文│賈義平 李翠玲 樊祜卿(山東省菏澤市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)
趙魯菏(山東省菏澤市行政審批踏勘評(píng)審中心)
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病。該病具有持續(xù)性感染的特征,豬群一旦感染該病,PRRSV將長(zhǎng)時(shí)間存在于豬群中,引起母豬妊娠后期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等生殖障礙和新生及斷奶仔豬咳嗽、呼吸困難等呼吸癥狀。1996年,郭寶清等首次分離出我國(guó)PRRSV CH1-a毒株,隨后我國(guó)各地均有PRRSV的檢出,嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展,給各地養(yǎng)殖場(chǎng)戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。
防控PRRS重在接種疫苗達(dá)到免疫保護(hù)的效果,但PRRS核苷酸及氨基酸序列極易發(fā)生變異、重組,影響病毒的抗原性和致病力,尤其是PRRSV-ORF5基因變異頻率最高,造成多個(gè)譜系的流行,從而導(dǎo)致現(xiàn)有的商品化疫苗免疫效果不佳甚至免疫失敗,給防控PRRS帶來(lái)困難。本研究通過(guò)對(duì)山東菏澤某規(guī)模化豬場(chǎng)開(kāi)展PRRS血清流行病學(xué)調(diào)查以及對(duì)疑似患PRRS豬的肺和流產(chǎn)胎兒胎衣進(jìn)行病毒RNA的提取,RT-PCR擴(kuò)增PRRSV-ORF5,選取陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,與PRRSV代表毒株的序列進(jìn)行比較,給當(dāng)?shù)匾呙邕x擇提供理論基礎(chǔ),為當(dāng)?shù)卦摬〉姆揽靥峁﹨⒖家罁?jù)。
1.發(fā)病豬場(chǎng)概況。山東省菏澤市2000頭一點(diǎn)式自繁自養(yǎng)場(chǎng),配種、產(chǎn)房、保育、育肥各棟舍間距離較遠(yuǎn),中間無(wú)實(shí)體圍墻隔離。豬場(chǎng)圈舍設(shè)計(jì)為余氏豬場(chǎng)設(shè)計(jì),豬舍溫控全部采用全自動(dòng)控制,鋪設(shè)有地暖。采用4周批的批次化生產(chǎn)模式。130~150日齡育肥豬厭食、精神沉郁、呼吸困難、日增重不同程度減少,發(fā)病率30%左右,死亡率約4%;母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎現(xiàn)象,而后陸續(xù)轉(zhuǎn)到仔豬和保育舍。該場(chǎng)使用的疫苗毒株為某公司生產(chǎn)的CH1-R毒株疫苗,免疫程序?yàn)樯唐坟i21日齡肌內(nèi)注射免疫,后備豬21日齡和145日齡肌內(nèi)注射免疫,種豬普免2次/年。
2.樣品采集。采集疑似PRRS的豬肺和流產(chǎn)胎兒胎衣共6份樣品,置-80℃保存?zhèn)溆?。前腔靜脈采集表面健康豬只血液5~8毫升,自然靜置2小時(shí)凝固,析出血清,共采集240份(其中待配35份、妊娠35份、后備35份、仔豬50份、保育45份、育肥40份),-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.主要試劑及儀器。天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒,cador pathogen 96 QIAcube HT Kit,DNA擴(kuò)增試劑2×Taq Master Mix(Dye Plus),RNA擴(kuò)增試劑Primerscript one step RT-PCR Kit購(gòu)自天根生化科技有限公司,藍(lán)耳病毒抗體ELISA試劑盒(國(guó)產(chǎn))購(gòu)自科前生物,東勝基因擴(kuò)增儀,酶標(biāo)儀Thermo Fisher。
4.檢測(cè)方法。樣品檢測(cè)方法及結(jié)果判定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。
5.序列及數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用DNA Star軟件對(duì)ORF5基因序列與GeneBank上收錄的PRRSV-ORF5基因序列進(jìn)行同源性分析,并繪制進(jìn)化樹(shù)。PRRSV參考毒株為R98、CH1-a、CH1-R、VR2332、GD2008、HUN4、JXA1-P80、TJ-M、NADC30、JL580、GM2、GD-ZQ-2014。使用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.PRSSV-ORF5基因的擴(kuò)增結(jié)果。用PRRSV ORF5基因特異性引物對(duì)采集的6份疑似PRRS樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,經(jīng)檢測(cè)共4份病料為陽(yáng)性,擴(kuò)增出大小為447bp的ORF5基因片段,編號(hào)分別為SD-HZCW1(2泳道)、SD-HZCW2(4泳道)、SD-HZCW3(5泳道)、SD-HZCW4(6泳道)。結(jié)果見(jiàn)圖1。
◎圖1 PRRSV ORF5基因擴(kuò)增結(jié)果
2.PRSSV-ORF5基因序列分析。選取2個(gè)陽(yáng)性樣品(SDHZCW3、SD-HZCW4)進(jìn)行PRRSVORF5基因測(cè)序。結(jié)果表明,所測(cè)2株核苷酸序列同源性為100%。與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的參考毒株ORF5基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比(見(jiàn)表1),結(jié)果表明,所測(cè)樣品的ORF5基因與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道毒株的基因序列同源性為82.5%~99.5%。其中與R98同源性最高為99.5%,與GM2同源性最低為82.5%。
表1 PRRSV-ORF5基因同源性分析%
3.遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。運(yùn)用DNAstar軟件,將樣品SD-HZCW3的ORF5基因序列與國(guó)內(nèi)外參考毒株序列進(jìn)行比對(duì),繪制遺傳進(jìn)化關(guān)系圖(見(jiàn)圖2)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),與VR2332為代表的譜系5(亞系5.1)的親緣關(guān)系較近。
◎圖2 PRRSV ORF5基因核酸遺傳進(jìn)化樹(shù)
4.不同豬群抗體檢測(cè)結(jié)果。該場(chǎng)共檢測(cè)血清樣本240份,總體血清抗體陽(yáng)性率為81.18%。其中,抗體陽(yáng)性率,育肥豬最高為96%,其次是后備母豬為93.52%,仔豬最低為54.22%。血清抗體S/P值,育肥豬最高為2.1,其次是后備母豬為1.78,仔豬最低為1.18。血清抗體離散度,育肥豬最低為25.29%,其次是后備豬為33.48%,仔豬最高為50.26%。
PRRSV主要分為兩個(gè)基因型,分別以基因1型(Lelystad病毒)和基因2型(VR2332)為代表,1型主要分布在歐洲,2型主要分布在北美洲和亞洲。其中,亞洲2型PRRSV的出現(xiàn)主要是由北美譜系的引入導(dǎo)致,該譜系在我國(guó)發(fā)生多樣性變異,進(jìn)而導(dǎo)致該病的暴發(fā)和毒力增強(qiáng)。自1996年首次報(bào)道PRRSV以來(lái),我國(guó)PRRS的流行主要分為兩個(gè)階段,到2006年Tian T等分離出高致病性PRRSV之前為傳統(tǒng)PRRS流行階段,之后我國(guó)開(kāi)始進(jìn)入豬PRRS暴發(fā)時(shí)期,高致病性PRRSV成為我國(guó)流行的主要毒株。
Guo等發(fā)現(xiàn)我國(guó)流行的PRRSV美洲型分為4個(gè)譜系,分別是以類(lèi)NADC30為代表的譜系1,以GM2/QYYZ為代表的譜系3,以BJ-4/VR2332為代表的譜系5(亞系5.1)和以CH-1a like/JXA1-like為代表的譜系8(亞系8.1/亞系8.7)。在2013——2018年對(duì)山東省及周邊地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組遺傳進(jìn)化分析研究中共分離出20份毒株,其中13株為高致病性變異毒株,屬于亞系8.7;1株與CH-1a處于同一分支,屬于亞系8.1,6株與VR2332位于同一分支,屬于亞系5.1。本研究分析,該場(chǎng)毒株與經(jīng)典毒株R98的同源性最高為99.5%,屬于亞系5.1,其次為同一譜系的參考毒株VR2332,同源性為99.0%。另外,與經(jīng)典PVVSV疫苗毒株CH1-R的同源性為90.5%,與變異毒株GD2008、HUN4、JXA1-P80、TJ-M、GD-ZQ-2014的同源性為87%~87.5%,與JL580、NADC30的同源性分別為86%、86.3%,與重組毒株GM2的同源性最低為82.5%。
接種PRRSV疫苗能夠產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng),減輕臨床癥狀和減少病毒排泄量。但本研究發(fā)現(xiàn),該場(chǎng)母豬群血清抗體陽(yáng)性率為87.05%,離散度偏高為44.21%,抗體整齊度較差,尤其妊娠母豬離散度達(dá)到50%以上。這可能與該場(chǎng)使用的疫苗毒株同源性不高,疫苗難以做到有效保護(hù)有關(guān)。Chung等研究發(fā)現(xiàn),仔豬、斷奶豬感染PRRSV與母源抗體的減少有關(guān)。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示,仔豬和斷奶豬血清抗體陽(yáng)性率為僅為57.80%,這可能是由于仔豬、斷奶豬受到持續(xù)感染、母源抗體保護(hù)的時(shí)間減少,導(dǎo)致對(duì)仔豬的保護(hù)下降。
根據(jù)張東成等對(duì)發(fā)病豬群的3次(前驅(qū)期、明顯期、轉(zhuǎn)歸期)ELISA抗體水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)可以根據(jù)S/P值來(lái)判定感染豬群是活躍豬群,還是穩(wěn)定豬群(轉(zhuǎn)歸期及以后)。該場(chǎng)育肥豬血清抗體陽(yáng)性率為96%,而S/P值在2.0以上,可以推測(cè)該場(chǎng)育肥豬群為感染PRRSV的活躍豬群。當(dāng)育肥活躍豬群感染PRRSV后,仔豬和保育豬免疫保護(hù)水平不足,開(kāi)始感染,繼而出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、厭食、被毛粗亂、共濟(jì)失調(diào)等癥狀,母豬群出現(xiàn)不同程度的流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等繁殖障礙疾病。
本研究揭示了該場(chǎng)流行的毒株與R98同源性最高,與VR2332處于同一分支,屬于亞系5.1,與疫苗毒株CH1-R同源性偏低,豬群抗體水平偏低,保護(hù)力不足,需要通過(guò)選擇同源性高的疫苗毒株,并加強(qiáng)生物安全控制進(jìn)行系統(tǒng)性防控。