way)分析,Turkey法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性,其中P< 0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同處理土壤化學(xué)特性的變化情況

本試驗(yàn)區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)含量整體偏低(低于10 g/kg)。S1時期,MOS+CMA+CF和MOS+CF處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著高于其他處理,CMA+CF處理的有機(jī)質(zhì)含量最低,僅有4.85 g/kg； S2時期,整體上各處理有機(jī)質(zhì)含量均有所提高,其中僅MOS+CF處理顯著高于CF和CMA+CF； S3時期,CMA+CF處理的有機(jī)質(zhì)含量仍然最低,MOS+CMA+CF、MOS+CF、CF和CK均顯著高于該處理,分別高出1.44倍、1.34倍、1.22倍和1.28倍。與S0相比,S3時期的MOS+CMA+CF和MOS+CF處理的有機(jī)質(zhì)含量基本保持不變,而CMA+CF和CF處理分別降低了29.41%和11.70%。相同小麥生長期內(nèi),各處理之間的TN含量無顯著差異；但不同小麥生長期之間,S2時期各處理的TN含量顯著高于其他生長期。S1時期,CMA+CF和MOS+CF處理的TP含量顯著高于其他處理；S2和S3時期,MOS+CMA+CF和CMA+CF處理的TP含量顯著高于其他處理,MOS+CF僅在S1時期提高后便保持較低水平。隨著小麥生長期的不同,整體上各處理土壤中AN含量顯著提高。S1和S2時期,MOS+CMA+CF和MOS+CF處理的AN含量顯著高于其他處理,CF處理最低；S3時期,MOS+CMA+CF處理的AN含量顯著高于其他處理；但與S1相比,CMA+CF的AN含量提高了2倍,而MOS+CMA+CF和MOS+CF處理則分別提高了1.44和1.38倍,CF處理的AN含量仍然是最低的。不同小麥生長期中,MOS+CMA+CF、CMA+CF和MOS+CF處理的AP含量均顯著高于其他處理,其中聯(lián)合處理的AP含量最高。此外,MOS+CMA+CF處理的AK含量在不同小麥生長期內(nèi)也是較高的(表2)。 pH顯著下降,緩解了田間土壤堿性環(huán)境,與CF相比,MOS+CMA+CF和CMA+CF這兩個處理的pH值已接近中性。

表2 不同處理土壤基本化學(xué)性質(zhì)

2.2 不同處理土壤物理特性變化情況

表3結(jié)果顯示,相同小麥生長期內(nèi),各處理土壤容重?zé)o顯著差異；但一個小麥生長季之后, MOS+CMA+CF、CMA+CF、MOS+CF均表現(xiàn)出容重下降的趨勢。該結(jié)果與土壤孔隙度結(jié)果相對應(yīng),即處理組的土壤空隙度到S3時期顯著提高,而表中只有CF處理的孔隙度發(fā)生下降。在小麥的三個時期中, CMA+CF和CF處理的CEC數(shù)值較小, MOS+CMA+CF和MOS+CF的CEC均顯著高于CMA+CF。

表3 不同處理土壤物理特性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

2.3 不同處理土壤生物學(xué)特性的變化情況

2.3.1土壤纖維素酶活

圖1中,隨著小麥生長,土壤纖維素酶活整體呈上升趨勢；與未處理前土壤比,S3時期各處理土壤纖維素酶活均顯著提高。S1時期,CMA+CF處理的土壤纖維素酶活最低,CF處理的土壤纖維素酶活顯著高于CMA+CF,其他處理之間無顯著差異； S2時期,CMA+CF和CK兩個處理的土壤纖維素酶活較低,MOS+CF處理的土壤纖維素酶活顯著高于CMA+CF和CK；S3時期,CMA+CF處理的土壤纖維素酶活最高并顯著高于CK。

圖1 不同處理土壤纖維素酶酶活Fig.1 Soil cellulase activity of the different treatmentsMOS+CMA+CF：土壤改良培肥基質(zhì)+有機(jī)物料腐熟劑+常規(guī)化肥,CMA+CF:有機(jī)物料腐熟劑+常規(guī)化肥,MOS+CF：土壤改良培肥基質(zhì)+常規(guī)化肥,CF：常規(guī)化肥,CK：不施肥空白對照。完全不同的大寫字母表示同一處理不同時期間差異顯著,完全不同的小寫字母表示同一時期不同處理間差異顯著(P < 0.05),圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3);S0: 處理前土壤; S1:小麥返青期土壤;S2: 小麥拔節(jié)孕穗期土壤;S3: 小麥成熟期土壤

2.3.2土壤脲酶酶活

圖2中,S1和S2時期(即小麥生長前期)土壤脲酶活性較低,且與S0相比無顯著差異。與其他時期相比,S3時期,除CK之外,其他處理的脲酶活性均顯著提高；而與CK相比,MOS+CMA+CF提高了56.87%、CMA+CF提高了37.29%、MOS+CF提高了29.15%。CF和CK處理的脲酶活性大小相似。雖然單獨(dú)施加土壤改良培肥基質(zhì)和單獨(dú)施加菌劑都能提高土壤脲酶活性,但二者聯(lián)合施加的效果更加顯著。

圖2 不同處理土壤脲酶酶活Fig.2 Soil urease activity of the different treatments

2.3.3土壤堿性磷酸酶酶活

圖3顯示,在小麥的整個生長時期中,土壤堿性磷酸酶活性呈先提高后下降的趨勢,且各處理之間無顯著差異。其中S1和S2時期,CK處理的土壤堿性磷酸酶活性較高,其次為MOS+CMA+CF和MOS+CF處理；S3時期,CMA+CF處理的土壤堿性磷酸酶活性較高,其次為MOS+CMA+CF處理。

圖3 不同處理土壤堿性磷酸酶酶活Fig.3 Soil alkaline phosphatase activity of the different treatments

2.3.4土壤微生物量碳和微生物量氮

土壤微生物量碳在不同小麥生長時期呈先下降后上升的趨勢(圖4)。S0時期各處理微生物量碳無顯著差異；S1時期,MOS+CF處理的微生物量碳含量顯著高于CK和CF處理,但與MOS+CMA+CF和CMA+CF之間無顯著差異；S2時期,與S1時期相比,整體上所有處理的土壤微生物量碳都出現(xiàn)下降；但MOS+CMA+CF、CMA+CF和MOS+CF處理均顯著高于CK和CF,其中MOS+CMA+CF > CMA+CF > MOS+CF；S3時期,與CK和CF相比,MOS+CMA+CF、 CMA+CF和MOS+CF處理的微生物量碳均顯著提高,其中CMA+CF處理的微生物量碳含量最高。CF和CK處理的土壤微生物量碳在整個小麥生長時期的土壤微生物量碳含量均較低。

微生物量氮在不同小麥生長時期中呈上升趨勢(圖4)；S3時期,不同處理的土壤微生物量氮含量與S0相比均顯著提高,僅CK無顯著變化。S2和S3時期,不同處理的MBN含量均有如下順序：MOS+CMA+CF > CMA+CF > MOS+CF > CF > CK；與CK相比,S3時期的MOS+CMA+CF、CMA+CF和MOS+CF處理分別提高了3.14倍、2.72倍和2.15倍。

2.3.5不同處理土壤微生物多樣性的變化情況

DGGE圖譜中(圖5)可以清晰地看出土壤中的細(xì)菌豐度顯著高于真菌。根據(jù)細(xì)菌和真菌條帶數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析顯示(圖8)：S1和S2時期,MOS+CMA+CF和MOS+CF處理的細(xì)菌條帶數(shù)目顯著高于CF和CK,但這兩個處理之間無顯著差異；S2和S3時期,CMA+CF處理的條帶數(shù)顯著低于S1時期；并且S3時期,各處理的細(xì)菌條帶數(shù)無顯著差異；此外,在整個小麥生長期間,CK處理土壤細(xì)菌DGGE條帶和深淺無顯著變化。S1時期,CMA+CF的真菌條帶數(shù)顯著高于CK,其他處理的真菌條帶數(shù)無顯著差異；S2時期,CMA+CF和CF處理的真菌條帶數(shù)顯著低于其他處理；S3時期,CMA+CF處理的真菌條帶數(shù)最少,MOS+CMA+CF和CF的真菌條帶數(shù)較多?？傊?MOS+CMA+CF和CK處理的真菌條帶數(shù)在整個小麥生長期無顯著變化,CMA+CF和MOS+CF處理的真菌條帶數(shù)在小麥生長后期顯著下降。

圖5 不同處理土壤細(xì)菌和真菌DGGE圖譜Fig.5 DGGE map of soil bacteria and fungi of the different treatments由于處理較多,時期較多,土壤樣品也較多,一張圖上無法放滿所有重復(fù),為了方便比較分析,將5個處理和3個時期(S1小麥返青期、S2小麥拔節(jié)孕穗期、S3小麥成熟期)放在一塊膠上,做三塊膠,每個樣三次生物學(xué)重復(fù),選擇其中一張作為代表進(jìn)行分析

接著對細(xì)菌和真菌的DGGE圖譜進(jìn)行相似性聚類分析(圖6和圖7)。真菌(圖6)聚類圖顯示,相同小麥生長期,不同處理之間的真菌相似性較差；而相同處理,不同小麥生長期中的真菌相似性較大,表明導(dǎo)致土壤真菌多樣性發(fā)生變化的主要原因在于處理不同,不同小麥的生長期對其影響不大。細(xì)菌聚類結(jié)果與真菌相似的是(圖7),相同小麥生長期,不同處理之間的細(xì)菌分別屬于三個不同分支,而相同處理不同小麥生長期表現(xiàn)為聚集現(xiàn)象,表明不同處理時對土壤細(xì)菌多樣性變化的影響較大。此外,MOS+CMA+CF和CF處理中土壤細(xì)菌組成相似,CMA+CF和MOS+CF處理的土壤細(xì)菌組成相似,CK的土壤細(xì)菌組成與其他處理均不相似。

圖6 真菌DGGE圖譜聚類分析Fig.6 DGGE cluster of soil fungi in the test area

圖7 細(xì)菌DGGE圖譜聚類分析Fig.7 DGGE cluster of soil bacteria in the test area

圖8 不同小麥生長期各處理真菌、細(xì)菌條帶數(shù)Fig.8 Number of fungi and bacterial bands of all treatments in different wheat growing stages

2.4 不同處理小麥成熟期農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量情況

表3顯示MOS+CMA+CF和CMA+CF單位面積平均小麥棵數(shù)較其他處理顯著增加；MOS+CMA+CF 的小麥平均株高也高于其他處理；與CK和CF相比,MOS+CMA+CF和CMA+CF處理的小麥平均穗粒數(shù)顯著提高。試驗(yàn)區(qū)各處理小麥產(chǎn)量順序?yàn)椋篗OS+CMA+CF > CMA+CF > MOS+CF > CF > CK；與CK相比,MOS+CMA+CF、CMA+CF、MOS+CF和CF 的小麥產(chǎn)量分別提高了149.29%、131.75%、105.58%和87.14%；而與CF相比,CK的產(chǎn)量下降了46.56%,MOS+CMA+CF、CMA+CF和MOS+CF的產(chǎn)量分別提高33.21%、23.84%和9.85%。

表4 不同處理小麥農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量

3 討論

3.1 不同處理對土壤理化性質(zhì)的影響

良好的土壤理化狀況是土壤肥力提升的重要基礎(chǔ)。不同的施肥措施帶來的培肥效果也有所差異。王芳[27]等人發(fā)現(xiàn)在渭北旱塬耕地上,秸稈中高量還田配施化肥對土壤培肥效果不如秸稈堆肥配施化肥,說明在常規(guī)化肥處理下,僅直接進(jìn)行秸稈還田對于地力提升、提高產(chǎn)量是不夠的。在秸稈全量還田的條件下,本文利用能高效降解還田秸稈的復(fù)合菌劑與化肥配施,結(jié)果表明到小麥成熟期,該處理顯著提高了土壤總氮和速效養(yǎng)分含量,這與之前的盆栽研究結(jié)果相一致[17],可能由于秸稈中豐富的碳源刺激了土壤微生物活性,加強(qiáng)了土壤微生物對養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[28]；但在小麥生長前期,復(fù)合菌劑中含豐富的微生物,為了滿足自身的生長繁殖,大量消耗了土壤中的即用養(yǎng)分[29],導(dǎo)致小麥生長前期土壤中的養(yǎng)分含量持續(xù)偏低。與復(fù)合菌劑加速還田秸稈降解不同,土壤改良培肥基質(zhì)(MOS)中為集中腐熟的混合有機(jī)物料,本身有機(jī)質(zhì)含量較高(55%),還含有促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的有益微生物菌種。與直接還田的秸稈相比,土壤微生物更傾向于優(yōu)先降解腐熟的有機(jī)物料,因此,整個小麥生長期間,MOS+CMA+CF和MOS+CF處理中土壤有機(jī)質(zhì)含量較高。土壤有機(jī)質(zhì)是表征土壤肥力的重要指標(biāo),也是土壤培肥的關(guān)鍵[30]。土壤改良培肥基質(zhì)與復(fù)合菌劑聯(lián)合配施,其土壤速效含量和有機(jī)質(zhì)含量顯著高于其他處理,表明該處理能在短期內(nèi)有效提高土壤有機(jī)質(zhì)含量,能更好地為作物提供速效養(yǎng)分。MOS和CMA中均含豐富的活性微生物,但這兩者菌群的主要功能有別：MOS中的微生物主要為固氮、解磷和解鉀菌；CMA中的微生物主要是有機(jī)物料降解菌。在配施化肥的情況下,復(fù)合菌劑優(yōu)先降解腐熟的有機(jī)物料,釋放養(yǎng)分的同時通過刺激有機(jī)質(zhì)分解菌群和促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解酶活性,出現(xiàn)了激發(fā)效應(yīng)[31],因此能夠在小麥生長期間有效提高土壤有機(jī)質(zhì)、總磷和速效養(yǎng)分[32]。土壤物理性質(zhì)的改善對于土壤肥力的提升大有裨益。MOS+CMA+CF、CMA+CF和MOS+CF處理土壤容重均表現(xiàn)出下降趨勢,表明土壤開始變得松軟。這一結(jié)果與土壤孔隙度結(jié)果相對應(yīng),即CF之外的其他處理土壤空隙度到小麥成熟期均顯著提高,只有單獨(dú)化肥處理的空隙度發(fā)生下降,表明長期施用化肥導(dǎo)致土壤板結(jié),這與王娟的研究結(jié)果相一致[33]。

3.2 不同處理對土壤酶活和微生物區(qū)系的影響

土壤酶主要是由土壤微生物分泌,在催化土壤多種生化反應(yīng)中扮演重要角色。錢海燕[7]等人研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物種類和豐度對土壤酶活影響較大,其中細(xì)菌豐度主要影響土壤脲酶活性。MOS+CMA+CF處理的土壤脲酶活性顯著提高,并且高于其他處理,這可能與該處理中較高的細(xì)菌多樣性和豐度有關(guān)。DGGE圖譜顯示,CMA+CF處理的真菌條帶數(shù)在小麥返青期顯著高于CK,但在小麥生長后期,該處理土壤中的真菌豐度顯著降低,可能是因?yàn)閺?fù)合菌劑中的微生物主要在作物生長早期發(fā)揮作用,這與于建光[34]等人的研究結(jié)果相一致。小麥生長后期,CMA+CF處理土壤纖維素酶活顯著提高,并且土壤微生物量碳含量高于其他處理,表明添加的復(fù)合菌劑在前期的生長適應(yīng)和培育后,在還田秸稈的刺激下能有效降解秸稈并提高土壤微生物活性,增加土壤碳庫,具有提高土壤有機(jī)碳的潛力[35]。由于MOS和CMA兩種產(chǎn)品的功能微生物群存在差異,MOS+CMA+CF處理使整個小麥生長過程中土壤纖維素酶活較低,有研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥處理降低了主要秸稈降解細(xì)菌門的豐度如厚壁菌門和酸桿菌門[36],這可能是導(dǎo)致聯(lián)合處理纖維素酶活低于其他處理的原因；而MOS+CMA+CF處理的土壤脲酶活性和土壤微生物量氮含量都是最高的,表明聯(lián)合處理土壤的養(yǎng)分循環(huán)較為活躍。土壤堿性磷酸酶活在各處理之間無顯著差異,僅隨小麥生長時期變化,這與馬曉霞[37]等人的研究結(jié)果一致。提高土壤微生物多樣性和豐度對于提高土壤肥力至關(guān)重要[38]。有研究表明長期化肥處理降低了土壤微生物多樣性[39],有機(jī)肥通過改變土壤條件而影響細(xì)菌群落[32]；說明土壤微生物發(fā)生改變與不同的施肥措施密切相關(guān),這與本研究的研究結(jié)果相一致。由于本文目前僅完成了一季處理,MOS+CMA+CF、CMA+CF和MOS+CF對土壤微生物的改變主要體現(xiàn)在微生物豐度和群落組成的差異上,至于土壤微生物多樣性的提高還需要繼續(xù)進(jìn)行相同處理再研究。有趣的是,CMA+CF在小麥成熟期的真菌條帶數(shù)顯著低于其他處理,對不同處理小麥赤霉病發(fā)病率和嘔吐毒素(DON)含量測定結(jié)果顯示(文中未提供數(shù)據(jù)),CMA+CF處理的小麥籽粒中嘔吐毒素濃度顯著低于CK和CF處理,而真菌種類減少可能有利于減輕作物土傳病害的發(fā)生[40]。

3.3 不同處理對小麥產(chǎn)量影響

有研究表明在施加化肥的基礎(chǔ)上增施有機(jī)肥或秸稈還田可以提高小麥產(chǎn)量[41],小麥理論產(chǎn)量結(jié)果顯示,與CF處理相比,MOS+CMA+CF產(chǎn)量提高了33.21%；CMA+CF緊跟其后,提高了23.84%。這可能是由于MOS+CMA+CF處理速效養(yǎng)分高,土壤脲酶活性強(qiáng),土壤N素的生物轉(zhuǎn)化過程強(qiáng),環(huán)境土壤物理環(huán)境提高,土壤微生物豐度提高綜合作用的結(jié)果[42]。CMA+CF處理的小麥產(chǎn)量僅次于聯(lián)合處理,由于兩種處理均有復(fù)合菌劑的添加,表明田間施加復(fù)合菌劑,能夠通過改善土壤理化狀況,提高土壤微生物活性,進(jìn)而提高了作物產(chǎn)量,這與他人的的研究結(jié)果一致[43-44]。MOS+CF處理的小麥產(chǎn)量沒有顯著高于CF處理的原因可能是MOS中的養(yǎng)分釋放需要時間,若長期施用,會有較好的結(jié)果[45-46]。

4 結(jié)論

總之,從本季田間處理結(jié)果來看,土壤改良培肥基質(zhì)和復(fù)合菌劑聯(lián)合配施對試驗(yàn)區(qū)土壤的培肥效果最好。但長期來看,進(jìn)行技術(shù)推廣,必要考慮經(jīng)濟(jì)效益,此時聯(lián)合配施的成本太高,收益較低,不利于推廣。反觀CMA+CF處理,其對試驗(yàn)區(qū)土壤的培肥效果在土壤纖維素酶活、土壤微生物量碳以及細(xì)菌多樣性中優(yōu)于聯(lián)合配施,小麥產(chǎn)量與聯(lián)合配施相比也無顯著差異,且復(fù)合菌劑用量較少,價格實(shí)惠。綜上所述,秸稈還田條件下,添加復(fù)合菌劑是最優(yōu)培肥措施,在中低產(chǎn)農(nóng)田中具有較高的推廣價值。