沈金燦，黃昌雄，肖陳貴，吳章杰，趙鳳娟，康海寧，岳振峰,*

（1.深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；2.深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518045）

松香是以松樹的含油樹脂為原料加工得到的非揮發(fā)性天然樹脂，廣泛應(yīng)用于藥品、食品包裝材料、造紙、油漆涂料、油墨等領(lǐng)域[1]。松香酸和脫氫松香酸是松香的主要成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，毒理學(xué)研究表明松香酸可導(dǎo)致人體肺泡上皮細(xì)胞溶解，脫氫松香酸對人體紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞有毒性作用[2]。松香具有良好的黏附性，曾被用于畜禽屠宰加工的二次脫毛工序。2009年，我國明令禁止在畜禽屠宰中使用松香脫毛，但畜禽屠宰加工時違法使用松香脫毛的現(xiàn)象依然時有報道。使用松香進(jìn)行脫毛時，松香主要成分松香酸和脫氫松香酸，通過畜禽胴體表皮毛孔殘留在表皮組織中[3]。消費(fèi)者食用含有松香成分殘留的食品，可能會對健康帶來安全隱患。

圖1 松香酸（A）及脫氫松香酸（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of abietic acid (A) and dehydrogenated abietic acid (B)

有關(guān)松香酸和脫氫松香酸的分析方法主要有薄層色譜[4]、氣相色譜法[5-6]、氣相色譜法-質(zhì)譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-17]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[18-19]、飛行時間質(zhì)譜法[20]等，分析的對象主要包括中藥材、植物提取物、化妝品、動物表皮等。畜禽肉制品中松香殘留的安全隱患已引起關(guān)注，張?zhí)K珍等[9-10]分別研究了鴨表皮組織中松香酸及脫氫樅酸的測定，在多個樣本中檢測出松香酸和脫氫樅酸；杜盼盼等[21]在部分生熟豬蹄（耳）制品檢出脫氫松香酸。目前已報道的畜禽肉制品測定方法以液相色譜法為主[9-10,21]，方法靈敏度較低、抗干擾能力不強(qiáng)；并且方法僅針對松香酸或脫氫松香酸單個組分進(jìn)行測定，難以對松香違規(guī)使用進(jìn)行綜合評判。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[22-26]，適用于動物組織中痕量松香酸及脫氫松香酸的快速、準(zhǔn)確分析。基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的畜禽組織中松香酸和脫氫松香酸的同時測定未見報道。本實(shí)驗(yàn)建立了畜禽表皮組織中松香酸和脫氫松香酸殘留高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，對市場上銷售的鴨、鵝、豬頭表皮中的松香酸和脫氫松香酸含量進(jìn)行分析，并考察松香及松香甘油酯模擬脫毛鴨皮中的松香酸和脫氫松香酸殘留，旨在為打擊非法使用工業(yè)松香拔毛行為提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰性和陽性樣本，肉鴨購自深圳市農(nóng)貿(mào)市場，宰殺后分別采用人工脫毛（陰性樣本）、松香脫毛（陽性樣本）及松香甘油酯脫毛（陽性樣本）；實(shí)際分析用鴨、鵝、豬頭皮樣本分別來源于深圳地區(qū)超市和農(nóng)貿(mào)市場，其中鴨、鵝為生肉制品，豬頭皮為熟肉制品。所有樣本取表皮組織，切碎，混合均勻，于－20 ℃保存。

松香酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度88.2%）、乙酸銨（色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度90%） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merk公司；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Integral 10純水儀 美國Millipore公司；C18固相萃取小柱（200 mg，6 mL）、固相萃取裝置美國Agilent公司；HLB固相萃取小柱（200 mg，6 mL）美國Waters公司；LCMS-8050液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 日本島津公司；Reax Top旋渦振蕩器 德國Heidolph公司；S90H超聲波清洗儀 德國Elmasonic公司；3K18高速冷凍離心機(jī)德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液、混合標(biāo)準(zhǔn)中間液以及工作溶液配制

分別稱取適量松香酸和脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取100 μL松香酸和250 μL脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇定容至10 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。采用空白樣品提取液作為基質(zhì)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液中松香酸的質(zhì)量濃度為0、2、4、10、20、40、100 μg/L，脫氫松香酸的質(zhì)量濃度為0、5、10、25、50、100、250 μg/L。

1.3.2 樣品處理

稱取2 g（準(zhǔn)確至0.001 g）混合均勻的樣品于15 mL離心管中，加入5 mL乙腈，旋渦振蕩后超聲波水浴振蕩提取10 min，10 ℃、9 000 r/min離心5 min，取出上清液于10 mL容量瓶中；再加入4 mL乙腈，重復(fù)以上提取步驟，合并上清液，用乙腈定容至10 mL。準(zhǔn)確吸取5.00 mL提取液，加入8 mL水混勻，通過HLB SPE小柱（預(yù)先用3 mL乙腈、3 mL水活化），用3 mL 40%體積分?jǐn)?shù)乙腈溶液淋洗，抽干，最后用2.00 mL甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待HPLC-MS/MS分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Shim-park GIST C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流動相：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇溶液；采用等度洗脫，0～5 min保持90% B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式；分辨率：單位分辨率；脫溶劑溫度526 ℃；噴霧電壓4.0 kV；離子傳輸管溫度250 ℃；霧化器氣流速3.0 L/min；干燥器氣流速3.0 L/min；加熱氣流速15.0 L/min；接口溫度300 ℃；加熱塊溫度400 ℃；碰撞氣：氬氣；碰撞氣壓力270 kPa；在正離子監(jiān)測模式下，分別對碰撞能量和選擇離子等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取碰撞后所得豐度較高的2 個子離子作為特征離子，選擇的離子對及對應(yīng)參數(shù)見表1。

表1 松香酸和脫氫松香酸的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for abietic acid and dehydrogenated abietic acid

1.3.5 精密度及回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2 g混合均勻的陰性樣品于15 mL離心管中，分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得松香酸添加量為5、10、50 μg/kg，脫氫松香酸添加量為20、40、200 μg/kg，在室溫下放置30 min。按照1.3.1節(jié)樣本處理方法進(jìn)行松香酸和脫氫松香酸的提取，最后用HPLC-MS/MS儀進(jìn)行測定，以測定的化合物含量和添加量的比值計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜及色譜條件優(yōu)化

松香酸和脫氫松香酸均為有機(jī)酸，質(zhì)譜分析常采用電噴霧負(fù)離子進(jìn)行檢測[16]。然而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用電噴霧負(fù)離子進(jìn)行檢測時，雖然母離子有較強(qiáng)信號，卻無法得到有效的碎片離子，因而最終無法采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行檢測，難以進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確測定，因此實(shí)驗(yàn)嘗試用電噴霧正離子進(jìn)行檢測。以500 μg/L的松香酸和脫氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定松香酸和脫氫松香酸的[M+H]+離子峰分別為m/z303和301；然后分別以這些離子作為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，其二級質(zhì)譜圖見圖2、3。松香酸主要產(chǎn)生m/z123、257、135、149等子離子；脫氫松香酸要產(chǎn)生m/z173、133、255、131等子離子。選取豐度最強(qiáng)的2 對離子作為各組分的監(jiān)測離子，優(yōu)化噴霧電壓、碰撞能量、脫溶劑溫度等質(zhì)譜參數(shù)，最終參數(shù)見表1。

圖2 松香酸的二級質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary mass spectrum of abietic acid

色譜分離時，采用甲醇、水作為流動相，考慮到松香酸和脫氫松香酸的質(zhì)譜檢測采用正離子，加入一定的甲酸，有助于促進(jìn)松香酸電離從而有利于離子化，因此在流動相中均加入了0.1%甲酸。通過優(yōu)化分離條件，采用等度洗脫程序進(jìn)行分離，5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了松香酸和脫氫松香酸的快速分離和檢測。

圖3 脫氫松香酸的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum of dehydrogenated abietic acid

2.2 樣品提取及凈化

松香酸是一種三環(huán)二萜類含氧化合物，脫氫松香酸為松香酸分子脫去2 個氫原子并發(fā)生雙鍵重排后的產(chǎn)物，這2 種化合物均易溶于有機(jī)溶劑，乙腈是常用的提取溶劑[9-12,21]。為此，樣品的提取參考張?zhí)K珍[9-10]、杜盼盼[21]等的方法，采用乙腈作為提取液，提取后的樣品溶液采用固相萃取柱進(jìn)行凈化。由于松香酸和脫氫松香酸在反相色譜上有較好的保留，因此可以用C18或HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化[9-11]。實(shí)驗(yàn)分別采用C18和HLB固相萃取柱對添加了松香酸和脫氫松香酸的樣品提取液進(jìn)行凈化，發(fā)現(xiàn)C18或HLB固相萃取柱對于松香酸和脫氫松香酸的回收率均在90%以上，最終采用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。為了盡量去除雜質(zhì)，考察20%～60%乙腈溶液作為淋洗液對回收率的影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)超過40%以后，松香酸和脫氫松香酸的回收率開始明顯下降，表明部分松香酸和脫氫松香酸被洗脫下來，因此最終采用40%乙腈溶液作為淋洗液。

圖4 淋洗液對回收率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of acetonitrile as washing solutions on recovery rates

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，取一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y軸）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X軸）作圖，松香酸和脫氫松香酸質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分別在定性離子色譜峰可有效識別的前提下，以實(shí)際樣品和低水平加標(biāo)樣品各分析物的信噪比分別約為3和10進(jìn)行評估[27]，結(jié)果見表2。松香酸的LOD和LOQ分別為1.1 μg/kg和3.6 μg/kg，脫氫松香酸的LOD和LOQ分別為3.9 μg/kg和13 μg/kg。與已報道的液相色譜法[9-10]相比較，本方法對松香酸的靈敏度提高了約90 倍，對脫氫松香酸的靈敏度提高了約25 倍。

表2 松香酸和脫氫松香酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2Regression equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of abietic acid and dehydrogenated abietic acid

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

在鴨皮、鵝皮和豬頭皮空白樣品中分別添加5、10、50 μg/kg的松香酸和20、40、200 μg/kg的脫氫松香酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)方法進(jìn)行處理和測定。由圖5可知，松香酸的保留時間為3.37 min，2 對離子的豐度比為100∶43；脫氫松香酸的保留時間為2.49 min，2 對離子的豐度比為100∶94。鴨皮、鵝皮和豬頭皮中松香酸和脫氫松香酸添加回收率如表3所示，在添加量范圍內(nèi)，松香酸的回收率為84.8%～93.7%，脫氫松香酸的回收率為81.7%～91.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在12%以內(nèi)。張?zhí)K珍等[9-10]采用液相色譜法分別測定了肉鴨表皮中的松香酸及脫氫松香酸，松香酸的回收率為82.2%～88.0%，脫氫松香酸的回收率為80.8%～91.8%，本方法的回收率與其基本一致。

表3 不同加標(biāo)樣品中松香酸和脫氫松香酸的回收率及精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and precision of abietic acid and dehydrogenated abietic acid in different spiked samples (n= 6)

圖5 鴨皮添加5 μg/kg的松香酸（A）和20 μg/kg的脫氫松香酸（B）的MRM圖Fig.5 MRM chromatograms of duck skin spiked with 5 μg/kg abietic acid (A) and 20 μg/kg dehydrogenated abietic acid (B)

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法檢測購自本地超市或農(nóng)貿(mào)市場的5 份肉鴨、5 肉鵝和5 份豬頭皮進(jìn)行檢測，在其中7 份樣品中檢出松香酸和脫氫松香酸殘留，樣品檢出率為47%；松香酸的最高值為7.39 μg/kg，脫氫松香酸的最高值為0.830 μg/kg，結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際樣品中松香酸和脫氫松香酸含量Table 4 Contents of abietic acid and dehydrogenated abietic acid in actual samples

本研究還考察了松香及松香甘油酯模擬脫毛肉鴨表皮中的松香酸及脫氫松香酸的殘留情況，測得松香脫毛鴨皮中松香酸含量為17.5 mg/kg，脫氫松香酸含量為2.04 mg/kg；松香甘油酯脫毛鴨皮中松香酸含量為0.692 mg/kg，脫氫松香酸含量為0.658 mg/kg。松香甘油酯是允許使用的脫毛劑，但結(jié)果表明即使使用松香甘油酯進(jìn)行脫毛，也會有痕量的松香酸和脫氫松香酸殘留。這主要在于，松香甘油酯生產(chǎn)是由松香酸和過量甘油三酯直接混合進(jìn)行酯化反應(yīng)制得[28-30]，由于無法達(dá)到100%完全反應(yīng)，故其最終產(chǎn)品中含有少量松香酸和脫氫松香酸，脫毛時會殘留于鴨皮表面。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測松香甘油酯及松香樣品，發(fā)現(xiàn)松香甘油酯中松香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.52%，脫氫松香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45%；而松香中松香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%，脫氫松香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6%。可以看出，松香中松香酸和脫氫松香酸含量差異大，而松香甘油酯中松香酸和脫氫松香酸含量較為接近，這是由于松香在酯化反應(yīng)過程中松香酸與脫氫松香酸并非等比例消耗，從而改變了松香甘油酯中殘余的松香酸和脫氫松香酸的比值。雖然采用松香甘油酯進(jìn)行脫毛也會有痕量的松香酸和脫氫松香酸殘留，但是其殘留量明顯較松香脫毛低得多；并且采用松香甘油酯脫毛鴨皮中松香酸和脫氫松香酸的比值與松香脫毛鴨皮樣品存在明顯差異，松香脫毛松香酸和脫氫松香酸比值接近9，與松香中這2 種化合物的比值一致；而采用松香甘油酯脫毛松香酸和脫氫松香酸比值接近1，也與松香甘油酯中這2 種化合物的比值基本一致；這種比值的差異可以用于輔助判定違規(guī)采用松香進(jìn)行脫毛。從實(shí)際樣品的檢出情況可知，肉鴨1、肉鴨3、肉鵝3和豬頭皮1的檢測結(jié)果與松香脫毛的結(jié)果較為一致，而肉鴨5、肉鵝1及豬頭皮4與松香甘油酯脫毛的結(jié)果較為一致。該實(shí)驗(yàn)也表明，僅通過測定松香酸或脫氫松香酸單種組分判定違規(guī)使用松香脫毛存在較大的風(fēng)險，因?yàn)椴捎盟上愀视王ッ撁珓游锉砥そM織中松香酸或脫氫松香酸也會有一定的殘留，需要同時測定兩種組分進(jìn)行綜合判定更為可靠。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了畜禽動物表皮中松香酸和脫氫松香酸含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，樣品中的松香酸和脫氫松香酸經(jīng)乙腈超聲提取、HLB SPE固相萃取柱凈化，然后采用含甲酸的水及甲醇作為流動相、在C18反相柱上進(jìn)行分離，用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測。與傳統(tǒng)的固相萃取柱萃取-液相色譜法相比，該方法更為靈敏、可靠，且能夠同時測定松香酸和脫氫松香酸。方法對多個市售鴨、鵝、豬等畜禽樣品表皮組織進(jìn)行檢測，松香酸和脫氫松香酸的檢出率為47%；模擬脫毛實(shí)驗(yàn)的研究表明采用松香甘油酯脫毛也會導(dǎo)致一定的松香酸和脫氫松香酸殘留。該方法有助于為打擊非法使用工業(yè)松香拔毛行為提供技術(shù)支持，具有實(shí)際應(yīng)用價值。