周 丹，田 天，李 驊，舒 慶，趙小燕，余承莉，耿 鑫，王四旺

(1.西安市第九醫(yī)院藥劑科，西安 710054；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 710032)

胃潰瘍(GU)是一種影響患者生活質(zhì)量的常見胃腸道疾病，發(fā)病率高達(dá)10%，現(xiàn)已成為本世紀(jì)重要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[1]。近年來研究表明，檢測核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激是胃黏膜保護作用的重要信號通路[2-3]。飛揚腸胃炎膠囊是由飛揚草、火炭母及救必應(yīng)組成的方劑，具有瀉火解毒、除濕止痛之功效，主治細(xì)菌性痢疾和急、慢性腸胃炎，臨床應(yīng)用廣泛，療效確切[4-6]。本研究擬對飛揚腸胃炎膠囊的胃保護作用及其作用機制進行研究，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Eppendorf Certrifuge 5417R型臺式高速冷凍離心機(艾本德生命科技集團公司)；SCILOGEX型賽洛捷克混勻儀(美國賽洛捷克公司)；BioTek酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；OLYMPUS CKX 53型熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；ND 5000型超微量紫外可見分光光度計(無錫百泰克生物技術(shù)有限公司)；PB-10型數(shù)字測量儀(賽多利斯儀器系統(tǒng)集團公司)。

1.2試藥 飛揚腸胃炎膠囊(批號20151201)，陜西君碧莎制藥有限公司；蘭索拉唑片(批號19020121)，揚子江藥業(yè)集團股份有限公司；無水乙醇，霍尼韋爾國際集團公司；戊巴比妥鈉，Sigma公司；阿利新藍(lán)，北京索萊寶科技有限公司；氯化鎂，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；磷酸鹽緩沖液(PBS)，HyClone公司；4%多聚甲醛，上海尚寶生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒，博士德生物工程有限公司；前列腺素E2(PGE-2)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)和一氧化氮(NO)試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；谷胱甘肽(GSH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；血紅素加氧酶1 (HO-1)抗體，Proteintech公司；核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)抗體，Elabscience公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3動物 清潔級雄性健康成年SD大鼠，體質(zhì)量為180～230 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)合格證號：SCXK(軍)字第2012-007號。

2 方法

2.1實驗分組及給藥 將48只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、蘭索拉唑組以及飛揚腸胃炎膠囊低、中和高劑量組，每組8只。正常組和模型組均給予生理鹽水；蘭索拉唑組按照30 mg·kg-1的劑量給予蘭索拉唑；飛揚腸胃炎膠囊低、中和高劑量組分別按照200、400、600 mg·kg-1的劑量給藥；將蘭索拉唑、沒食子酸、飛揚腸胃炎膠囊分別溶于生理鹽水中，每組大鼠均按照10 mL·kg-1灌胃給藥。

2.2大鼠GU模型的建立 各組大鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。造模前，各組大鼠禁食24 h，可自由飲水，保持胃排空狀態(tài)。造模前1 h，正常組和模型組分別給予10 mL·kg-1的生理鹽水，其余各組分別給予相應(yīng)的藥物。給藥1 h后，除正常組外，其余各組大鼠均給予無水乙醇(5 mL·kg-1)灌胃，建立大鼠GU模型[7]。

2.3樣本采集與處理 各組大鼠用無水乙醇灌胃4 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置1 h后，以4 000 r·min-1離心15 min，取血清，-80 ℃保存，待用。取血后，結(jié)扎賁門和幽門，摘下胃部，清洗表面后沿胃大彎剪開，小心收集胃內(nèi)容物，待用，將胃部在冰上平展開，進行潰瘍指數(shù)(UI)評分。

2.4UI評分 UI評分由對實驗分組情況完全不了解的人員來判定，具體評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。保護指數(shù)(PI)的百分比按照公式[8]計算：PI=(模型組UI-給藥組UI)÷模型組UI×100%。

表1 UI評價標(biāo)準(zhǔn)

2.5胃內(nèi)容物酸度(pH)值測定 將大鼠胃內(nèi)容物收集在離心管中，以3 000 r·min-1離心10 min，用pH數(shù)字測量儀測定上清液的胃內(nèi)容物pH值[9]。

2.6胃黏液量(GWM)的測定 GWM按照Corne S J等[10]實驗方法進行測定：取大鼠胃腺體部分，在阿利新藍(lán)溶液中浸泡2 h，用0.25 mol·L-1蔗糖沖洗多余的染料，用0.5 mol·L-1氯化鎂溶液提取30 min，提取液中加入二乙醚，振蕩2 min，在580 nm波長處測定各組大鼠的吸光度值。

2.7蛋白含量的測定 取150 mg胃組織浸泡在150 mL PBS中，勻漿，以3 000 r·min-1低溫離心10 min，收集上清液，測定酶活力。勻漿后的組織裂解參照說明書操作，最后用核酸蛋白分析儀測定胃組織勻漿中的蛋白質(zhì)含量。

2.8氧化酶的活性以及前列腺素E2 (PGE-2)的水平 取2.7項下的組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書測量NO、PGE-2、TBARS、SOD、CAT和GSH的水平。

2.9大鼠胃組織病理學(xué)評價和免疫組化分析 取大鼠胃組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm薄片。切片用HE染色后觀察大鼠胃組織病理學(xué)形態(tài)。取上述石蠟切片進行免疫組化檢測，過氧化氫室溫孵育10 min后用PBS沖洗，BCA封閉30 min，用稀釋的一抗Nrf2(1∶100)和HO-1(1∶100)4 ℃孵育過夜，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗30 min，SABC顯色。切片使用光學(xué)顯微鏡觀察。

2.10數(shù)據(jù)處理及分析 實驗數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism軟件5.01版進行統(tǒng)計分析。GWM、胃內(nèi)容物pH值、PGE-2、NO、GSH、SOD、TBARS、CAT、Nrf2及HO-1均通過單因素方差分析(One-way ANOVA)對組間的差異進行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。UI采用非參數(shù)秩和Kruskal-Wallis方差分析法分析以及Mann-Whitney U檢驗進行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1飛揚腸胃炎膠囊對乙醇誘發(fā)的GU的保護作用 見表2。由表2可知，與模型組相比，蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組均可明顯降低UI評分,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蘭索拉唑組以及飛揚腸胃炎低、中和高劑量組的GU抑制率分別為59.13%、23.94%、58.05%、59.72%。

表2 各組UI及GU抑制率的比較

3.2飛揚腸胃炎膠囊對胃內(nèi)容物pH值及GWM的影響 見表3。由表3可知，與正常組比較，模型組大鼠胃內(nèi)容物pH值明顯降低(P<0.001)；蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組均能顯著升高大鼠胃內(nèi)容物pH值(P<0.001)，蘭索拉唑組與飛揚腸胃炎膠囊低劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，蘭索拉唑和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著增加GWM水平(P<0.001)，蘭索拉唑組與飛揚腸胃炎膠囊低劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，與飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 飛揚腸胃炎膠囊對胃內(nèi)容物pH值及GWM的影響

3.3飛揚腸胃炎膠囊對PGE-2和NO水平的影響 見表4。由表4可知，與正常組比較，模型組大鼠胃組織中PGE-2和NO水平顯著降低(P<0.001)；蘭索拉唑和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著增加大鼠胃組織中PGE-2和NO的水平(P<0.001)。在改善PEG-2和NO水平方面，飛揚腸胃炎膠囊低劑量組與蘭索拉唑組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組與蘭索拉唑組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 飛揚腸胃炎膠囊對PGE-2和NO的影響

3.4飛揚腸胃炎膠囊對氧化應(yīng)激的影響 見表5。由表5可知，脂質(zhì)過氧化物的水平通過檢測TBARS和GSH的水平來表達(dá)，抗氧化應(yīng)激能力通過檢測SOD和CAT的水平來評判。與正常組比較，模型組大鼠胃組織中TBARS的水平明顯升高(P<0.001)，GSH、SOD和CAT水平顯著降低(P<0.001)；蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著升高胃組織中CAT、SOD和GSH的水平(P<0.05或P<0.001)，降低胃組織中TBARS水平(P<0.05或P<0.001)。且在改善各氧化指標(biāo)方面，蘭索拉唑組與飛揚腸胃炎膠囊低劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 飛揚腸胃炎膠囊對氧化應(yīng)激的影響

3.5飛揚腸胃炎膠囊保護大鼠胃組織病理損傷 見圖1。由圖1可知，正常組大鼠胃組織病理學(xué)檢查顯示胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮和胃腺排列整齊，形狀規(guī)則。與正常組相比，模型組大鼠胃黏膜幾乎所有部位均出現(xiàn)不同程度的變性、壞死和出血，如炎性細(xì)胞浸潤、黏膜下水腫、胃小凹脫落等。蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組預(yù)處理均可顯著減輕胃黏膜炎癥細(xì)胞浸潤和黏膜下水腫，減輕胃黏膜病變，保護胃黏膜。蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量均能明顯改善胃黏膜的病理改變，使胃黏膜結(jié)構(gòu)接近正常，且改善程度相當(dāng)。

圖1 胃組織HE染色

3.6飛揚腸胃炎膠囊對Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響 見圖2。由圖2可知，蘭索拉唑組和飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組均明顯上調(diào)了Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)。且飛揚腸胃炎膠囊中、高劑量組與蘭索拉唑組改善Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的作用相當(dāng)。

圖2 Nrf2和HO-1蛋白的免疫組化表達(dá) (200×)

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，飛揚腸胃炎膠囊具有明顯的抗GU作用，包括減少GU面積，升高胃內(nèi)容物pH值，減輕黏膜下水腫和白細(xì)胞浸潤。乙醇干擾胃腺的分泌活動，改變細(xì)胞的通透性，消耗胃黏液[11]。胃酸分泌是胃黏膜損傷的主要侵襲性因素[12]。飛揚腸胃炎膠囊預(yù)處理能夠顯著升高模型組大鼠胃內(nèi)容物pH值并抑制GWM的減少，提示沒食子酸和飛揚腸胃炎膠囊的胃保護作用可通過調(diào)節(jié)胃內(nèi)容物pH值和GWM來發(fā)揮。

NO和 PGE-2是保護胃黏膜的關(guān)鍵介質(zhì)，NO可保護胃黏膜免受各種有害物質(zhì)的損傷[13-15]，PGE-2可防止乙醇引起的黏膜壞死和出血[16]，有利于GU愈合[17-18]。在目前的研究中，飛揚腸胃炎膠囊低、中、高劑量組大鼠胃黏膜中NO和PGE-2水平增加，表明NO和PGE-2可能參與了飛揚腸胃炎膠囊對實驗性GU的保護作用。

氧化應(yīng)激的發(fā)生通常與活性氧(ROS)的產(chǎn)生相關(guān)。正常情況下，這些ROS被GSH、CAT和SOD等重要的內(nèi)源性抗氧化劑所中和。然而，當(dāng)氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生時，ROS的產(chǎn)生和積累超過了細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)或防御系統(tǒng),不能很好地中和這些氧化物[19]。研究表明，氧化應(yīng)激和內(nèi)源性抗氧化分子的減少與乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷發(fā)病機制有關(guān)[14]。丙二醛(MDA)是氧化應(yīng)激的標(biāo)志性產(chǎn)物，是不飽和脂肪酸通過ROS激活的脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生[20]。因此，MDA被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物，被用于量化和鑒定氧化應(yīng)激[9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，飛揚腸胃炎膠囊可以提高GSH、CAT和SOD的水平，并抑制TBARS的產(chǎn)生，表明飛揚腸胃炎膠囊主要通過抑制氧化應(yīng)激來對抗乙醇誘導(dǎo)的胃損傷。

Nrf2信號通路可激活內(nèi)源性抗氧化酶，在保護細(xì)胞免受氧化損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21-22]。在生理條件下，Nrf2與負(fù)調(diào)控因子Keap1結(jié)合，并被定向固定在細(xì)胞質(zhì)中。然而，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1分離，然后易位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)HO-1的蛋白表達(dá)[23]。HO-1又稱熱休克蛋白32(HSP32)，可直接或通過抑制ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用。而Nrf2/HO-1信號通路亦被證實與胃黏膜損傷的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。在本研究中，飛揚腸胃炎膠囊可顯著增加Nrf2的蛋白表達(dá)并上調(diào)HO-1，提示飛揚腸胃炎膠囊可通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮胃保護作用。