吉 潔，于海濤，周春剛，唐 穎，唐苗苗，周倩倩，徐新榮

0引言

流行病學調查顯示，氧化應激與干性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)密切相關。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)體系和視網(wǎng)膜光感受器是人體平均耗氧最多的環(huán)境之一，對氧化應激非常敏感。干性ARMD中，脂褐質及其他代謝產(chǎn)物堆積在RPE與脈絡膜之間，補體系統(tǒng)及炎癥反應被激活，氧化應激反應加速，破壞了正常視網(wǎng)膜內的抗氧化修復系統(tǒng)。RPE因氧化損傷造成活性氧化產(chǎn)物生成增多是干性ARMD發(fā)生發(fā)展的重要原因[1]。

核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一種重要的氧化還原轉錄因子，敏感性強，細胞內Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶通過其誘導調控表達，使機體的氧化應激狀態(tài)得到改善，穩(wěn)定細胞的氧化還原狀態(tài)，促進細胞存活。當細胞受到活性氧或親電體的攻擊時，Nrf2從Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(kelch-like ECH associated protein-1，Keap1)中解離，迅速進入細胞核與小Maf蛋白結合形成異二聚體，再結合抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)，轉錄激活受Nrf2調控的抗氧化酶[醌氧化還原酶-1(quinone oxidoreductase-1，NQO-1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)]基因表達[2]。Nrf2/ARE是人體最為重要的抗氧化應激防御性轉導通路[3]。

柚皮素(naringenin，Nar)是一種二氫黃酮類單體化合物，取自蕓香科植物柚，具有抗氧化、抗炎、抗癌、解痙和利膽作用，能夠清除活性氧自由基從而減輕氧化應激反應[4]。為了提高柚皮素的生物利用度，本研究參考文獻制備了柚皮素磷脂復合物(naringin phospholipid complex，NPC)，觀察其對氧化損傷ARPE-19細胞內氧化指標、抗氧化指標含量的影響和對Nrf2/ARE抗氧化應激通路中Nrf2及其下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶表達的影響，實驗過程及結果報告如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19細胞)購自美國模式培養(yǎng)物研究所(ATCC公司)。

1.1.2主要實驗試劑和儀器細胞總RNA快速提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；逆轉錄試劑盒(賽默飛世爾公司)；PCR檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、ECL Plus發(fā)光試劑盒、Western blot及PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、IP細胞裂解液(碧云天公司)；Nrf2、GCL、NQO-1、HO-1抗體(Abcam，ab62352、ab124827、ab28947、ab13243)。微量加樣器(德國Eppendorf公司)；OD值測量儀(高精度分光光度計)(Merinton，SMA4000)；熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems，ABI StepOne Plus)；臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀器廠，H1650R)；酶標儀SPECTRA max Plus 384(Molecular Devices公司)；凝膠成像儀、電泳系統(tǒng)(Bio-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1 NPC制備參考文獻[5]中根據(jù)單因素試驗確定的磷脂復合物最佳制作工藝制備NPC。將質量比為1∶2的柚皮素和大豆磷脂溶解于適量乙酸乙酯中，柚皮素質量濃度為5g/L。反應溫度40℃，恒溫攪拌2h。反應結束減壓后除去乙酸乙酯。洗滌真空干燥12h即得到NPC。研磨后過100目篩，放置在干燥器中備用。

1.2.2細胞轉染按照Lipofectamine 2000 Reagent試劑說明書進行細胞轉染。將對數(shù)期生長的APRE-19細胞在轉染前1d以每孔3×105個細胞接種入6孔板中，放置在完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清-RPMI DMEM)中，在5% CO2飽和度培養(yǎng)箱，恒溫37℃過夜培養(yǎng)20～24h。吸去完全培養(yǎng)基，在37℃下預熱PBS和無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，分別用之洗滌細胞。145μL Opti-MEM培養(yǎng)基中加入5μL轉染試劑(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)，將槍頭混合均勻，標為混合物1。150μL Opti-MEM培養(yǎng)基中放入Nrf2-siRNA(GUUUUUCCAGCUCATACUCTT)7.8μL，輕輕稀釋混勻，標為混合物2?；旌衔?中加入混合物2，保持室溫，靜置20min使形成DNA-脂質體復合物。用Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌細胞1次，無血清和抗生素的RPMI DMEM培養(yǎng)基1.7mL加入到每孔中，300μL上述混合物再逐滴加入，輕輕混勻后5% CO2飽和度培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48h。

1.2.3模型制備及細胞分組在無菌培養(yǎng)瓶中接種ARPE-19細胞，加入適量DMEM培養(yǎng)液后，置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。收集對數(shù)期細胞，每孔加入200μL培養(yǎng)基。鋪板使細胞密度為4 000個/孔，邊緣用無菌PBS填充，培養(yǎng)箱內孵育，至細胞單層鋪滿孔底。將ARPE-19細胞分為溶媒組、模型組、Nrf2-siRNA組、柚皮素組、NPC組、Nrf2-siRNA+柚皮素組、Nrf2-siRNA+NPC組。溶媒組：用二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物溶解；模型組：加入200μmol/L叔丁基氫過氧化物(t-BHP)培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內孵育24h；Nrf2-siRNA組：針對Nrf2基因進行細胞轉染；柚皮素組：加入200μmol/L柚皮素培養(yǎng)基預處理24h后再加入200μmol/L t-BHP培養(yǎng)基孵育24h；NPC組：加入200μmol/L NPC培養(yǎng)基預處理24h后再加入200μmol/L t-BHP培養(yǎng)基孵育24h；Nrf2-siRNA+柚皮素組：APRE-19細胞加入200μmol/L柚皮素培養(yǎng)基預處理24h，Nrf2基因干擾6h后再加入200μmol/L t-BHP培養(yǎng)基孵育24h；Nrf2-siRNA+NPC組：APRE-19細胞加入200μmol/L NPC培養(yǎng)基預處理24h，Nrf2基因干擾6h后再加入200μmol/L t-BHP培養(yǎng)基孵育24h。

1.2.4觀察指標

1.2.4.1細胞內氧化應激水平測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平檢測：取適量10nmol/mg標準品用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50μmol/L，加入0.1mL上述不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0.1mL各組APRE-19細胞用于測定；隨后加入0.2mL MDA檢測工作液，混勻后，100℃加熱15min。水浴冷卻至室溫，1 000g室溫離心10min。取200μL上清液加入到96孔板中，用酶標儀測定波長532nm的吸光度?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)水平檢測：裝載DCFH-DA探針于培養(yǎng)基中，工作濃度為10μmol/L，37℃孵育30min。胰酶消化細胞2min，加入培養(yǎng)基終止消化，600g離心5min收集各組ARPE-19細胞，用預冷的1×PBS洗2次，離心收集細胞沉淀物，將離心好的細胞用PBS重懸，用酶標儀檢測525nm波長的吸光度。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)水平檢測：胰酶消化各組ARPE-19細胞2min，加入培養(yǎng)基終止消化，600g離心5min收集細胞，加入顯色劑混勻，室溫反應10min，SOD酶標儀測550nm波長的吸光度，T-AOC酶標儀測520nm波長的吸光度。分別計算MDA、ROS、SOD、T-AOC水平。

1.2.4.2 RT-PCR檢測胰酶消化終止后收集各組細胞，裂解。用氯仿、Trizol、無水乙醇等試劑離心柱法提取總RNA，計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質量。參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，根據(jù)RNA OD值報告的濃度值計算ddH2O量，稀釋RT產(chǎn)物到一致水平，進行PCR擴增。引物序列見表1。內參基因為β-actin，按照2-ΔΔCt法對mRNA的表達進行相對定量分析。

表1 引物序列

1.2.4.3 Western blot檢測上述細胞用PBS洗滌，收集裂解后，于4℃下12 000r/min離心10min，轉移上清到新的離心管中，-70℃保存。BCA法測定蛋白濃度。10%分離膠，5%濃縮膠，加入5×上樣緩沖液混勻，上樣量為每泳道30μg，電泳。轉膜、封閉。轉移PVDF膜到含有一抗(1∶1 000)的小袋中，保持4℃孵育過夜后再轉移到含二抗(1∶5 000)的玻璃平皿中，室溫下孵育2h。內參為β-actin。PVDF膜表面加ECL試劑，以化學光敏模式在凝膠成像分析儀中曝光顯影。

2結果

2.1柚皮素及其磷脂復合物對細胞內氧化應激水平的影響柚皮素、NPC對細胞內MDA、ROS、SOD、T-AOC水平的影響檢測結果見表2。模型組較溶媒組細胞內MDA、ROS水平均明顯提高，SOD、T-AOC水平均明顯降低。NPC組較柚皮素組、Nrf2-siRNA+NPC組較Nrf2-siRNA+柚皮素組細胞內MDA、ROS水平均明顯降低，SOD、T-AOC水平均明顯提高。

表2 柚皮素及其磷脂復合物對細胞內氧化應激水平的影響 (n=5，nmol/mg)

2.2柚皮素及其磷脂復合物對細胞內Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA表達的影響柚皮素、NPC對細胞內Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA表達的影響檢測結果見圖1。各組細胞內Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(F=871723.636、178297.326、211246.177、279859.963，均P<0.01)。與溶媒組相比，其余6組細胞內4種基因相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，柚皮素組和NPC組細胞內4種基因表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與柚皮素組相比，NPC組細胞內4種基因相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與Nrf2-siRNA組相比，Nrf2-siRNA+柚皮素組和Nrf2-siRNA+NPC組細胞內4種基因相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與Nrf2-siRNA+柚皮素組相比，Nrf2-siRNA+NPC組細胞內4種基因相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 柚皮素及其磷脂復合物對細胞內Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA表達的影響 A:Nrf2; B:HO-1; C:NQO-1; D:GCL。bP<0.01 vs 溶媒組；dP<0.01 vs 模型組；fP<0.01 vs 柚皮素組；hP<0.01 vs Nrf2-siRNA組；jP<0.01 vs Nrf2-siRNA+柚皮素組。

2.3柚皮素及其磷脂復合物對細胞內Nrf2、NQO-1、HO-1、GCL蛋白表達的影響柚皮素、NPC對細胞內Nrf2、NQO-1、HO-1、GCL蛋白表達的影響檢測結果見圖2、3。各組細胞內Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達量差異均有統(tǒng)計學意義(F=64.852、123.594、26.617、51.759，均P<0.01)。與溶媒組相比，其余6組細胞內4種蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，柚皮素組和NPC組細胞內4種蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與柚皮素組相比，NPC組細胞內4種蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與Nrf2-siRNA組相比，Nrf2-siRNA+NPC組細胞內4種蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Nrf2-siRNA組相比，Nrf2-siRNA+柚皮素組細胞內GCL蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)，其余3種蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(PNrf2=0.069，PHO-1=0.174，PNQO-1=0.817)；與Nrf2-siRNA+柚皮素組相比，Nrf2-siRNA+NPC組細胞內4種蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(PNrf2=0.009，PHO-1<0.01，PGCL<0.01，PNQO-1=0.021)。

圖2 Western blot檢測Nrf2、NQO-1、HO-1、GCL蛋白表達。

3討論

目前對于干性ARMD尚無有效的治療方法，其發(fā)病機制尚不明確，但已有研究表明，氧化應激損傷是干性ARMD發(fā)生發(fā)展的重要原因。Abokyi等[6]認為視網(wǎng)膜氧化損傷在ARMD形成途徑中起中心作用。孫子雯等[7]就氧化應激介導ARMD的發(fā)生機制及ARMD抗氧化劑的應用作過簡要綜述。臨床和基礎研究通過使用維生素、多不飽和脂肪酸和其他植物提取的抗氧化物進行治療，對抑制干性ARMD的晚期發(fā)展有明顯效果。年齡相關性眼病研究組(Age-Related Eye Disease Study，AREDS)證實，抗氧化劑的使用可以降低25%晚期ARMD在5a內進展的風險，降低19%中度視力下降的風險[8]。

Nrf2抗氧化應激通路在ARMD的發(fā)病過程中具有重要作用，Zhao等[9]研究顯示，Nrf2缺陷小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)了ARMD樣改變。既往研究證實，激活Nrf2通路對氧化損傷的RPE細胞具有保護作用[10-11]。 陳婷妍等[12]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過Nrf2/Keap1/ARE通路改善視網(wǎng)膜光損傷后的氧化應激狀態(tài)，保護視網(wǎng)膜功能，對ARMD具有保護作用。

圖3 柚皮素及其磷脂復合物對細胞Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表達的影響 A:Nrf2; B:HO-1; C:NQO-1; D:GCL。aP<0.05 vs 溶媒組；dP<0.01 vs 模型組；fP<0.01 vs 柚皮素組；gP<0.05 vs Nrf2-siRNA組；iP<0.05，jP<0.05 vs Nrf2-siRNA+柚皮素組。

柚皮素具有抗氧化作用，但柚皮素難溶于水，生物利用度低，其磷脂復合物能明顯改善原藥的理化性質，增強藥理作用。楊艷等[13]研究顯示磷脂復合物中磷脂可顯著提高槲皮素在水中的溶解度，約為原藥的3倍，磷脂復合物和物理混合物均可顯著提高槲皮素在氯仿中的溶解度，前者作用更明顯。

ROS是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生，可以氧化細胞膜上的不飽和脂肪酸，最終的反應產(chǎn)物是MDA。脂質過氧化過程中重要的反應產(chǎn)物之一是MDA，可通過測定MDA的含量了解脂質過氧化的程度。ROS和MDA是兩種有代表性的氧化指標。SOD是機體內一種重要的抗氧化酶，是重要的ROS清除劑，體內的超氧陰離子、氧自由基及脂質過氧化物可以被消除。SOD可以防止和減輕機體組分在分子水平、細胞水平受到過氧化損傷。T-AOC是反映機體整體抗氧化水平高低的重要指標。SOD和T-AOC是兩種具有代表性的抗氧化指標。本研究中模型組與溶媒組比較，細胞內MDA、ROS含量明顯增加，SOD、T-AOC水平明顯降低，NPC較柚皮素能明顯降低ARPE-19細胞內MDA、ROS的含量，明顯提高細胞內SOD、T-AOC水平。

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)可以通過多種不同轉染技術導入細胞內，以單鏈形式與外源基因表達的mRNA相結合，并誘導相應mRNA降解，敲弱特定基因的功效。經(jīng)過適當剪裁的siRNA，可以利用它的互補性來標定已知序列的基因，所以在基因功能與藥物目標的研究中siRNA成為了一項重要工具。本研究運用siRNA干擾技術抑制ARPE-19細胞Nrf2基因表達，觀察柚皮素及其磷脂復合物對Nrf2/ARE抗氧化應激通路的作用。楊艷等[13]在研究槲皮素磷脂復合物對氧化損傷ARPE-19細胞的保護作用的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素磷脂復合物能顯著提高原藥的生物活性，對氧化損傷ARPE-19細胞比槲皮素起到更好的保護作用。本研究結果顯示，ARPE-19細胞受到t-BHP氧化應激損傷后，Nrf2由細胞質進入細胞核，與ARE結合，啟動抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶靶基因的轉錄激活，Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL轉錄均升高，Nrf2-siRNA組較t-BHP模型組均下降；柚皮素和NPC預保護ARPE-19細胞后，4種基因表達水平較模型組和Nrf2-siRNA組均升高；Nrf2-siRNA+柚皮素組較Nrf2-siRNA組Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達無顯著差異；Nrf2-siRNA+NPC組較Nrf2-siRNA組4種蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義，NPC作用明顯強于柚皮素。

綜上所述，NPC增強了原藥的藥理作用，提高了柚皮素的生物利用度，其通過激活Nrf2/ARE抗氧化應激通路上調Nrf2及其下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達，對氧化損傷ARPE-19細胞起到更好的保護作用。