李甫 陳萌 吉建梅 張晞文 丁俊 黃金鑫 唐睿 蔡淦

摘要 基于芍藥甘草湯具有顯著改善Oddi括約肌功能障礙（SOD）患者腹痛的臨床療效和抑制自噬相關(guān)蛋白（GPR78、Beclin1）的工作基礎(chǔ)，結(jié)合Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）過度自噬將引起平滑肌收縮紊亂、進(jìn)一步導(dǎo)致SOD的研究進(jìn)展，探討芍藥甘草湯調(diào)節(jié)ICC自噬水平及治療SOD的分子藥理機(jī)制。首先，復(fù)制豚鼠SOD模型，觀察芍藥甘草湯對(duì)Oddi括約肌壓力、ICC自噬水平的影響;其次，嗎啡刺激誘導(dǎo)離體SOD模型，觀察芍藥甘草湯對(duì)Oddi括約肌肌條收縮曲線、自噬通路的影響;最后，分離原代ICC、構(gòu)建IRE1基因沉默或過表達(dá)載體、衣霉素刺激ICC建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，予不同濃度的芍藥甘草湯孵育，觀察ICC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平、自噬信號(hào)通路的變化。最終驗(yàn)證“芍藥甘草湯抑制IRE1/Beclin1信號(hào)通路，減輕ICC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的過度自噬，從而改善SOD平滑肌舒張效應(yīng)”的科學(xué)假說，為推進(jìn)中醫(yī)藥調(diào)節(jié)膽道動(dòng)力學(xué)的理論研究夯實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 芍藥甘草湯;Oddi括約肌功能障礙;Cajal間質(zhì)細(xì)胞;細(xì)胞自噬;IRE1/Beclin1通路

Study on the Mechanism of Shaoyao Gancao Decoction on Improving Sphincter Dysfunction

of Oddi by Regulating Autophagy of Interstitial Cells of Cajal

LI Fu， Chen Meng， JI Jianmei， ZHANG Xiwen， DING Jun， HUANG Jinxin， TANG Rui， CAI Gan

（Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

Abstract Based on the clinical effect of Shaoyao Gancao Decoction on abdominal pain of Sphincter of Oddi dysfunction （SOD） patients and the work basis of inhibiting autophagy related proteins （GPR78，Beclin1）， combined with the research progress that Cajal interstitial cells （ICC） over autophagy will cause smooth muscle contraction disorder and further lead to SOD research development， to explore the molecular pharmacological mechanism of Shaoyao Gancao Decoction on regulating the level of ICC autophagy and treating SOD. Firstly， the SOD model of guinea pig was duplicated， and the effects of Shaoyao Gancao Decoction on Oddi sphincter pressure and ICC autophagy level was observed; secondly， morphine stimulation induced SOD model in vitro， and the effects of Shaoyao Gancao Decoction on Oddi sphincter contraction curve and autophagy signal pathway of Oddi was observed; finally， we isolated the primary ICC， constructed the silencing or overexpression vector of IRE1 gene， and stimulated ICC by tunicamycin to establish the endoplasmic reticulum stress model， and incubated with different concentrations of Shaoyao Gancao Decoction to observe the changes of endoplasmic reticulum stress level and autophagy signal pathway in ICC. We verified the scientific hypothesis that Shaoyao Gancao Decoction can inhibit IRE1 / Beclin1 signal pathway， reduce excessive autophagy caused by ICC endoplasmic reticulum stress， so as to improve the relaxation effect of SOD smooth muscle， which will lay a solid foundation for the theoretical research of TCM regulating biliary dynamics.

Keywords Shaoyao Gancao Decoction; Oddi Sphincter dysfunction; Interstitial cells of Cajal; Cell Autophagy; IRE1/Beclin1 pathway

中圖分類號(hào)：R259文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.025

Oddi括約?。⊿phincter of Oddi，SO）是膽、胰與十二指腸連接部位的精密平滑肌裝置，在神經(jīng)、體液、局部反射的多重復(fù)雜調(diào)控下，形成時(shí)相性的移行復(fù)合運(yùn)動(dòng)（MMC），發(fā)揮控制膽汁和胰液排放、防止反流的“門戶”作用[1]。Oddi括約肌功能障礙（Sphincter of Oddi Dysfunction，SOD）是因SO舒張功能異常引起的一組疾病，臨床分為膽型和胰型2種，以膽型SOD常見，主要表現(xiàn)為上腹部疼痛發(fā)作30 min以上、足以影響日常活動(dòng)甚至到急診科就診，排便或改變體位、服用抗酸藥均不能緩解，可伴隨惡心、嘔吐、肝功能異常、膽管擴(kuò)張、膽管排空時(shí)間延長等表現(xiàn)[2]（羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)，2106）。SOD往往沒有器質(zhì)性改變證據(jù)、卻會(huì)給患者帶來持久難忍的困擾，嚴(yán)重時(shí)可繼發(fā)肝損、胰酶異常、甚至急性胰腺炎等，嚴(yán)重危害患者的生命健康[3]。因此，積極探索SOD的病理機(jī)制和藥物治療具有重要意義。

目前針對(duì)SOD的首選治療仍然是內(nèi)鏡下括約肌切開術(shù)（Endoscopic Sphincterotomy，EST），但EST僅對(duì)部分患者有效、且近期有并發(fā)出血和胰腺炎風(fēng)險(xiǎn)，手術(shù)引起SO永久性破壞可導(dǎo)致菌群易位、反流性膽管炎的后果[4]。內(nèi)鏡下局部注射內(nèi)毒毒素對(duì)SOD療效亦不確切[5]。內(nèi)科保守治療如鈣通道拮抗劑、硝酸酯類、胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)藥物等可能臨時(shí)減緩SO平滑肌痙攣，但實(shí)際療效沒有在足夠大的RCT研究中得到證實(shí)[6]。

事實(shí)上，SOD的形成涉及不同細(xì)胞-組織-器官間的功能失調(diào)，多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因或蛋白表達(dá)異常均可導(dǎo)致SO平滑肌舒縮功能紊亂。這提示我們，SOD病理機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞因子及其信號(hào)通路之間存在復(fù)雜聯(lián)系，基于單一靶點(diǎn)的治療方法對(duì)SOD效果欠佳。為此，我們從調(diào)控平滑肌細(xì)胞的Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）入手，分析芍藥甘草湯如何通過下調(diào)IRE1/Beclin1通路抑制ICC過度自噬，以促進(jìn)ICC功能而改善SOD的作用機(jī)制。

1 恢復(fù)和促進(jìn)ICC功能可能是治療SOD的重要途徑

慢波電位是消化道平滑肌特有的、細(xì)胞自發(fā)性節(jié)律性去極化形成的起步電變化，本身不能直接引起平滑肌收縮，但它是動(dòng)作電位產(chǎn)生的基礎(chǔ)。研究證明，ICC是消化道慢波電位的發(fā)生器，作為起搏細(xì)胞發(fā)揮著調(diào)控平滑肌動(dòng)力、推進(jìn)電活動(dòng)傳播、介導(dǎo)和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的重要作用[7-8]。

ICC廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的消化系統(tǒng)中，最初發(fā)現(xiàn)在胃、小腸、結(jié)腸等部位的平滑肌層內(nèi)以網(wǎng)絡(luò)狀廣泛分布，因其與固有神經(jīng)和平滑肌細(xì)胞之間的緊密連接，引起廣泛關(guān)注[9];深入研究發(fā)現(xiàn)，在胃腸道以外的膽囊、肝外膽道、Oddi括約肌、輸精管、膀胱、尿道中均有ICC的分布[10]。解剖學(xué)和電生理學(xué)研究均證明ICC是神經(jīng)元細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的重要紐帶，依靠特異性縫隙連接蛋白Cx43和Cx45將神經(jīng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞緊密結(jié)合[11]。盡管ICC細(xì)胞總量不足消化道肌膜細(xì)胞的10%，卻承擔(dān)著調(diào)控平滑肌基本電節(jié)律起搏和傳播的關(guān)鍵角色[12];如果說Oddi括約肌對(duì)于人類的膽汁和胰液排放是起“閥門”作用[1]，那么ICC可謂是開啟閥門的“鑰匙”。

ICC特異性表達(dá)一種酪氨酸激酶受體c-kit，可被干細(xì)胞生長因子（Stem Cell Factor，SCF）激活。SCF由胃腸神經(jīng)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞合成并分泌，作為c-kit的天然配體，可促進(jìn)c-kit受體的表達(dá)。當(dāng)c-kit與SCF結(jié)合后信號(hào)跨膜傳遞，一方面激活PI3K/Akt、RAS/ERK、JAK/STAT3種胞內(nèi)信號(hào)途徑，發(fā)揮調(diào)控ICC增殖分化及維持細(xì)胞表型的功能[13];另一方面，c-kit/SCF還能磷酸化ICC細(xì)胞膜表面SP、NK1、TRPV1等受體，增加ICC內(nèi)在起搏節(jié)律，調(diào)節(jié)SO平滑肌的收縮[14]。此外，ICC與平滑肌細(xì)胞均來源于同一種前體細(xì)胞，c-kit受體的表達(dá)與否決定該前體細(xì)胞的分化方向，即當(dāng)c-kit/SCF信號(hào)系統(tǒng)受損時(shí)，則該前體細(xì)胞因缺少c-kit受體刺激而分化為平滑肌細(xì)胞[15]，如此則ICC數(shù)量和功能缺失，最終導(dǎo)致SO網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響慢波的形成及信號(hào)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致消化道動(dòng)力障礙[16]。由此可見，c-kit/SCF表達(dá)對(duì)ICC的生長發(fā)育和維持SO動(dòng)力的穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的作用。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在肝外膽管、膽囊、Oddi括約肌等組織中存在c-kit表達(dá)陽性細(xì)胞，即ICC;而在多種膽道疾病如膽囊膽固醇結(jié)石、慢性膽囊炎、硬化性膽管炎、膽管囊腫等引發(fā)的SOD中，ICC的活性與功能隨著疾病的進(jìn)展而明顯下降，并同時(shí)伴有SCF表達(dá)降低[17-20]。我們前期通過建立比格犬膽囊切除模型，發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮（Nitric Oxide，NO）可以對(duì)犬SO產(chǎn)生顯著抑制作用[21-22]。事實(shí)上，NO發(fā)揮抑制作用的主要靶細(xì)胞就是ICC，以激活I(lǐng)CC內(nèi)可溶性環(huán)磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP）及cGMP依賴性蛋白激酶的方式，調(diào)節(jié)ICC內(nèi)鈣離子濃度及周圍平滑肌細(xì)胞的收縮活動(dòng)[23]。我們進(jìn)一步在透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)模型組的SO組織內(nèi)ICC細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞器減少、線粒體部分空泡狀或雙層膜結(jié)構(gòu)消失。因此，恢復(fù)并促進(jìn)ICC的數(shù)量和功能可能是防治SOD的重要途徑之一。圍繞這些問題，明確SOD形成過程中對(duì)ICC起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用而促進(jìn)SO舒張異常的關(guān)鍵因素，不僅可以提高ICC細(xì)胞活性及增強(qiáng)周圍平滑肌細(xì)胞的舒張效應(yīng)，更為我們進(jìn)一步治療SOD提供新的思路。

2 阻斷IRE1/Beclin1信號(hào)通路可減少ICC過度自噬、提高SO舒張效應(yīng)

ICC在消化道中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其數(shù)量處于動(dòng)態(tài)平衡之中，炎性反應(yīng)、手術(shù)應(yīng)激、激素水平改變等病理因素均可導(dǎo)致ICC數(shù)量減少或功能減退，發(fā)生多種消化動(dòng)力障礙性疾病[8，12]。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）引起細(xì)胞過度自噬是ICC數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)破壞的重要原因[24]。

ERS引起的細(xì)胞自噬是一把“雙刃劍”：外界刺激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)改變，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）或細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，都將激活自噬反應(yīng)，即通過胞內(nèi)溶酶體途徑消化自身受損的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊蛋白，從而減輕細(xì)胞損傷、維持細(xì)胞正常生理功能，可起到預(yù)防疾病的作用;然而ERS持續(xù)存在和增強(qiáng)的情況下，如機(jī)體受到外界電離輻射、缺血缺氧、驚厥等，過度自噬將引導(dǎo)細(xì)胞走向程序性死亡[25-26]，使得機(jī)體病變加重。

已有文獻(xiàn)表明，IRE1-TRAF2-JNK-Beclin1是ERS啟動(dòng)細(xì)胞過度自噬的重要信號(hào)通路：ERS時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的大量積累，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）與肌醇依賴性激酶-1（IRE1）解離，參與UPR反應(yīng)，GRP78被作為ERS發(fā)生的標(biāo)志性分子[25]。過多的錯(cuò)誤折疊蛋白，將激活自噬清除受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3B）始終位于自噬體膜上，被作為檢測(cè)自噬水平的特異性方法。IRE1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜蛋白，ERS時(shí)啟動(dòng)二聚化的IRE1，其Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）相互作用形成復(fù)合物，將信號(hào)傳遞至凋亡信號(hào)調(diào)控激酶I（ASK1），繼而激活c-Jun氨基端激酶（JNK），活化的JNK調(diào)節(jié)磷酸化的Bcl2釋放出游離的Beclin1進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。Beclin1是一種含BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl2互作蛋白，作為自噬基因，是自噬的直接執(zhí)行者[27-28]。

多項(xiàng)研究在消化動(dòng)力障礙疾病中證實(shí)了ICC數(shù)量或功能異常可能與ERS引發(fā)的ICC過度自噬有關(guān)：在功能性消化不良的大鼠模型中，ICC-MY內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，線粒體腫脹明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒脫落，可見大量自噬泡[29];在慢傳輸型便秘的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腸道ICC中ERS標(biāo)記分子GRP78、自噬相關(guān)Beclin1和LC3B表達(dá)上升、自噬泡水平較對(duì)照組明顯增高[30]。然而，并未在SOD疾病模型中找到ICC產(chǎn)生ERS繼而引發(fā)自噬的證據(jù)。據(jù)此，我們猜測(cè)，ERS引起細(xì)胞過度自噬是否是SOD中ICC數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)破壞的罪魁禍?zhǔn)祝?/p>

針對(duì)我們的猜測(cè)，我們觀察了比格犬膽囊切除模型中SO壓力明顯異常的對(duì)象，通過透射電鏡檢查SO平滑肌中ICC超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ICC與周圍平滑肌和神經(jīng)末梢之間縫隙連接減少，細(xì)胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張且脫顆粒明顯，自噬泡可見。同時(shí)我們?cè)趩岱却碳つM豚鼠SOD模型中以RT-PCR檢測(cè)SO標(biāo)本內(nèi)ERS自噬相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)GRP78、Beclin1表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，而相反的，c-kit和SCF表達(dá)則明顯下降。見圖1。這提示我們：ERS誘導(dǎo)的ICC過度自噬可能參與了SOD的發(fā)病過程，并影響到了SO內(nèi)ICC的數(shù)量和功能;ERS激活I(lǐng)RE1/Beclin1信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞過度自噬可能是導(dǎo)致ICC數(shù)量功能減退并引起SO動(dòng)力障礙性疾病的重要機(jī)制。因此，尋找針對(duì)ICC具有靶向調(diào)節(jié)的藥物，可以減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬引起的細(xì)胞程序性死亡，增強(qiáng)膽道動(dòng)力障礙病理狀態(tài)下ICC的數(shù)量和功能，可能成為治療SOD藥物研究的新方向。

3 探討芍藥甘草湯調(diào)節(jié)ICC活性的機(jī)制為治療SOD提供了新視角

SOD以腹痛為主要臨床表現(xiàn)，古代沒有SOD的病名，但類似的癥狀表現(xiàn)在“腹痛”等病證中，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其主要以少陽膽經(jīng)或厥陰肝經(jīng)病變?yōu)橹?。肝藏血，血為陰，故肝體為陰;肝主疏泄，內(nèi)寄相火，為風(fēng)木之臟，易動(dòng)風(fēng)化火，故肝之功能屬陽?！杜R證指南醫(yī)案·肝風(fēng)》：“故肝為風(fēng)木之臟，因有相火內(nèi)寄，體陰用陽，其性剛，主動(dòng)主升，全賴腎水以涵之，血液以濡之”。筋膜喜陽氣之溫煦、陰血之榮養(yǎng)，陰陽不足或陰陽失衡則筋脈橫解、攣急而痛。因此，治療當(dāng)以柔肝舒筋、緩急止痛為主。芍藥甘草湯最早見于漢代張仲景所著《傷寒論·辨太陽病脈證并治》，為張仲景治療諸痛的基礎(chǔ)方，亦是緩急止痛的常用藥對(duì)，僅《傷寒論》113方中就有24方使用了這一配伍。盡管僅有兩味藥，實(shí)則有“四兩撥千斤”之效。方中芍藥為君，偏于入里而瀉實(shí)，甘草為臣，偏于補(bǔ)中滋液。兩者配伍，張弛有道、柔肝緩急，具有柔肝舒筋、緩急止痛之功效，可糾正“體陰用陽”失衡所致的筋膜拘攣[31]。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，芍藥中主要成分芍藥甙可通過降低SO基礎(chǔ)壓發(fā)揮治療膽源性胰腺炎的作用[32]，并對(duì)高膽固醇血癥模型的SO肌環(huán)產(chǎn)生舒張作用[33];甘草的甲醇提取物FM100亦可鎮(zhèn)痛、抑制消化液分泌、減輕平滑肌痙攣[32]。

課題組針對(duì)本科室16例臨床診斷為Ⅱ型SOD的患者，采用自身前后對(duì)照發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯可以明顯降低VAS疼痛評(píng)分、ALT/AST、γ-GT以及ECT肝膽核素顯像的膽汁排泄時(shí)間;通過4～7個(gè)月的隨訪，最終僅2例（12.5%）患者行內(nèi)鏡下EST術(shù)。我們同時(shí)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯可顯著降低嗎啡誘導(dǎo)SOD模型豚鼠Oddi括約肌內(nèi)自噬相關(guān)GRP78、Beclin1基因表達(dá)，并提高了c-kit與SCF表達(dá)。見圖1。以上結(jié)果提示我們，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬相關(guān)IRE1-Beclin1信號(hào)通路，提高ICC數(shù)量活性，可能是芍藥甘草湯改善SO平滑肌舒張效應(yīng)的重要機(jī)制之一。

4 科學(xué)假說和主要研究內(nèi)容

基于ICC在消化動(dòng)力障礙疾病中的新進(jìn)展和芍藥甘草湯具有舒張SO效應(yīng)的工作基礎(chǔ)，我們提出科學(xué)假說：芍藥甘草湯抑制IRE1/Beclin1信號(hào)通路，減輕ICC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的過度自噬，從而改善SOD平滑肌舒張效應(yīng)。

為了驗(yàn)證上述假說，開展以下研究工作：復(fù)制豚鼠SOD模型，設(shè)IRE1抑制劑和c-kit特異性抑制劑為對(duì)照，予芍藥甘草湯干預(yù)治療，觀察芍藥甘草湯對(duì)Oddi括約肌壓力、ICC胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平、ICC自噬水平的影響，闡明芍藥甘草湯在體內(nèi)抑制ICC過度自噬而改善SOD的作用;分離正常豚鼠的Oddi括約肌肌環(huán)，嗎啡刺激誘導(dǎo)離體SOD模型，并同時(shí)予不同濃度的芍藥甘草湯加入肌槽中孵育，觀察芍藥甘草湯對(duì)Oddi括約肌肌條收縮曲線、ICC自噬水平的影響;分離正常豚鼠Oddi括約肌內(nèi)原代ICC，構(gòu)建IRE1基因沉默或過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至ICC，并予衣霉素刺激ICC建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，予不同濃度的芍藥甘草湯孵育，觀察ICC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平、自噬水平及IRE1/Beclin1信號(hào)通路的變化，解析芍藥甘草湯下調(diào)IRE1/Beclin1信號(hào)通路抑制ICC過度自噬的作用機(jī)制。見圖2。

通過本研究，將驗(yàn)證以上科學(xué)假說，闡明芍藥甘草湯改善SOD的作用機(jī)制，促進(jìn)中醫(yī)藥調(diào)節(jié)膽道動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)展。

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（2020-03-17收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81904017）;上海市科委“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域項(xiàng)目（19401972400）;上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)（PW2018E-03）

作者簡(jiǎn)介：李甫（1985.06—），男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：膽道動(dòng)力學(xué)的中西醫(yī)結(jié)合研究，E-mail：yclifu17@163.com

通信作者：蔡淦（1938.08—），男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：脾胃病的中西醫(yī)結(jié)合研究，E-mail：lwchenmeng@163.com