孫 佳,吳清清,周文昊,林冬枝,宋忠明,董彥君*

(1上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海市植物分子科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200234;2上海市種子管理總站,上海201103)

據(jù)報(bào)道,全世界一半以上的人口依賴稻米中的淀粉類碳水化合物和營養(yǎng)物質(zhì)維持生命活動(dòng)[1-4]。稻谷中胚乳質(zhì)量約占總質(zhì)量的90%,胚乳細(xì)胞的發(fā)育直接影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。胚乳性狀與稻米外觀品質(zhì)、碾磨加工品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)密切相關(guān)。因此,研究稻谷中淀粉合成相關(guān)基因的功能對(duì)實(shí)現(xiàn)水稻的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)以及創(chuàng)制水稻育種材料具有重要的意義[5]。

在植物中,丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)催化丙酮酸、腺苷三磷酸(ATP)和磷酸(Pi)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、腺苷一磷酸(AMP)和焦磷酸(PPi)相互轉(zhuǎn)化。PPDK大量存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中,在C3植物中的表達(dá)量相對(duì)較低,主要存在于C3植物的未成熟種子、葉片、胚芽鞘和根中[6]。PPDK是C4植物光合作用的關(guān)鍵酶,催化CO2固定于PEP受體[7]。PPDK在C3植物種子中調(diào)節(jié)淀粉合成和氨基酸代謝,稱為胞質(zhì)型PPDK。在淀粉合成的過程中,胞質(zhì)型PPDK可能起到以下作用:丙酮酸是由丙酮酸激酶(PK)催化PEP生成的,是一個(gè)不可逆反應(yīng),需要PPDK來進(jìn)行逆反應(yīng),而淀粉的生物合成途徑可能由PK和PPDK循環(huán)產(chǎn)生的信號(hào)控制[8]。PK和PPDK之間的循環(huán)能夠增加細(xì)胞質(zhì)溶膠中PPi的濃度[6]。研究表明,PPi能夠誘導(dǎo)蔗糖合酶依賴性的途徑。這對(duì)淀粉生物合成的早期過程是非常重要的,PPi在PPDK活性下降之后觸發(fā)該途徑,隨后淀粉的生物合成在發(fā)育的宿主器官中發(fā)生[8-10]。

與其他的基因編輯技術(shù)相比,CRISPR∕Cas9基因編輯系統(tǒng)具有效率高、操作簡單等優(yōu)勢(shì)[11],目前該技術(shù)在水稻基因編輯中得到一定應(yīng)用。如邵高能等[12]利用CRISPR∕Cas9技術(shù)編輯‘中花11’香味基因Badh2,突變體籽粒中香味物質(zhì)2-乙酰-1吡咯啉含量顯著增加;Shan等[13]定點(diǎn)突變?nèi)~綠素合成基因CAO1,突變體葉片呈淡綠色;胡雪嬌等[14]對(duì)赤霉素20-氧化酶基因SD1進(jìn)行了定向編輯,獲得半矮稈水稻品種;本實(shí)驗(yàn)室也成功對(duì)谷蛋白基因GluA3進(jìn)行編輯,獲得了谷蛋白含量下降的突變體[15]。目前,尚未見對(duì)水稻丙酮酸磷酸雙激酶基因(P PDK)進(jìn)行編輯及其對(duì)淀粉合成影響的研究。本試驗(yàn)利用CRISPR∕Cas9技術(shù)對(duì)粳稻品種‘嘉花1號(hào)’的PP DK基因進(jìn)行編輯,以期探究其在水稻淀粉合成中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

遺傳轉(zhuǎn)化水稻材料選擇浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)粳稻品種‘嘉花1號(hào)’,種植在上海師范大學(xué)植物園的封閉試驗(yàn)基地水田中,采用常規(guī)水肥栽培管理。

1.2 CRISPR∕Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

本試驗(yàn)使用的CRISPR∕Cas9載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士提供[16]。利用CRISPR Primer Designer軟件對(duì)丙酮酸磷酸雙激酶基因PPDK(LOC_Os05g33570)的第6外顯子設(shè)計(jì)序列為5’-GCCAGCTGCAGTTGCTTCT-3’的19 bp長度靶點(diǎn)。表達(dá)載體構(gòu)建參照曾棟昌等[17]的方法,遺傳轉(zhuǎn)化與組織培養(yǎng)參照周優(yōu)等[15]的方法,獲得水稻T0代苗。

1.3 q-PCR分析

提取編輯突變植株及野生型(WT)‘嘉花1號(hào)’開花15 d未成熟的胚乳組織的總RNA,并以之為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(提取RNA試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司TransZolTMPlant,反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒為該公司TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)。采用q-PCR方法對(duì)水稻淀粉合成相關(guān)的8個(gè)基因(表1)進(jìn)行RNA水平的表達(dá)量分析。

表1 轉(zhuǎn)錄水平分析所用引物Table 1 Primers used for transcription level analysis

1.4 淀粉粒掃描電子顯微鏡觀察

選取編輯突變植株與‘嘉花1號(hào)’的成熟種子,干燥后用小刀在其橫截面上平切使其斷裂,取斷裂后的半粒米作為觀察材料,橫切面向上,噴金之后用Hitachi SU8010高分辨掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5 淀粉含量測(cè)定

收獲的水稻種子干燥后,脫殼保存。首先選取質(zhì)量接近的糙米粒放置在10個(gè)2 mL的EP管中(每管1粒),加入200μL蒸餾水后在高壓鍋中121℃蒸煮30 min;然后加入1個(gè)鋼珠和800μL蒸餾水,進(jìn)行粉碎;再將液體移至試管中定容至10 mL,加入10μL 0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的I-KI溶液,觀察溶液顏色變化并拍照記錄。選取糙米進(jìn)行均勻粉碎,過100目(孔徑150μm)篩,每個(gè)樣本稱取20 mg米粉,放入10 mL試管中,然后按照Megazyme公司(愛爾蘭)的直鏈淀粉測(cè)定試劑盒和抗性淀粉測(cè)定試劑盒的操作程序,測(cè)定直鏈淀粉、抗性淀粉以及總淀粉含量。

1.6 糊化特性觀察

選取4粒完整精米均勻放置于加有1.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH溶液的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中,加蓋后靜置在(30±2)℃的恒溫箱內(nèi),23 h后觀察米粒的糊化狀態(tài)并拍照。同時(shí),稱取20 mg精米粉于1.5 mL的EP管中,加入0.5 mL 4 mol∕L的尿素溶液,觀察米粉在尿素中的溶解度。

1.7 米粒外觀與農(nóng)藝性狀調(diào)查

在本實(shí)驗(yàn)室封閉試驗(yàn)基地培育野生型‘嘉花1號(hào)’與編輯得到的T2代突變體植株,成熟后對(duì)‘嘉花1號(hào)’以及純合編輯突變植株的株高、單株穗數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬以及千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察,并觀察稻米外觀。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR∕Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因水稻獲得

采用邊切邊連和兩輪巢式PCR的方法構(gòu)建和擴(kuò)增得到gRNA表達(dá)盒,將gRNA表達(dá)盒連接到MH質(zhì)粒中再次構(gòu)建重組載體(圖1),并轉(zhuǎn)入大腸桿菌(DH10B),擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,用特異引物B1∕BL(表2)擴(kuò)增并測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌(EHA105)中,擴(kuò)大培養(yǎng),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證;侵染水稻‘嘉花1號(hào)’愈傷組織,獲得組培植株后,利用載體特異引物HPT-F∕R(表2)擴(kuò)增檢測(cè),共獲得9株潮霉素陽性苗,其中有6株純合和3株雜合的編輯突變植株。純合突變類型均為PPDK基因第6外顯子上的NGG前第4個(gè)堿基A缺失(圖2)。通過與野生型‘嘉花1號(hào)’蛋白序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)翻譯提前終止,突變體蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖3所示。收取T0代轉(zhuǎn)基因苗的種子,T1代分離出無轉(zhuǎn)基因載體的純合突變體,命名為ppdk3。

圖1 gRNA表達(dá)盒連接MH質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic diagram of gRNA expression box connecting MH plasmid

表2 PPDK基因靶點(diǎn)引物和特異引物Table 2 P PDK gene target primers and specific primers

圖2 野生型(WT)和ppdk3突變體(M)測(cè)序結(jié)果對(duì)比以及DNA測(cè)序峰圖Fig.2 Comparison of wide type(WT)and ppdk3 mutant(M)sequencing results and DNA sequencing peak diagram

圖3 野生型(WT)和ppdk3突變體蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Protein structure prediction of wide type(WT)and ppdk3 mutant

2.2 突變體中淀粉合成相關(guān)基因RNA表達(dá)水平分析

對(duì)ppdk3突變體中淀粉合成相關(guān)的8個(gè)基因(表1)RNA轉(zhuǎn)錄水平情況進(jìn)行分析表明:與野生型‘嘉花1號(hào)’相比,突變體的8個(gè)淀粉合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)量均有明顯下調(diào),尤其是顆粒結(jié)合型淀粉合酶基因(G BSSⅠ和GBSSⅡ)及可溶性淀粉合成酶基因中的SSⅢa、SSⅡa、SSⅣ-2的表達(dá)量下調(diào)到原來的1∕10—1∕5(圖4)?？梢?PPDK基因的突變不僅影響自身的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,還抑制其他淀粉合成相關(guān)基因RNA的表達(dá)。

圖4 野生型(WT)和ppdk3突變體淀粉合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)Fig.4 Transcription levels of starch synthesis related genes in wide type(WT)and ppdk3 mutant

2.3 淀粉顆粒顯微結(jié)構(gòu)

用掃描電子顯微鏡觀察野生型‘嘉花1號(hào)’以及ppdk3突變體的米粒橫切面發(fā)現(xiàn):野生型胚乳淀粉顆粒表面光滑,排列緊密,形狀規(guī)則有棱角;而ppdk3突變體胚乳淀粉顆粒排列松散,顆粒明顯變小,淀粉顆粒呈球形和不規(guī)則形(圖5)?？梢?P PDK基因突變可導(dǎo)致胚乳淀粉顆粒形狀和排列發(fā)生很大變化。

2.4 稻米淀粉特征分析

將ppdk3突變體糙米蒸熟后打碎并加水稀釋,加入I-KI溶液,通過溶液顏色變化觀察其米粒中淀粉含量的變化。結(jié)果顯示:ppdk3突變體I-KI染色溶液顏色明顯淺于‘嘉花1號(hào)’(圖6A),說明其直鏈淀粉含量降低。同時(shí),分別測(cè)定其稻米直鏈淀粉和抗性淀粉含量發(fā)現(xiàn):‘嘉花1號(hào)’的直鏈淀粉含量為24.4%,而ppdk3突變體為18.8%,與I-KI染色染色結(jié)果相符合;另外,ppdk3突變體稻米的抗性淀粉含量(0.039%)比‘嘉花1號(hào)’(0.025%)略有上升。

圖5 野生型(WT)與ppdk3突變體的胚乳淀粉顆粒觀察Fig.5 Observation on endosperm starch granules of wild type(WT)and ppdk3 mutant

圖6 野生型(WT)和ppdk3突變體的I-KI溶液染色(A)、堿消值測(cè)定(B)和尿素溶液中的溶解度(C)Fig.6 I-KI solution staining(A),determination of alkali elimination value(B)and solubility in urea solution(C)of wide type(WT)and ppdk3 mutant

2.5 糊化特性分析

鑒于稻米的堿消值等級(jí)與糊化溫度(GT)呈負(fù)相關(guān),本試驗(yàn)采用堿裂解法間接測(cè)定稻米糊化溫度[18]。結(jié)果表明:ppdk3突變體稻米的堿消值比野生型‘嘉花1號(hào)’低(圖6B),說明ppdk3突變體稻米的糊化溫度高于野生型;在尿素溶解性上,突變體稻米較野生型更難溶于尿素(圖6C),說明ppdk3突變體稻米中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.6 米粒外觀與農(nóng)藝性狀調(diào)查

對(duì)‘嘉花1號(hào)’和純合突變體成熟種子的糙米、精米以及橫切面進(jìn)行觀察,均發(fā)現(xiàn)ppdk3突變體稻米的整個(gè)胚乳都表現(xiàn)為白色不透明粉質(zhì)狀(圖7)。另外,該突變體的株高與‘嘉花1號(hào)’基本接近,單株穗數(shù)明顯減少,千粒重明顯下降,粒長稍有增大而粒寬不變(表3)?？梢?水稻PPDK基因突變不僅影響胚乳淀粉特征,還影響其他農(nóng)藝性狀。

圖7 野生型(WT)與ppdk3突變體的糙米(A、B)、精米(C、D)、米粒橫截面(E、F)及成熟植株(G)觀察Fig.7 Observation on brown rice(A,B),milled rice(C,D),cross section of rice grain(E,F)and mature plants(G)of wild type(WT)and ppdk3 mutant

表3 ‘嘉花1號(hào)’和ppdk3突變體的農(nóng)藝性狀調(diào)查Table 3 Investigation on agronomic traits of‘Jiahua 1’and ppdk3 mutant

3 討論

CRISPR∕Cas9技術(shù)是近年應(yīng)用較廣的基因編輯技術(shù),對(duì)靶基因進(jìn)行特異性修飾只需通過一個(gè)gRNA和一個(gè)Cas9蛋白[19],具有成本低、制作簡便、快速高效等特點(diǎn)。目前,已經(jīng)成功利用CRISPR∕Cas9技術(shù)對(duì)水稻多個(gè)基因進(jìn)行編輯。如對(duì)水稻直鏈淀粉合成基因Wx進(jìn)行編輯,獲得穩(wěn)定遺傳、直鏈淀粉含量適宜的突變體[20];對(duì)水稻淀粉分支酶基因SBE3進(jìn)行編輯,獲得了高直鏈淀粉和高抗性淀粉含量的水稻新品系[21]。本試驗(yàn)成功利用CRISPR∕Cas9技術(shù)對(duì)淀粉合成過程中相關(guān)基因PPDK進(jìn)行了編輯,也獲得一種淀粉特征發(fā)生改變的突變體。

本試驗(yàn)在PPDK基因第6外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性靶位點(diǎn),構(gòu)建單靶點(diǎn),通過植物組培侵染,獲得一種突變體ppdk3:靶點(diǎn)內(nèi)缺失一個(gè)堿基A,蛋白翻譯提前終止,導(dǎo)致該基因控制合成的蛋白失去了大部分的高級(jí)結(jié)構(gòu)。突變體ppdk3的淀粉顆粒呈不規(guī)則形狀,排列疏松,存在間隙,可能導(dǎo)致胚乳對(duì)光的折射率發(fā)生改變而產(chǎn)生白色粉質(zhì)性狀,這與何冰紓等[22]報(bào)道的flo(t)突變體由于不規(guī)則、排列疏松的淀粉顆粒造成粉質(zhì)胚乳相似;同時(shí),盡管突變體的米粒略有增大,但由于淀粉顆粒變小疏松,導(dǎo)致千粒重明顯下降。另外,ppdk3突變體的抗性淀粉含量略有上升,這可能是造成突變體米粒糊化溫度升高的原因之一。由于水稻淀粉合成相關(guān)基因尤其是G BSS表達(dá)下降,突變體米粒直鏈淀粉含量降低,I-KI染色顏色明顯變淺。由此,推測(cè)PPDK基因?qū)Φ矸垲w粒大小的形成與排列以及淀粉合成具有一定影響。