牛建蕊 ， 王 靜 ， 王培坤 ， 薛 聰 ， 韓照清 ， 于 洋 ， 王 媛 ， 張興林

(1. 臨沂大學(xué)微生物與宿主健康研究所 ， 山東 臨沂 276005 ； 2.臨沂市蘭山區(qū)畜牧發(fā)展促進(jìn)中心 ， 山東 臨沂 276005)

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的以腫瘤發(fā)生和免疫抑制為特征的禽類(lèi)疾病[1]。AL感染雞的有A～E、J和K共7個(gè)亞群[2]，其中J亞群(Subgroup J of ALV,ALV-J)為感染雞的主要外源性病毒，B、C、D亞群在臨床上少見(jiàn)[3]，E亞群為內(nèi)源性病毒，不具有致瘤性[4]。ALV-J于1988年在英國(guó)白羽肉雞中首次發(fā)現(xiàn)，隨后在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。杜巖等[6]于20世紀(jì)末，首次報(bào)道在中國(guó)商品代白羽肉雞分離到ALV-J，ALV-J隨后在我國(guó)各品種雞群中廣泛傳播，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。

目前尚無(wú)有效商業(yè)化疫苗和藥物可以防控AL，種群凈化是控制該病有效的方式。我國(guó)部分大型育種公司開(kāi)展實(shí)施的ALV凈化工作效果顯著。然而在地方品種雞群，ALV感染雞群情況仍然較為多發(fā)[9]。沂蒙草雞是沂蒙山地區(qū)野外放養(yǎng)的本地柴雞，品種優(yōu)良，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大。2020年上半年，部分養(yǎng)殖戶(hù)反映在飼養(yǎng)過(guò)程中有部分雞只出現(xiàn)內(nèi)臟腫瘤死亡。為了確診這些病例，同時(shí)了解沂蒙草雞ALV感染情況，本試驗(yàn)針對(duì)沂蒙草雞開(kāi)展禽白血病流行病學(xué)調(diào)查。從沂蒙草雞養(yǎng)殖場(chǎng)禽白血病病毒p27抗原陽(yáng)性雞中分離、鑒定出1株ALV-J，并完成了全基因序列測(cè)定及遺傳變異分析，為沂蒙地區(qū)禽白血病防控提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與細(xì)胞 從沂蒙地區(qū)2個(gè)規(guī)模較大的沂蒙草雞養(yǎng)殖場(chǎng)，分別各采集母雞血漿46份，公雞血漿46份，共184份樣品。DF-1細(xì)胞由臨沂大學(xué)微生物與宿主健康研究所保存。

1.2 主要試劑 ALV-p27 抗原檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司；組織DNA抽提試劑盒購(gòu)、凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×Phanta Max Master Mix 高保真酶、PCR buffer (含Mg2+) ，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 病毒分離 按照文獻(xiàn)[3]步驟將樣品接種DF-1 細(xì)胞做病毒分離，9 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)物。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)物ELISA檢測(cè) 按照ALV-p27 抗原ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中是否含有ALV-p27抗原。

1.5 PCR分型鑒定 鑒定出ALV-p27抗原陽(yáng)性樣品，重新進(jìn)行病毒增殖培養(yǎng)并收集細(xì)胞培養(yǎng)物。按照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，抽提細(xì)胞培養(yǎng)物中DNA，并分別用ALV各亞群鑒定引物進(jìn)行鑒定。分型鑒定引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)并由華大基因科技服務(wù)有限公司合成，引物名稱(chēng)及序列以及目的片段大小見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用的引物Table 1 The primers used in this study

1.6 ALV-J全基因組序列測(cè)定 參照ALV-J原型株HPRS-103前病毒基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)互相重疊的特異性引物，如表1所示。以鑒定為ALV-J陽(yáng)性的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[1]。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化，隨后將純化產(chǎn)物連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽(yáng)性后，每個(gè)片段挑選3個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.7 序列分析 利用DNASTAR(Ver 7.1.0)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接進(jìn)而獲得完整病毒序列，對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行相似性比較分析。MEGA X(Ver 10.1.7)將獲得全基因組序列與參考序列進(jìn)行比較分析，利用最大似然法(Maximum likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用在線軟件Soft Berry(http：//linux1.softberry.com/berry.html)的NSITE分析工具進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)物ALV-p27抗原ELISA檢測(cè) 對(duì)收集的184份細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行ALV-p27抗原檢測(cè)，結(jié)果顯示，有5份樣品為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為2.71%(圖1)。

圖1 樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.1 ELISA results of the samples

2.2 陽(yáng)性樣品PCR檢測(cè) 陽(yáng)性樣品進(jìn)行亞群鑒定，結(jié)果表明，有4份樣品在692 bp有特異性條帶，1份樣品在545 bp處有特異性條帶(圖2)。分別與ALV-A和ALV-J鑒定引物預(yù)期片段大小一致，表明4份為ALV-A，1份為ALV-J。將鑒定出的ALV-J毒株命名為SDLYU1901。

圖2 樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR results of the samplesM: DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1: 陰性對(duì)照； 2～6: 陽(yáng)性樣本M: DNA marker DL2 000; 1: Negative control; 2- 6: Positive sample

2.3 ALV-J分離株全基因組序列分析 分離株的前病毒基因組全長(zhǎng)為7 640 bp。主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol、gp85和gp37基因長(zhǎng)度分別為2 106、2 622、921 bp和591 bp，3′UTR長(zhǎng)度為678 bp，3′LTR長(zhǎng)度為326 bp。SDLYU1901與J亞群參考株全基因組相似性在93.1%～96.4%，其中與分離株JS09GY3相似性最高為96.4%，與其他亞群參考株相似性為83.0%～84.4%(表2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，SDLYU1901與2009年江蘇蛋雞分離株JS09G3、JSO9GY6處于同一個(gè)分枝(圖3)。

表2 分離株SDLYU1901 相似性分析Table 2 Similarity analysis of SDLYU1901 (%)

圖3 基于SDLYU1901 全基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of whole genome of SDLYU1901?： 本試驗(yàn)分離株; 下同?： Strain isolated in this test. The same as below

2.4 分離株env基因序列分析 ALV的env基因是病毒致腫瘤類(lèi)型的關(guān)鍵基因，該基因編碼決定病毒亞群特異性的gp85 表面蛋白以及 gp37 跨膜蛋白[10]。正是env基因的差異，導(dǎo)致了 ALV-J的致病性、致瘤性普遍強(qiáng)于其他亞群病毒[11]。對(duì)沂蒙草雞分離株SDLYU1901gp85基因分析，結(jié)果顯示，gp85基因與分離株GX15MM6-2親緣關(guān)系較近(圖4A)，核苷酸相似性為95.4%，氨基酸相似性為92.8%。對(duì)SDLYU1901gp37基因分析，結(jié)果顯示，gp37基因與分離株SCDY-1親緣關(guān)系較近(圖4B)，核苷酸相似性為97.0%，氨基酸相似性為96.4%。

圖4 基于分離株SDLYU1901 gp 85基因(A)和gp 37基因(B)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of gp 85 gene (A) and gp 37 gene (B) of SDLYU1901

2.5 分離株3′UTR序列分析 3′UTR由rTM(redundant TM)、單拷貝正向重復(fù)單位(Direct repeat，DR1)和 E 元件(XSR)構(gòu)成[12]。不同ALV-J毒株3′UTR 區(qū)域突變程度不同。SDLYU1901 在3′UTR缺失主要發(fā)生在rTM和DR1區(qū)域，包括rTM區(qū)域的175 bp以及DR1區(qū)域的30 bp，共有205 bp的缺失。分離株E元件未發(fā)現(xiàn)缺失。見(jiàn)圖5。

圖5 ALV-J分離株與參考毒株3′UTR基因序列分析Fig.5 Gene sequence analysis of 3′UTR of ALV-J isolated strain and references strains

2.6 分離株3′LTR序列分析 LTR序列由高度保守的R區(qū)和U5區(qū)，以及含有較多轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件U3區(qū)構(gòu)成[13]。對(duì)分離株U3區(qū)序列分析，結(jié)果顯示，其與ALV-J原型株HPRS-103相似性最高，為97.3%。對(duì)分離株SDLYU1901的U3區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄元件分析，結(jié)果顯示，其轉(zhuǎn)錄元件與原型株HPRS-103高度一致，包含有C/EBP、E2BP、NFAP-1、AIB REP1、TATA box、2個(gè)Y box、2個(gè)PRE box、2個(gè)CArG box等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。見(jiàn)圖6。

圖6 不同ALV-J 分離株U3區(qū)對(duì)比分析Fig.6 Comparative analysis of the U3 region of different ALV-J strains

3 討論

自1999年我國(guó)首次報(bào)道從肉雞中分離到ALV-J至今20余年間，其給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[14]。2008年開(kāi)始的禽白血病凈化工作取得了顯著成效[15]。然而自2018年開(kāi)始，我國(guó)雞群感染禽白血病的報(bào)道明顯增多，禽白血病在我國(guó)部分地區(qū)有重新流行趨勢(shì)[2,9]。本試驗(yàn)對(duì)沂蒙地區(qū)2個(gè)規(guī)模較大的沂蒙草雞養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)展禽白血病感染情況調(diào)查，從184份血漿樣品中分離到5份ALV陽(yáng)性樣品，經(jīng)過(guò)分型引物鑒定有4份樣品為ALV-A，1份樣品為ALV-J，表明沂蒙草雞雞群存在ALV感染。

對(duì)分離到的ALV-J毒株SDLYU1901進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定及分析。結(jié)果顯示，分離株與JS09GY3及JS09GY6親緣關(guān)系最近，表明它們有著共同來(lái)源。對(duì)毒株結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，gag和pol相對(duì)較為保守，與J亞群其他毒株相比，氨基酸變異頻率在5%以?xún)?nèi)，而env基因變異頻率較高。研究表明，env基因決定病毒的致瘤譜及宿主范圍，特別是gp85基因的hr1、hr2以及Vr3等區(qū)域[16]。本試驗(yàn)分離毒株gp85基因與廣西三黃雞分離株GX15MM6-2親緣關(guān)系最近，gp37基因與四川分離株SCDY-1親緣關(guān)系較近，這提示分離株或許是不同宿主來(lái)源分離株的重組毒株，而這種可能的重組毒株是否會(huì)導(dǎo)致臨床癥狀和腫瘤變異需要進(jìn)一步研究。

LTR區(qū)的 U3區(qū)含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，與病毒毒力、轉(zhuǎn)錄水平和復(fù)制能力等密切相關(guān)[17]。本試驗(yàn)分離株SDLYU1901的LTR的U3序列與原型株HPRS-103相似性最高，為97.3%，高度保守。3′UTR與ALV的表達(dá)調(diào)控，復(fù)制動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)[12]。作者前期對(duì)1988—2018年分離的85株ALV-J全基因的3′UTR序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)85株ALV-J分離毒株中有84.71%毒株在3′UTR區(qū)域存在1個(gè)205 bp(175 bp位于rTM，30 bp 位于DR-1)的缺失[1]，而且該缺失已經(jīng)被證實(shí)有利于病毒復(fù)制，增強(qiáng)蛋雞和肉雞的致病性[18]。本試驗(yàn)中分離株SDLYU1901在3′UTR存在一個(gè)同樣的缺失。作者前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在85株ALV-J中有30.59%(26/85)存在E原件缺失[1]，而這些毒株主要分離自白羽肉雞和黃羽肉雞，且2014年后分離毒株未發(fā)現(xiàn)該缺失繼續(xù)出現(xiàn)。本試驗(yàn)分離株SDLYU1901的E元件也未發(fā)生缺失。

本試驗(yàn)對(duì)沂蒙地區(qū)沂蒙草雞禽白血病感染情況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)分離到的1株ALV-J完成了全基因組序列測(cè)定及分析。本試驗(yàn)結(jié)果表明，沂蒙草雞存在ALV不同亞群感染，而且分離到的ALV-J毒株可能是由早些年不同宿主遺傳背景分離株重組產(chǎn)生的，該病毒致病性及其對(duì)本地雞群影響尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果對(duì)下一步開(kāi)展禽白血病凈化工作有重要指導(dǎo)意義，同時(shí)探究的ALV-J 毒株來(lái)源及變異情況，對(duì)研究病毒溯源有指導(dǎo)意義。