宋子華 萬維松 楊春蓉 王曉璐

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 病理科 & 三峽大學(xué) 病理學(xué)研究所， 湖北 宜昌 443003)

近年來由于各種免疫抑制劑、腫瘤化療藥物和糖皮質(zhì)激素的廣泛使用，使得真菌感染發(fā)病率不斷上升，尤以肺部真菌感染居首位[1]。由于部分患者的癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特征性，病原體檢測有助于患者的確診和治療[2]。通過HE染色法進(jìn)行病理診斷往往耗時長且陽性率低。另外，盡管實(shí)時熒光定量PCR對于真菌檢測敏感性高，但對實(shí)驗室硬件要求高、費(fèi)用昂貴且操作過程中易污染。因此在臨床實(shí)踐中，特殊染色對于診斷真菌感染仍然是經(jīng)典方法。六胺銀(periodic acid-silver methenamine，PASM)染色法是一種臨床常用的重要特殊染色技術(shù)[3-6]。通過PASM染色觀察曲霉菌和毛霉菌的菌絲有無分隔，分支的角度以及染色強(qiáng)度，有助于區(qū)別曲霉菌和毛霉菌[7]。但PASM染色受多種因素影響，本研究比較了目前臨床工作中兩種常用的PASM染色孵育方法在不同時間點(diǎn)對真菌染色的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月～2018年4月在我院病理科確診的真菌感染病例標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器

試劑：六胺銀試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，內(nèi)含高碘酸溶液、硼砂、六次甲基四胺銀粉劑、硫代硫酸鈉溶液，以及伊紅染液。每次染色前，將其中一瓶硼砂溶液與一瓶六次甲基四胺銀粉劑混合成一份工作液，即用即棄。儀器：全自動超聲組織處理系統(tǒng)(型號HT-3)、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋及立式染缸。

1.3 方法

①切片、烤片：同一標(biāo)本分為兩組，將石蠟包埋組織樣本3 μm連續(xù)切片10張，烤片30 min；②脫蠟至水：在染缸內(nèi)分別經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫蠟5 min；無水乙醇Ⅰ處理1 min、無水乙醇Ⅱ、 95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇各處理30 s，流水沖洗3 min；③PASM染色：切片經(jīng)高碘酸溶液氧化15 min，流水沖洗2 min后，分別放入經(jīng)62℃預(yù)熱工作液的全自動超聲組織處理系統(tǒng)(型號HT-3)和HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋孵育5 min、10 min、15 min、20 min和30 min；流水沖洗2 min后置入硫代硫酸鈉溶液處理3 min，流水沖洗2 min；④伊紅復(fù)染：伊紅染液復(fù)染30～60 s；⑤常規(guī)脫水/透明后中性樹膠封固。

1.4 鏡下判讀標(biāo)準(zhǔn)

切片染色完畢后交由兩名病理醫(yī)師進(jìn)行鏡下觀察并用雙盲評分，評分采用林倩等[8]針對銀球菌染色判讀使用的十分制標(biāo)準(zhǔn)：①染色背景清晰；②菌體呈黑色；③莢膜或隔清晰透明；④細(xì)胞核或菌絲清晰；⑤周圍組織呈淡棕色至棕色。上述5項指標(biāo)若有不同程度的缺陷，則減0.1～2分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組的評分結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用t檢驗比較兩種染色方法之間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲組織處理儀組與水浴組的PASM染色評分

共收集78例真菌確診病例的標(biāo)本，其中曲霉菌60例、隱球菌15例、毛霉菌3例。分別使用超聲組織處理儀和水浴鍋對PASM染色標(biāo)本62℃孵育，對兩組切片孵育5 min、10 min、15 min、20 min、30 min的得分進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，超聲組織處理儀組PASM染色得分為9.23±0.25分，顯著高于水浴鍋組7.68±0.06分，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0. 01)，見表1。

表1 超聲組織處理儀組與水浴組六胺銀染色評分比較

2.2 兩組在相同溫度下不同時間的組織結(jié)構(gòu)

經(jīng)PASM染色后分別經(jīng)水浴鍋和超聲組織處理儀62℃孵育5 min、10 min、15 min、20 min和30 min后的染色圖片見圖1。水浴組結(jié)果顯示：62℃孵育5 min無陽性表達(dá)；10 min可見散在孢子陽性，但菌絲未見陽性；15 min可見孢子廣泛陽性表達(dá)，菌絲表達(dá)弱陽性；20 min可見菌絲，孢子均廣泛陽性表達(dá)，染色背景干凈；30 min染色背景過強(qiáng)，掩蓋了孢子，菌絲的表達(dá)。超聲組織處理儀組結(jié)果顯示：62℃孵育5 min孢子陽性，菌絲未表達(dá)；10 min孢子強(qiáng)陽性表達(dá)，菌絲弱陽性表達(dá)；15 min孢子和菌絲均強(qiáng)陽性表達(dá)，且染色背景干凈；但孵育20 min和30 min則背景過強(qiáng)，掩蓋了孢子菌絲的表達(dá)。兩組不同孵育時間與染色效果對比見圖2，結(jié)果提示PASM染色在超聲組織處理儀62℃孵育15 min時顯色最佳，而采用水浴法達(dá)到相同的染色效果則需要孵育20 min。

注： 62℃水浴孵育和超聲組織處理儀孵育5 min、10 min、15 min、20 min、30 min的PASM染色效果(200×)，真菌菌絲呈棕褐色圖1 兩組在不同孵育時間的PASM染色效果

圖2 兩組不同染色時間與染色效果對比

3 討論

PASM其原理是真菌經(jīng)高碘酸氧化，使其胞壁內(nèi)的粘多糖暴露出醛基后將PASM還原為黑色的金屬銀。因此，孵育的方法、溫度和時間是PASM染色的關(guān)鍵[9]。超聲波、微波和水浴等方法均能加強(qiáng)試劑對組織的穿透作用，但微波法不容易控制試劑的溫度，組織標(biāo)本溫度過高會引起組織的收縮和硬化[10]。大多數(shù)實(shí)驗室目前仍然沿襲傳統(tǒng)的水浴鍋對PASM真菌染色進(jìn)行孵育。水浴加熱是利用熱傳導(dǎo)的原理將熱量從被加熱物外部傳入內(nèi)部，均勻加熱。要使中心部位達(dá)到所需溫度，需要一定的時間。單一的水浴加熱作用較弱、所需時間較長，掌控不好會使背景著色重而影響病理醫(yī)師對結(jié)果的判讀[11]。而超聲組織處理儀在加熱過程中應(yīng)用空化效應(yīng)動力學(xué)原理，當(dāng)足夠強(qiáng)度的超聲波通過液體時，存在于液體中的微小氣泡就會迅速增大，形成高溫伴強(qiáng)大沖擊波和時速達(dá)400 km的射流，能有效改善細(xì)胞膜的通透性，使被加熱物本身成為發(fā)熱體。此外其增溫效應(yīng)使分子間的運(yùn)動加速，短時間內(nèi)達(dá)到加熱效果，提高試劑與細(xì)胞內(nèi)水分子交換速度和滲透力，有效縮短加熱的時間[12， 13]。通過內(nèi)外同時加熱可有效提高試劑對組織的滲透速度，且相比直接加熱試劑可避免高溫引起的組織收縮和蛋白變性[14-16]。用該原理將PASM染色液與組織切片反應(yīng)，通過超聲運(yùn)動速度，促使真菌游離的醛基還原PASM的銀離子，可實(shí)現(xiàn)快速染色[17]。

本研究比較了日常工作中較常使用的超聲組織處理儀和傳統(tǒng)水浴鍋在相同的孵育溫度下不同反應(yīng)時間點(diǎn)對PASM真菌染色的效果。兩者均是基于恒溫加熱原理進(jìn)行工作，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。水浴鍋的使用更為常見，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但加熱過程偏長。全自動超聲組織處理儀短時間內(nèi)就可以顯示出孢子和菌絲的表達(dá)，孵育和染色的時間短且染色效果好，能滿足臨床病理診斷優(yōu)質(zhì)染色切片的要求，可使患者盡早得到診斷和臨床治療。本研究結(jié)果顯示，PASM染色在62℃下超聲組織處理儀孵育15 min時顯色最佳，而采用水浴法達(dá)到相同的染色效果則至少需要孵育20 min，這較大的縮短了標(biāo)本處理時間，與其他研究結(jié)果一致[18， 19]。通過比較78例標(biāo)本染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲組織處理儀組的PASM染色得分為(9.23±0.25)分，顯著高于水浴鍋組(7.68±0.06)分，證明超聲組織處理法的染色效果優(yōu)于水浴加熱法。此外，超聲組織處理儀操作簡單、可根據(jù)需要設(shè)置組織處理時間、試劑溫度和超聲波輸出功率，可滿足臨床工作中的HE染色、特殊染色、免疫組化等多種檢測技術(shù)的要求[20]。

本研究的不足之處在于納入研究的真菌病例中絕大多數(shù)為曲霉菌(60例)，而隱球菌和毛霉菌例數(shù)較少(分別為15例和3例)。雖然我們在同一方法組內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)這3種真菌的染色強(qiáng)度存在明顯差異，但由于隱球菌和毛霉菌樣本含量較少，尚不能排除種屬的差異可能導(dǎo)致染色效果不同。今后將擴(kuò)大樣本量，對同一方法組內(nèi)3種真菌的染色效果進(jìn)一步研究以評判不同類型真菌染色是否存在差異。

超聲組織處理儀能夠較為精確地控制PASM真菌染色的溫度和時間，其染色效果優(yōu)于水浴加熱法，具有較高的應(yīng)用及推廣價值。