劉豫玥 閆楊楊 狄波 潘彥舒

摘要 目的：觀察清開靈注射液對大鼠腦梗死缺血性損傷急性期階段，不規(guī)則趨化因子（Fractalkine，FKN）的表達變化，探討清開靈注射液治療急性腦缺血的可能機制。方法：線栓法制備大鼠大腦中動脈永久性梗死模型（MCAO），隨機分為假手術組、模型組，清開靈注射液觀察組，TTC染色觀察大鼠治療前后腦組織梗死體積變化，同時采用蛋白芯片、ELISA和免疫組化法分別檢測腦脊液、外周血清及腦組織中FKN的表達水平。結果：腦組織TTC染色顯示模型組均出現明顯梗死灶，清開靈觀察組的梗死體積明顯縮減。與模型組比較，清開靈觀察組明顯下調病變局部腦組織的FKN（P<0.05），且能明顯上調血清中的FKN（P<0.05），同時觀察到其可上調腦脊液及全腦的FKN，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：清開靈注射液能縮小腦梗死體積，減輕急性腦缺血性損傷，其機制可能與調節(jié)FKN的表達有關。

關鍵詞 急性腦缺血;不規(guī)則趨化因子;清開靈注射液;大鼠

Effect of Qingkailing Injection on the Expression of Irregular Chemokines in Rats with Acute Cerebral Ischemia

LIU Yuyue1，YAN Yangyang2，DI Bo3，PAN Yanshu4

（1 Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2 Dongzhimen Hospital

Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100070，China; 3 China Academy of Chinese medical

Science，Beijing 100070，China; 4 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the expression changes of irregular chemokine （Fractalkine，FKN） in the acute phase of ischemic injury of rat cerebral infarction by Qingkailing Injection，and to explore the possible mechanism of Qingkailing Injection in the treatment of acute cerebral ischemia.Methods：A rat model of permanent middle cerebral artery infarction （MCAO） was prepared by suture method and randomly divided into a sham operation group，a model group，and a Qingkailing Injection treatment group.TTC staining was used to observe the changes in infarct volume of rat brain tissue before and after treatment.Protein chip，ELISA and immunohistochemistry were used to detect the expression level of FKN in cerebrospinal fluid，peripheral serum and brain tissue.Results：TTC staining of brain tissue showed that there were obvious infarcts in the model group，and the infarct volume in the Qingkailing treatment group was significantly reduced.Compared with the model group，the Qingkailing treatment group significantly down-regulated the FKN of the diseased local brain tissue （P<0.05），and significantly increased the FKN in the serum （P<0.05）.It was observed that it could up-regulate the cerebrospinal fluid and the whole brain FKN.But the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion：Qingkailing Injection can reduce the volume of cerebral infarction and reduce acute cerebral ischemic injury.The mechanism may be related to the regulation of FKN expression.

Keywords Acute cerebral ischemia; Fractalkine; Qingkailing Injection; Rat

中圖分類號：R285.5;R743文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.014

急性腦缺血損傷可繼發(fā)引起炎性反應及應答，產生的一系列炎性因子，其始動環(huán)節(jié)離不開一系列趨化因子的參與。不規(guī)則趨化因子（Fractalkine，FKN）是家族中較少的在中樞神經系統中組成性表達的趨化因子之一，近年來在急性腦缺血性損傷中的作用也逐漸受到關注。FKN主要集中分布在大腦皮質、海馬、尾狀殼核、丘腦、嗅球[1]，缺血再灌注損傷的腦海馬中FKN信號顯著增加，抑制CX3CR1受體功能，進一步激活更多的小膠質細胞及炎性反應因子表達水平，加重中樞神經炎性反應及認知損害[2]，而炎性反應的程度與急性腦缺血損傷程度密切相關。團隊前期實驗發(fā)現清開靈注射液能夠升高腦缺血大鼠的行為學神經功能評分，減輕腦組織病理損傷[3]，但其分子機制目前尚不是十分清楚，本研究觀察急性腦梗死引發(fā)的急性腦缺血損傷，檢測FKN表達變化，探討清開靈注射液治療急性腦缺血的作用機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SPF級8～9周齡Wistar大鼠，體質量（300±20）g，購于北京維通利華公司實驗動物中心[SCXK（京）2007-0001]，質量合格證號：0243109。所有動物在北京中醫(yī)藥大學動物實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在22 ℃，相對濕度60%，12 h光/暗周期，自由飲水。

1.1.2 藥物 清開靈注射液（北京中醫(yī)藥大學藥廠，批號：913204A）購于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，無菌生理鹽水（澤葉生物有限公司，貨號：ZY034）購于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院。

1.1.3 試劑與儀器 FKN ELISA試劑盒[EBSBL（美國），貨號：4431];FKN抗體[Bio Vision（美國），貨號：5088-100];Super Polymer-二步法IHC試劑盒（北京康為世紀生物科技公司，批號：CW0177），DAB顯色試劑盒（北京康為世紀生物科技，批號：CW0125）;大鼠細胞因子抗體芯片試劑盒[Ray Bio（美國），貨號：AAR-CYT-119]，BCA蛋白質定量試劑盒（上?？党缮铮枺篕TD3001）、磷酸緩沖液PBS（艾美捷科技有限公司，美國，貨號：PBL07-6X500ML），低溫離心機（Eppendorf公司，德國，型號：Centrifuge 5810 R）、光學顯微鏡（徠卡，德國，型號：DM1000）、組織切片機（徠卡，德國，型號：RM2235）、組織包埋機（徠卡，德國，型號：EG1150H+EG）、染色機（賽默飛，美國，型號：Gemini）、酶標儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號：MR-96A）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 健康雄性Wistar大鼠，共39只，平均分為假手術組、模型組、清開靈治療組。參照Zea Longa等[4]報道的方法進行改良，建立大鼠左側大腦半球永久性大腦中動脈栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型，Wistar大鼠采用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g體質量）腹腔注射進行麻醉，仰臥固定于手術板上，頸部偏左切開，逐層分離組織，暴露左側頸總動脈（Common Carotid Artery，CCA）、頸外動脈（External Carotid Artery，ECA）、頸內動脈（Internal Carotid Artery，ICA），永久結扎CCA近心端、ECA根部，微動脈夾暫時夾閉CCA的遠心端，在CCA結扎處遠心端剪一斜口，經此斜口插入頂端光滑成球面的直徑0.24 mm的尼龍線，經CCA分叉處通過ICA入顱至大腦前動脈（Anterior Cerebral Artery，ACA）的起始部，從而閉塞了大腦中動脈（Middle Cerebral Artery，MCA）的起始部，造成MCA供血相關區(qū)的梗死。尼龍線平均插入深度為（18.5±0.5）mm，結扎CCA遠心端以固定尼龍線和防止出血，減去尼龍繩尾端，逐層縫合組織，模擬急性腦缺血梗死。術后6 h參照Longa神經癥狀評分，選總分高于4分者的大鼠進行正式實驗。見表1。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 TTC法檢測腦梗死體積 術后24 h，假手術組取10只，模型組及清開靈觀察組各取13只大鼠新鮮大腦組織-20 ℃冰箱冷凍20 min后，冠狀面均勻切5片，將切片避光放入1%TTC染液中30 min，梗死部位呈白色，假手術組腦組織呈紅色。將切片依次擺好，拍照，采用Image-pro Plus 5.0軟件計算梗死體積。

1.2.2.2 蛋白芯片法和酶聯免疫法檢測FKN的濃度 術后24 h，假手術組取10只，模型組及清開靈觀察組各取13只抽取清亮腦脊液，混合，3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，蛋白芯片試劑盒檢測;腹主動脈取血5 mL，靜置30 min，析出血清，3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心15 min，取上清液，ELISA試劑盒檢測;新鮮缺血側大腦皮質，按重量體積比加冰冷生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，ELISA試劑盒檢測。

1.2.2.3 HE染色 各組動物術后24 h采用4%多聚甲醛經心臟灌流前固定，斷頭取腦后放入4%多聚甲醛中后固定24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，行石蠟包埋，制成5 μm厚度的大腦同一冠狀面石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，入Harris蘇木精染色5 min，自來水沖洗，50%的鹽酸乙醇分色30 s，水洗后酸化伊紅復染10 min，水洗、脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.2.4 免疫組化法測定FKN表達 石蠟切片制備同前。1）PBS（pH=7.4）沖洗3 min×3次;2）熱修復2 min;3）滴加3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化酶的活性;PBS沖洗3 min×3次;4）滴加稀釋好的第一抗體（濃度均為1∶200），4 ℃過夜;5）PBS沖洗3 min×3次，除去PBS液;6）滴加即用型Super Polymer試劑，室溫下孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3次;7）除去PBS液，滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min;8）自來水沖洗終止顯色反應，蘇木素輕度復染，水洗泛藍;9）梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。各組均設定一陰性對照組，PBS代替一抗，其余條件相同。

1.2.2.5 圖像分析 每張切片的梗死缺血皮層區(qū)隨機選取5個不重疊高倍視野，用顯微鏡圖像采集系統采集圖像，并用Image-pro Plus 5.0圖像分析軟件計數陽性細胞數，平均光密度來反映切片上缺血側皮層區(qū)陽性染色細胞數目。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件對研究數據進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，數據經正態(tài)性及方差性檢驗采用單因素方差分析，2組間比較采用LSD檢驗;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死體積檢測 TTC染色，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色。假手術組：大腦紅染，未發(fā)現任何白色梗死區(qū)域。模型組出現明顯白色梗死灶，主要集中在左側大腦中動脈供血區(qū)（左側前2/3腦區(qū)，外側面的大部分和島葉）;部分尾狀核，豆狀核、內囊膝和后肢的前部等部位也可見白色梗死區(qū)。給予清開靈注射液治療后，白色梗死灶體積明顯減?。≒<0.05）。見表2，圖1。

2.2 FKN濃度

2.2.1 腦脊液中FKN的濃度 蛋白芯片法檢測腦脊液中FKN的表達水平結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死缺血性損傷24 h后，腦脊液FKN濃度為假手術組的2.7倍;與相同時間點模型組比較，清開靈注射液治療后，腦脊液FKN濃度為模型組的1.05倍，是假手術組的2.85倍。見表3。

2.2.2 外周血清及腦組織中FKN的濃度 ELISA檢測外周血清及腦組織中FKN的表達水平結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死缺血性損傷24 h，外周血清中FKN表達水平明顯降低（P<0.05），與相同時間點模型組比較，清開靈注射液治療后，外周血FKN表達顯著升高，但是仍然低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死缺血性損傷24 h，腦組織中FKN表達水平降低，清開靈治療后，FKN表達水平提高，但是三者之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

2.3 清開靈注射液對MCAO大鼠腦組織的形態(tài)學的影響 HE染色光鏡下觀察，假手術組腦組織結構清晰，神經元排列層次清楚，核居中，核仁清晰可見，可見膠質細胞散在分布，腦內微血管管壁完整。模型組缺血測腦半球可見明顯的梗死灶，中心區(qū)神經元丟失，皮質區(qū)神經元排列紊亂，胞核和胞質界限模糊不清，核仁消失，膠質細胞也呈現不同程度水腫征象，腦內微血管管壁扭曲變形;清開靈觀察組梗死灶較模型組有明顯減小，神經元形態(tài)相對正常，間質炎性反應及水腫明顯減輕。見圖2。

2.4 清開靈注射液對大腦FKN表達的影響 免疫組化染色結果顯示：FKN主要存在大鼠腦組織神經元及膠質細胞胞質，急性腦缺血24 h，血管內皮細胞也可以看到陽性表達。進一步分析平均光密度，結果顯示，FKN在模型組的表達水平顯著高于假手術組（P<0.01），而清開靈觀察組的表達水平顯著低于模型組，高于假手術組（P<0.01）。見表5、圖3。

3 討論

FKN是趨化因子家族中較少的在中樞神經系統中組成性表達的趨化因子之一，它是一種跨膜糖蛋白，分為膜結合型和可溶性分子2種形式存在?；贔KN在神經系統中獨特的結構優(yōu)勢，近年來研究發(fā)現，FKN是中間神經元旁分泌途徑中的始動及中心環(huán)節(jié)，促進中間神經元向少突膠質細胞分化形成[5]，也是一個能預示炎性反應及血管受損程度的新靶點[6]，能參與介導大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）向缺血腦組織的定向遷移[7]。國內文獻報道也發(fā)現其能參與缺血性腦損傷的病理過程，在缺血性腦損傷中激活小膠質細胞，增加神經炎性反應[8]，更加證實了FKN在缺血性腦損傷中的作用。

本研究證實，正常腦組織FKN有一些組成性表達，主要分布在神經元及膠質細胞中，內皮細胞中未見明顯表達，同文獻報道一致[1];急性腦缺血24 h后，大鼠腦脊液中FKN表達含量升高，這與局部病變腦組織中FKN的表達趨勢一致。腦微血管內皮細胞上可見FKN陽性表達，受損神經元及膠質細胞中FKN的表達亦有增加，這種變化同文獻報道一致[2]。血清中FKN的變化同其在腦內的微環(huán)境中的變化趨勢相反，急性腦缺血24 h，血清中FKN的表達明顯減少。上述表達趨勢在全腦組織的檢測中并不顯著。提示生理狀態(tài)下，FKN主要由神經元表達，其受體在小膠質細胞有表達，急性腦缺血性損傷，血管內皮細胞具有分泌FKN的功能，推測其也是FKN表達活化的始動環(huán)節(jié)，神經元可能是通過內皮細胞分泌的信號因子刺激自身的FKN mRNA擴增，導致表達顯著增加，作為特異性抗體表達的小膠質細胞，則更多是通過與FKN結合導致表達含量增多。

急性腦缺血屬于中醫(yī)“中風病”范疇。王永炎院士在多年臨床實踐基礎上提出中風病“毒損腦絡”學說認為中風病與毒邪致病相似，中風后產生痰、熱、瘀等毒邪，入侵脈絡（包括浮絡、孫絡和纏絡），損傷絡中正氣，營衛(wèi)失和，毒邪內生，強調痰毒、熱毒及瘀毒互結，損傷腦絡的理論觀點。清開靈注射液來源于傳統安宮牛黃丸，由黃芩苷、梔子、金銀花、水牛角等組成，全方共奏清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅之功效。本團隊前期工作顯示清開靈注射液能顯著提高臨床治療急性腦缺血有效率，改善患者神經功能，降低血清炎性反應因子表達水平[9]，研究也發(fā)現清開靈注射液能明顯減輕急性腦出血模型大鼠腦組織水腫程度，減輕炎性反應，減少腦組織損傷，加快清除體內自由基的作用[10]，藥代動力學的研究也證實清開靈有效組分在大鼠腦缺血性損傷時代謝更加緩慢[11]。本研究發(fā)現，清開靈注射液能夠顯著下調急性腦缺血24 h后局灶病變腦組織FKN，上調血清FKN，縮小腦梗死體積，減輕腦損傷，提示清開靈注射液治療急性腦缺血可能與調節(jié)FKN在腦內微環(huán)境表達有關，為該藥臨床治療提供了生物學依據。

參考文獻

[1]Clark AK，Malcangio M.Fractalkine/CX3CR1 signaling during neuropathic pain[J].Front Cell Neurosci，2014，8（121）：1-7.

[2]Briones TL，Woods J，Wadowska M.Retraction Note：Chronic neuroinflammation and cognitive impairment following transient global cerebral ischemia：role of fractalkine/CX3CR1 signaling[J].J Neuroinflammation，2015，12（1）12：220.

[3]徐曉琳，馬重陽，王雪茜，等.牛黃中膽酸類成分改善大鼠腦缺血再灌注損傷及調節(jié)內質網應激作用比較[J].藥物評價研究，2017，40（1）：11-19.

[4]Longa EZ，Weinstein RP，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[5]Voronova A，Yuzwa SA，Wang BS，et al.Migrating Interneurons Secrete Fractalkine to Promote Oligodendrocyte Formation in the Developing Mammalian Brain[J].Neuron，2017，94（3）：500-516.

[6]Skoda M，Stangret A，Szukiewicz D.Fractalkine and placental growth factor：A duet of inflammation and angiogenesis in cardiovascular disorders[J].Cytokine Growth Factor Rev，2017，39：116-123.

[7]朱潔，周華東.Fractalkine/CX3CR1參與骨髓間充質干細胞向缺血腦組織定向遷移的實驗研究[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2014，26（3）：38-42.

[8]陳毓青，唐靈.趨化因子Fractalkine與缺血性腦卒中[J].華夏醫(yī)學，2015，28（5）：155-159.

[9]付虹，譚喜瑩，戎有和.缺血性腦卒中患者的治療藥物評價[J].實用藥物與臨床，2019，22（1）：69-74.

[10]冉會敏，羅倫.新清開靈注射液干預大鼠腦出血血腫周圍腦水腫的作用途徑研究[J].中藥材，2017，40（4）：945-948.

[11]劉學，蘇菊，杜鵬，等.UPLC-MS/MS分析注射用清開靈（凍干）中5種成分在正常大鼠和腦缺血大鼠體內的藥代動力學行為[J].中國實驗方劑學雜志，2019，4（21）：1-7.

（2019-06-12收稿 責任編輯：王楊）

基金項目：西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥區(qū)域協同創(chuàng)新中心第一批培育項目（2017XTCX014）——西藏產滇黃芩對腦缺氧損傷的保護作用研究;北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院1166·中青年專家項目（030903010302）

作者簡介：劉豫玥（1985.02—），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治中風病機制研究，E-mail：liuyuyue1985@126.com

通信作者：潘彥舒（1972.12—），女，博士，教授，研究方向：缺血性腦血管疾病的中西醫(yī)結合基礎研究，E-mail：13911209998@163.com