宣富君，趙鑫月，付龍龍，鮑成滿，管衛(wèi)兵，唐伯平，潘建林，成永旭

（1.鹽城師范學(xué)院濕地學(xué)院/江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室，江蘇鹽城 224051；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京 210017；3.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；4.上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

中華絨螯蟹Eriocheir sinensis，俗稱河蟹，是中國重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)物種。得益于20 世紀(jì)70 年代中華絨螯蟹人工育苗技術(shù)的突破[1]和土池育苗技術(shù)的推廣應(yīng)用[2]，目前中華絨螯蟹養(yǎng)殖已經(jīng)遍布全國31 個省市自治區(qū)，包括臺灣[3]和西藏[4]。中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量從2000 年的23 萬t 增加到2018 年的75 萬t[5]，被稱為特種水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一朵奇葩，超過世界其他經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖和捕撈總和[6-7]。

種質(zhì)退化是當(dāng)下中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展所面臨的重要課題之一。育苗單位曾盲目追求經(jīng)濟(jì)利益和降低生產(chǎn)成本，無序引進(jìn)其他各大水系的苗種及采用小規(guī)格親本用于苗種生產(chǎn)，造成商品蟹形狀退化，規(guī)格小，養(yǎng)殖效益低下[8]。獲取高質(zhì)量的親本是中華絨螯蟹育苗的關(guān)鍵[6]。一般認(rèn)為親本選用健康無殘肢公蟹150 g，母蟹100 g 以上便是合理的，也就是傳統(tǒng)苗種行業(yè)中所說的“公3 母2”。在實際生產(chǎn)過程中，無論采用何種規(guī)格，親本投放性比一直沿用雌雄2～3：1 進(jìn)行，即假設(shè)一只雄蟹可以和2～3 只母蟹成功交配，交配抱卵時間通常在20 d 左右（從親本投放到群體內(nèi)雌性整體抱卵后去除雄蟹）[9]。

然而，該中華絨螯蟹育苗傳統(tǒng)親本選擇投放關(guān)鍵參數(shù)（“公3 母2”，投放性比2～3：1）的科學(xué)性至今無從考證。結(jié)合世界其他經(jīng)濟(jì)蟹類的研究成果揭示，比如著名的美洲藍(lán)蟹Callinectes sapidus[10-12]和阿拉斯加雪蟹Chionoecetes opilio[13-14]，中華絨螯蟹育苗過程中這種人為的偏雌性的親本選擇投放模式存在精子限制的風(fēng)險，即雌蟹因交配過程得不到充足的精子精液等雄性產(chǎn)物而出現(xiàn)抱卵不充分，流產(chǎn)等現(xiàn)象，嚴(yán)重的可能直接影響苗種的質(zhì)量。筆者曾對江蘇沿海苗場親本交配前后個體的生殖狀態(tài)進(jìn)行調(diào)研，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹存在性選擇現(xiàn)象，少部分雄蟹由于參與過多交配活動甚至出現(xiàn)了“精盡蟹亡”的現(xiàn)象，——這些雄蟹輸精管和副性腺整體干癟發(fā)黃，管內(nèi)甚至不存在一粒精莢[15]。因此，為了保證苗種質(zhì)量和整個中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，對中華絨螯蟹親本選擇投放關(guān)鍵參數(shù)的科學(xué)考證顯得尤為重要。

基于以上分析，本文擬參考國外經(jīng)濟(jì)蟹類圍繞精子限制機(jī)制的研究成果，實驗室條件下對中華絨螯蟹育苗傳統(tǒng)親本選擇投放關(guān)鍵參數(shù)（即“公3 母2”親本2～3：1 的雌雄配比）的科學(xué)性進(jìn)行論證，以期揭示中華絨螯蟹的配子分配策略，加深對蟹類受精生物學(xué)的理解，預(yù)測傳統(tǒng)育苗工作中采用該配比的合理性及可能出現(xiàn)的問題，尤其是當(dāng)下普通產(chǎn)用大規(guī)格親本苗種生產(chǎn)及遺傳育種方面的工作提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用蟹于2019 年11 月20 日采購于江蘇鹽城大豐當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖戶。其中，公蟹60 只，規(guī)格145～155 g之間，母蟹100 只，95～105 g 之間，符合“公3 母2”的標(biāo)準(zhǔn)。親本雌雄隔離，分別暫養(yǎng)于鹽城師范學(xué)院江蘇省鹽土生物資源重點實驗室，期間每天18：00 投喂1 次新鮮野雜魚，投喂量為蟹總重的10%左右，次日上午08：00～09：00 清理殘餌，每日換水1/3，確保水質(zhì)清新，最后從中挑選十足健全、體質(zhì)健壯的親本進(jìn)行分組實驗。

1.2 實驗方法

暫養(yǎng)10 d 后，實驗按雌雄不同性比（♀：♂=1：1；♀：♂=3：1；♀：♂=5：1）在3 個面積為3 m2帆布池內(nèi)進(jìn)行。帆布池底部鋪10 cm 細(xì)沙，水位控制在35 cm 以上，鹽度25，底部充足供氧。投放密度為4 只·m-2（參考當(dāng)?shù)赜鐔挝唬15]，室內(nèi)水溫維持在6～13 ℃之間。鑒于室內(nèi)溫度比較穩(wěn)定及盡量與育苗單位實際工作一致，每組實驗持續(xù)時間設(shè)定為15 d，實驗于2020 年1 月14 日結(jié)束，前后開展3 組，共經(jīng)歷45 d。

每組實驗結(jié)束后，觀察記錄每只蟹的生殖狀況并迅速解剖。雄蟹輸精管和副性腺占雄蟹整個生殖系統(tǒng)的絕大部分[16]，取出輸精管、副性腺，稱重拍照后計算輸精管指數(shù)（vaso-somatic index，VSI，含副性腺）。VSI不受螃蟹規(guī)格大小的影響，可以作為雄性生殖狀況的潛在指標(biāo)[15]。期間，選擇每個性比組3 只有代表性個體置于10%中性甲醛中保存，進(jìn)行后續(xù)組織學(xué)檢測，AB-PAS 染色（作為對照，同時解剖20 只未交配個體，計算VSI）。雌蟹在記錄每只蟹的抱卵流產(chǎn)情況后，取其納精囊，并對含精液個體用鑷子擠出所含精液稱重，同時通過鏡檢，確定交配情況（同樣，每組保留3 只有代表性個體用于組織學(xué)觀察，AB-PAS 染色，如含精液精莢等雄性產(chǎn)物，表明個體存在交配活動）。解剖20 只未交配母蟹，解剖觀察卵巢發(fā)育狀況并計算卵巢指數(shù)（ovarian index，OI，一般認(rèn)為母本交配季節(jié)卵巢指數(shù)達(dá)到10%以上，性腺發(fā)育成熟，可進(jìn)行交配產(chǎn)卵活動）。

兩性腺指數(shù)計算公式如下：

VSI=輸精管（含副性腺）重量/體重×100%；

OI=卵巢重/體重×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。其中，文中各組均值差異運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)差表示，而圖中比較分析均值差異運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)誤表示；各組均值比較分析雄性VSI 和雌性納精囊精液含量分別運(yùn)用Bonferroni檢測。此外，為進(jìn)一步表明河蟹交配過程精液等雄性產(chǎn)物分配不均，不同性比數(shù)據(jù)匯總后建立散點圖。

2 結(jié)果

雄蟹親本交配前VSI 為3.45±0.57（n=20），雌蟹卵巢指數(shù)達(dá)到12.30±1.11（n=20），性腺發(fā)育良好。

交配后，絕大部分組內(nèi)雄蟹的輸精管（含副性腺）由于精莢精液等雄性產(chǎn)物的輸出均出現(xiàn)不同程度的變化，管徑減小，有的組個體輸精管（含副性腺）顏色由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该骰蛲该鳡睿▓D1A），但管內(nèi)仍含雄性產(chǎn)物精液精莢（如圖1B,C）。相應(yīng)的，輸精管指數(shù)（VSI）與未交配個體相比，除雌雄性比1：1 1#略有上升（VSI=3.55，P＞0.05），整體隨性比提高，呈下降趨勢（圖1D）。此外，根據(jù)Bonferroni 檢測，即使在3：1 和5：1 條件下，各組VSI 也出現(xiàn)明顯差異。例如：在性比3：1 組，1# VSI 值盡管低于未交配個體，但數(shù)值較高（VSI=2.44），與未交配個體差異不顯著（P＞0.05），而與2#（VSI=1.35），3#（VSI=0.95）相比，下降明顯（P＜0.05）；5：1 組，1#（VSI=2.51）交配后VSI 下降不顯著（交配率僅為50%，P＞0.05），而與2#（VSI=1.06），3#（VSI=0.87）差異明顯（交配率達(dá)到90%，P＜0.05）。

圖1 不同生殖狀態(tài)雄性輸精管（包括副性腺）形態(tài)特征和各組輸精管指數(shù)（VSI）變化Fig.1 Morphological characteristics of male vas deferens（including accessory gonads）in different reproductive states and changes of vas deferens index（VSI）in each group

交配后，納精囊通常呈乳白色，內(nèi)部充滿精莢精液等雄性產(chǎn)物（圖2A），但在性比5：1 條件下（2#，3#），部分個體納精囊呈半透明或透明色，內(nèi)含少許或不含精莢精液等雄性產(chǎn)物（圖2B）。對不同性比交配未產(chǎn)卵個體納精囊精液含量分析：即使同一性比同一組不同個體間，個體接收雄性精液的量存在明顯差異（圖2C）。例如：性比1：1 2#，納精囊精液含量最高的可達(dá)3.20 g，而最低的僅為0.90 g，兩者相差2.30 g；性比3：1，精液2.81 與0.48（3#），1.81 與0.36（2#）均來自同一組。抱卵后，納精囊內(nèi)剩余的精液量亦參差不齊（圖2D）：隨著性比提高，同一性比條件下差異收窄，整體呈下降趨勢（Bonferroni 檢測，P＜0.05）。其中，性比1：1，精液剩余含量處于0.31～2.30 g 之間（均值（1.06±0.65）g），3：1 處于0.20～2.14 g 之間（均值（0.60±0.53）g），而5：1 則聚集在0.18～0.64 g 之間（均值（0.38±0.13）g），近80%處于0.5 g 以下。對各組交配抱卵情況統(tǒng)計進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，性比1：1 和3：1 組，均成功抱卵，未出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象；5：1 組，盡管1#交配個體亦成功抱卵，但交配率僅50%；而2#，3#交配率達(dá)90%，但流產(chǎn)嚴(yán)重，高達(dá)83.3%和100%。以5：1 組中出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象納精囊無色精液含量為基準(zhǔn)（0.64 g），1：1 組41.67%，3：1 組80%低于該值（圖2D），但1：1 和3：1 組納精內(nèi)仍含有剩余精子/精莢等雄性產(chǎn)物。

圖2 不同生殖狀態(tài)雌性納精囊形態(tài)特征和內(nèi)含雄性產(chǎn)物變化Fig.2 Morphological characteristics and changes of male products in different reproductive states of female spermathecae

3 討論

本文首次對中華絨螯蟹育苗傳統(tǒng)親本選擇投放關(guān)鍵參數(shù)的科學(xué)性進(jìn)行了檢驗，結(jié)果表明親本“公3 母2”，選擇投放雌雄性比2～3：1，該參數(shù)充分兼顧了中華絨螯蟹生殖的生物學(xué)特性，具有相當(dāng)?shù)木珳?zhǔn)性。在該體系下（本文代表雌雄性比為3：1），交配后和性比1：1 一樣，納精囊內(nèi)始終存乳白色精液精莢等雄性產(chǎn)物，抱卵個體并沒有出現(xiàn)諸如性比5：1 組中納精囊中因缺乏精液精莢而流產(chǎn)現(xiàn)象。

交配后，雄蟹輸精管和副性腺均出現(xiàn)了不同程度的變化，VSI 整體呈下降趨勢，但不同性比即使同一性比條件下，各組均出現(xiàn)了明顯的差異。比如：雌雄性比1：1 1#，3：1 1#，5：1 1# 條件下，VSI 與未交配個體相比，輸精管與副性腺呈乳白色，均沒有出現(xiàn)大的起伏，而其余各組雄蟹由于消耗較多，差異顯著，盡管實驗中雄蟹沒有出現(xiàn)之前苗場調(diào)研報道的“精盡蟹亡”現(xiàn)象，即輸精管干癟發(fā)黃，一個精莢也沒有[15]，但之前中華絨螯蟹雄性個體生殖潛力的研究表明，3 兩以上個體具備連續(xù)交配3 次或多達(dá)6 次的能力，喪失交配能力前可以輸送超過60%以上精莢精液等雄性產(chǎn)物[9]，本次實驗中這些VSI 偏低個體明顯參與了多次交配活動，導(dǎo)致其輸精管變細(xì)，副性腺收縮，呈半透明色。中華絨螯蟹不像已經(jīng)報道的美洲藍(lán)蟹[10]、三疣梭子蟹Portunus trituberculatus[17]等軟殼交配的物種，它屬硬殼交配，交配前沒有明顯的交配前抱對現(xiàn)象，而且也不能提前釋放信息素吸引對方[18]，交配活動要相遇后才發(fā)生，因此，中華絨螯蟹交配活動發(fā)生是隨機(jī)的，這可能直接導(dǎo)致了性比5：1 組中出現(xiàn)未交配母蟹（尤其是1#，交配率僅為50%，也造成該組VSI 與未交配組沒有差異）。此外，雌蟹沒有產(chǎn)卵前可以多次與不同雄蟹發(fā)生交配（產(chǎn)卵后，停止交配，作者親自觀察），這也致使實驗中（各個組別）出現(xiàn)了VSI 差異，例如：性比1：1 中1# VSI 與未交配個體相比不降反升，可能就是該組雌蟹交配不久就產(chǎn)卵了，結(jié)合雄蟹精莢精液等雄性產(chǎn)物具備一定的自我恢復(fù)能力（10 d 內(nèi)可恢復(fù)交配前80%以上的儲存量）[15]，這些都與中華絨螯蟹的繁殖習(xí)性有關(guān)。

納精囊是雌蟹交配后存儲精莢精液等雄性產(chǎn)物及排卵時精卵交匯的地方。但在實驗中，不同性比條件下各組雌蟹納精囊內(nèi)雄性產(chǎn)物（無論是否抱卵）均出現(xiàn)了較大的偏差（例如：未產(chǎn)卵性比1：1 2#，性比3：1 3#和2#；產(chǎn)卵性比1：1 和3：1）。一則如上所述跟雌蟹的生殖狀況有關(guān)，雌蟹沒有抱卵前可以多次交配；二是在交配過程中雄蟹似乎對交配對象并沒有十分嚴(yán)格的要求，隨機(jī)交配[18]，而且之前的研究表明每次交配輸送給雌蟹雄性產(chǎn)物的量比較均一[9]。因此，交配活動的多寡導(dǎo)致了中華絨螯蟹納精囊雄性產(chǎn)物存量的差異。在對雌蟹產(chǎn)卵后納精囊剩余存量進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：隨著性比提高，同一性比條件下差異收窄，整體呈下降趨勢（從性比1：1 均值（1.06±0.65）g 到5：1 均值（0.38±0.13）g，這與已經(jīng)報道的其他經(jīng)濟(jì)蟹類的精子分配策略一致，即精莢精液等雄性產(chǎn)物是寶貴的[19-20]，雄性為了利益最大化，盡可能把有限的資源分配到更多交配對象中，從而盡可能多的獲得更多的后代[21]。

在雌雄性比1：1 和3：1 條件下，不論產(chǎn)卵與否，中華絨螯蟹雌蟹納精囊呈乳白色，交配抱卵后沒有出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，而5：1 組流產(chǎn)現(xiàn)象比較嚴(yán)重，流產(chǎn)個體納精囊呈半透明或透明狀，含無色液滴，不含或僅存少許解離的精莢或精子。以5：1 組中出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象納精囊精液含量為基準(zhǔn)（0.64 g），1：1 組41.67%，3：1 組80%低于該值，但1：1 和3：1 組納精內(nèi)仍含有剩余精子/精莢等雄性產(chǎn)物。根據(jù)之前雄性個體生殖潛力研究表明[9]，交配過程雄性交配過程中輸送給雌蟹的精子全部用于第一次受精抱卵，潛在精卵比可達(dá)（1.59～10.86）×103，高于堵南山[22]觀察到的受精過程每枚卵附著數(shù)百個精子及可以保證藍(lán)蟹[11]和雪蟹[13]正常受精的25～70：1精卵比，這與苗場調(diào)研結(jié)果一致[9,15]，也解釋了當(dāng)下苗場一直沿用傳統(tǒng)親本選擇投放參數(shù)而沒有報道類似國外經(jīng)濟(jì)蟹類管理中精子限制的原因。至于實驗中流產(chǎn)個體納精囊中出現(xiàn)一定量的無色透明液體，它的來源及功能作用有待進(jìn)一步研究。

綜上，本文的結(jié)論充分說明了中華絨螯蟹育苗傳統(tǒng)親本選擇投放關(guān)鍵參數(shù)的科學(xué)性，盡管無從考證，該參數(shù)應(yīng)該是老一輩科學(xué)家和育苗單位多年實踐的智慧結(jié)晶。目前，為了解決種質(zhì)問題，規(guī)避小規(guī)格親本帶來的弊端，越來越多的科研單位和育苗場認(rèn)識到大規(guī)格親本育苗的重要性[23-24]。在以江蘇省淡水水產(chǎn)研究所為代表的多家科研單位的推動下，河蟹育苗單位紛紛采用大規(guī)格親本，根據(jù)鹽城市農(nóng)村農(nóng)業(yè)局統(tǒng)計2019 年光鹽城射陽地區(qū)采用4 兩以上的大規(guī)格親本就占60%，近41 萬只。那么在中華絨螯蟹親本規(guī)格日益提高的條件下，傳統(tǒng)的育苗模式是否適合，是否存在進(jìn)一步優(yōu)化的可能，對科技工作者提出了新的要求。