朱 琳，張思月，馮佩瑤，孔慶辰，陳 琦，鐘為章

（河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊050018）

0 引 言

根據(jù)《中國統(tǒng)計(jì)年鑒》（2019年版）數(shù)據(jù)顯示，全國主要農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達(dá)861萬t，產(chǎn)量巨大。其中大約31%的秸稈被露天燃燒、還田和隨意丟棄，這種處理秸稈的方式在我國普遍存在，每年總量高達(dá)約2億t的作物秸稈被浪費(fèi)，同時(shí)也引發(fā)了溫室氣體的大量排放，以及農(nóng)作物病蟲害的增多等嚴(yán)重的環(huán)境問題。

秸稈是潛在的生物質(zhì)能源的來源，若將其進(jìn)行有效利用，不僅能減少因室外秸稈自然腐敗而生成的甲烷等溫室氣體的排放，還能獲得清潔能源甲烷和沼渣、沼液等有機(jī)肥料，從而有效地緩解現(xiàn)今的能源危機(jī)和解決環(huán)境污染問題。

厭氧消化技術(shù)是目前普遍使用的處理技術(shù)，是一個(gè)非常復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，受到相互藕合、相互作用等多重因素的影響。由于厭氧消化技術(shù)對(duì)纖維素類生物質(zhì)難以降解，因此，需對(duì)農(nóng)作物秸稈進(jìn)行預(yù)處理。

目前，已有的預(yù)處理方法中機(jī)械或物理法、以及化學(xué)與物理化學(xué)法的能耗較高，且存在不同程度的環(huán)境污染。

相對(duì)而言，生物預(yù)處理法具有能耗低、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，符合現(xiàn)今社會(huì)提倡的綠色經(jīng)濟(jì)、循環(huán)經(jīng)濟(jì)以及低碳經(jīng)濟(jì)的要求，但其缺點(diǎn)也明顯，預(yù)處理時(shí)間和生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)氣率低，因而限制了工業(yè)化的應(yīng)用。

近年來，國內(nèi)關(guān)于生物法預(yù)處理秸稈生物質(zhì)制沼氣的研究較多，處理秸稈主要是玉米秸稈、小麥秸稈和稻草等。所用微生物菌種大多數(shù)是篩選出的單菌株，而使用復(fù)合菌系的不多，因此效果不是很理想。

劉思穎從腐木中分離獲得一株短小芽孢草桿菌屬J33，將其用于預(yù)處理稻草秸稈進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵20 d后，產(chǎn)氣量比自然堆漚處理的秸稈總產(chǎn)氣量提高了26.7%。

國外關(guān)于生物法預(yù)處理秸稈生物質(zhì)后用于制取沼氣的研究較少，主要底物是作物秸稈和能源草等，其中使用擔(dān)子菌類處理的較多。

Ghosh等人利用白色腐敗菌和褐腐菌來處理稻草，最大沼氣產(chǎn)率為479.40 L/kg干物質(zhì)，甲烷產(chǎn)率分別達(dá)到了327.90、430.95和295.95 L/kgTS，而未處理組僅為355.8 L/kgTS和224.3 L/kgTS，甲烷產(chǎn)率分別提高了46.19%和31.94%。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M自然條件下纖維素的分解過程，利用微生物之間的協(xié)同關(guān)系，根據(jù)酸堿互補(bǔ)原則，組合優(yōu)化酸堿反應(yīng)不同的纖維素降解菌群，通過纖維素酶活測(cè)定，菌系復(fù)篩，篩選制備出穩(wěn)定高效降解纖維素的復(fù)合菌劑。

這種復(fù)合協(xié)同的預(yù)處理菌劑，可以有效地破壞木質(zhì)素的密封，打亂纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，即減少木質(zhì)素的抗性和不透性，從而使生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素易被微生物水解和轉(zhuǎn)化為單糖，加快啟動(dòng)，大大縮短了處理的時(shí)間，進(jìn)一步提高了生物質(zhì)產(chǎn)沼氣的效率，從而實(shí)現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)、綠色經(jīng)濟(jì)和低碳經(jīng)濟(jì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 玉米秸稈

試驗(yàn)采用玉米秸稈，先用鍘刀將秸稈切割成小段（1～3）cm，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，用40目篩過篩，取篩下物于干燥通風(fēng)處待用。

1.1.2 微生物復(fù)合菌劑

本研究所用微生物復(fù)合菌劑為本課題組前期研究開發(fā)得到，其中成分和制作方法見相關(guān)專利。

1.1.3 試驗(yàn)用培養(yǎng)基

（1）蛋白胨纖維素培養(yǎng)基（PCS）。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）；高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基。

（3）篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基；濾紙條培養(yǎng)基；剛果紅纖維素培養(yǎng)基。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)對(duì)秸稈生物質(zhì)成分的分析與特點(diǎn)對(duì)比，通過生物質(zhì)預(yù)處理、厭氧消化技術(shù)等的綜合運(yùn)用，生產(chǎn)出環(huán)境友好型沼氣能源。

以農(nóng)作物秸稈或處理后的材料為原料，進(jìn)行產(chǎn)品的更新和創(chuàng)新，主要研發(fā)一種高效纖維素降解復(fù)合菌劑，優(yōu)化厭氧消化技術(shù)，從而將秸稈轉(zhuǎn)化為生物燃?xì)夂陀袡C(jī)肥料進(jìn)一步加以利用。

1.2.1 纖維素（CMC）酶活的測(cè)定分析

纖維素酶活的測(cè)定參考中國人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)QB2583-2003。

（1）試劑。

①DNS試劑。

②0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

①1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

③以吸光值OD540值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（μg）為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(1)生成k個(gè)滿足假設(shè)5和假設(shè)6的隨機(jī)整數(shù)xk，表示第k個(gè)時(shí)間段乘坐電梯的人數(shù)，并將xk個(gè)人隨機(jī)的分到第l樓；

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

（3）粗酶液的制備。

培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液20 mL，在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為8 000 rpm的條件下，在高速離心機(jī)中離心15 min，取上清液，即為粗酶液。

（4）CMC酶活測(cè)定。

將稀釋至合適濃度的酶液0.5 mL，加入到1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC溶液（溶于0.1 mol/L，pH=4.8的HAc-NaAc緩沖液中）中，水浴鍋50℃下恒溫30 min，再加入1.5 mL DNS試劑，置于沸水浴中5 min，冷卻，稀釋至25 mL，在540 nm下測(cè)吸光度值。

每min水解1%的CMC溶液產(chǎn)生1μg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)CMC酶活力單位（U）。

根據(jù)測(cè)得的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量（μg），按下式計(jì)算CMC酶活力：

1.2.2 高效纖維素降解菌的復(fù)篩

將篩選出的纖維素降解菌株在剛果紅纖維素培養(yǎng)基的中央進(jìn)行點(diǎn)接種，之后，置于常溫25℃下培養(yǎng)，分別記錄水解圈和菌落的直徑。

根據(jù)水解圈直徑（d）和菌落直徑（D）得到d/D的比值。d/D越大，說明其纖維素分解能力越強(qiáng)，生長速度越快。

1.2.3 高效纖維素降解復(fù)合菌群的構(gòu)建

將篩選出的所產(chǎn)纖維素酶活較多的菌株，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行混合，然后接種到裝有100 mL液體的發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，放置于恒溫振蕩器中，在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150 rpm條件下恒溫培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基中的濾紙條分解情況，確定效果最佳的高效纖維素降解復(fù)合菌群。

2 結(jié)果討論與分析

2.1 掃描電鏡（SEM）觀察

對(duì)未預(yù)處理和經(jīng)過高效纖維素降解復(fù)合菌劑預(yù)處理的作物秸稈進(jìn)行了電鏡掃描，觀察其微觀表面形態(tài)，以便從微觀形態(tài)上直觀地了解生物預(yù)處理前后的玉米秸稈的纖維組織的變化情況。

不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的電鏡掃描照片如圖2所示。

圖2 不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的電鏡掃描圖像Fig.2 SEMimages of corn straw with different biological pretreatment times

由圖2（a）可以看出，未預(yù)處理的秸稈表面比較完整光滑，纖維組織排列有序，結(jié)構(gòu)致密，無明顯的破損和孔隙。

由經(jīng)過復(fù)合菌劑預(yù)處理后的圖2（b）和（c）可以看出，作物秸稈的表面粗糙，凹凸不平，疏松多孔，出現(xiàn)了明顯的裂紋、裂片，甚至呈蜂窩狀，這說明其中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)遭到了部分的破壞和分離，纖維和纖維束出現(xiàn)了卷曲折疊，變得柔軟疏松，排列凌亂。表面上出現(xiàn)的碎片狀的物質(zhì)很可能是其中的半纖維素和木質(zhì)素溶出物。

由圖2可以看出如下內(nèi)容。

（1）玉米秸稈經(jīng)過生物預(yù)處理后，原本致密、完整和有序的結(jié)構(gòu)受到了嚴(yán)重的破壞，這使水解酶和水解菌與其深入接觸的表面積增大，從而提高了水解效率，使水解這一厭氧消化的限速步驟得到了很好地解決。

（2）生物預(yù)處理玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和其他有機(jī)物質(zhì)能更容易地被厭氧消化和利用，其可利用性和生物降解性得到了顯著提高。

2.2 X-射線衍射（XRD）分析

通過X-射線衍射（XRD）分析生物預(yù)處理對(duì)纖維素結(jié)晶度的影響，分析纖維素結(jié)晶度與生物質(zhì)酶解抗性之間存在的關(guān)系。

未預(yù)處理和不同預(yù)處理時(shí)間的作物秸稈的X-射線衍射圖如圖3所示。

圖3 不同生物預(yù)處理時(shí)間的作物秸稈的X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction pattern of corn straw with different biological pretreatment times

由圖3可以看出如下內(nèi)容。

（1）經(jīng)過復(fù)合菌劑預(yù)處理后作物秸稈的衍射圖譜的形狀基本與未經(jīng)預(yù)處理的相同，沒有發(fā)生根本的改變，只是存在強(qiáng)度上的差異。

（2）秸稈原料與經(jīng)過復(fù)合菌劑預(yù)處理后物料的晶型結(jié)構(gòu)為典型纖維素Ⅰ型，其XRD圖譜均在2θ為16°和22°出現(xiàn)了典型的纖維素Ⅰ型的特征峰，生物預(yù)處理后，物料僅在兩處的衍射峰強(qiáng)度減少，說明生物預(yù)處理并沒有破壞秸稈物料的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

（3）隨著生物預(yù)處理時(shí)間的增加，在2θ為16°和22°附近的波峰的衍射強(qiáng)度越來越大。

2.3 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量變化與分析

未預(yù)處理和生物預(yù)處理的玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量見表1。

表1 不同生物預(yù)處理時(shí)間后的玉米秸稈中主要成分的變化Table 1 Changes of main compositions in corn strawafter different biological pretreatment time

由表1可以看出如下內(nèi)容。

（1）未經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分別占玉米作物秸稈干物質(zhì)含量的41.16%、28.13%和8.72%，三者之和占到玉米秸稈干物質(zhì)量的78.01%。將其用于厭氧消化，是厭氧微生物生長的主要碳源，其含量和可生物降解性能對(duì)玉米秸稈的消化性能是最直接的決定因素，同時(shí)也決定了玉米秸稈的產(chǎn)氣量的高低和厭氧消化時(shí)間的長短。

（2）經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理后，玉米秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量都有了明顯的降低，與未預(yù)處理的相比，5、10、15和20 d的總纖維素分別下降了5.44%、10.06%、21.27%和25.10%。由此可以看出，相當(dāng)數(shù)量的木質(zhì)纖維素被分解而生成了其它的成分。

（3）經(jīng)過生物預(yù)處理的玉米秸稈的木質(zhì)素與纖維素的比值均比未預(yù)處理的比值小，從另一方面反應(yīng)出生物預(yù)處理后的玉米秸稈的生物降解性的增強(qiáng)。

（4）生物預(yù)處理作用降解了相當(dāng)數(shù)量的木質(zhì)纖維素，從而預(yù)處理后的玉米秸稈中木質(zhì)纖維素的含量也降低不少，這樣阻礙厭氧菌作用的物質(zhì)越少，也越有利于其消化。

（5）纖維素和半纖維素隨著木質(zhì)素的去除而被釋放出來，從而增加了纖維素和半纖維素中微生物的可利用的程度，使得被厭氧微生物更易接觸和作用。

（6）木質(zhì)素、纖維素和半纖維素這些大分子物質(zhì)被轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，上述作用共同促進(jìn)了玉米秸稈的消化性能，提高了其產(chǎn)氣率。

2.4 每日生物氣產(chǎn)量

未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的每日生物氣產(chǎn)量如圖4所示。

圖4 未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的每日產(chǎn)氣量Fig.4 Daily biogas production of corn straw untreated and different biological pretreatment times

由圖4可以看出如下內(nèi)容。

（1）每日生物氣產(chǎn)量有著類似的趨勢(shì)，未預(yù)處理與經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理的玉米秸稈的主要不同是峰數(shù)、每日產(chǎn)氣量值以及生物氣產(chǎn)生的持續(xù)時(shí)間。一般而言，與未預(yù)處理玉米秸稈對(duì)照樣相比，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈在更短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)有更高的每日沼氣產(chǎn)量。

（2）在第10 d出現(xiàn)了1個(gè)產(chǎn)氣高峰，這說明生物預(yù)處理使能更好的被厭氧消化的成分增加了。

（3）經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理樣品的每日生物氣產(chǎn)氣峰數(shù)與產(chǎn)量值均比未預(yù)處理的多。

（4）經(jīng)預(yù)處理后的玉米秸稈的產(chǎn)氣性能出現(xiàn)了明顯的加強(qiáng)。

經(jīng)預(yù)處理后玉米秸稈的可厭氧消化的有效成分增多，從而在相同的秸稈量下有更多的生物氣產(chǎn)量，即單位玉米秸稈的產(chǎn)氣量得到了提高，也即玉米秸稈的利用效率得到了有效提高。

2.5 累積生物氣產(chǎn)量

未預(yù)處理和不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈在30 d內(nèi)的累積產(chǎn)氣量情況如圖5所示。

圖5 未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量Fig.5 Cumulative biogas production of corn straw untreated and different biological pretreatment time

由圖5可以看出如下內(nèi)容。

（1）各組玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量曲線趨勢(shì)相似，但未預(yù)處理的累積產(chǎn)氣量的曲線較平緩，說明其增速較緩慢。

（2）微生物預(yù)處理玉米秸稈在前15 d中累積產(chǎn)氣量的增速較高，之后放緩，直到第20 d，變化幅度較小，而第20 d以后產(chǎn)氣基本停止。

（3）在30 d里的不同時(shí)間，復(fù)合菌系預(yù)處理的玉米秸稈的總產(chǎn)氣量均要明顯高于未預(yù)處理玉米秸稈。其中，15 d和20 d生物預(yù)處理的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量相對(duì)較高，且在總產(chǎn)氣量上差別不大，分別為342 mL和365 mL；而5 d和10 d生物預(yù)處理的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量較低，總產(chǎn)氣量分別為286 mL和306 mL。這說明在20 d的預(yù)處理時(shí)間內(nèi)，預(yù)處理時(shí)間越長，越有利于提高玉米秸稈的產(chǎn)氣率。

2.6 產(chǎn)氣率和平均甲烷含量

未處理和不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的生物氣產(chǎn)氣率如圖6所示。

圖6 未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的生物氣產(chǎn)氣率Fig.6 Biogas production rate of corn straw untreated and different biological pretreatment times

由圖6可以看出，復(fù)合菌劑預(yù)處理的玉米秸稈的產(chǎn)氣能力比未處理的玉米秸稈均有提高，其中15 d和20 d預(yù)處理時(shí)間的產(chǎn)氣率達(dá)到了342 mLN/gTS和365 mLN/gTS，分別提高了33.07%和42.02%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合菌系預(yù)處理能大幅提高玉米秸稈的生物氣產(chǎn)量。

為了比較能源轉(zhuǎn)化率和生物降解能力，未處理和不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)氣率如圖7所示。

圖7 未預(yù)處理與不同預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)氣率Fig.7 Methane production rate of corn straw untreated and different biological pretreatment time

由圖7可以看出，5、10、15、20 d生物預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率在（131～239）mLNCH4/gTS范圍內(nèi)，比未預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率提高了26.70%～75.57%。這個(gè)結(jié)果更加證明了生物預(yù)處理能有效地增加玉米秸稈的生物降解能力和生物能產(chǎn)率。

本研究的生物預(yù)處理后的甲烷產(chǎn)氣率比先前的報(bào)道要高，這主要是由于微生物預(yù)處理提高了其產(chǎn)氣率。

沼氣中所含能量不僅取決于沼氣的體積，還和其中的有效成分甲烷有關(guān)。未預(yù)處理和不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈所產(chǎn)生物氣中有效成分甲烷的平均含量見表2。

表2 未預(yù)處理和不同生物預(yù)處理時(shí)間的玉米秸稈所產(chǎn)生物氣中平均甲烷含量Table 2 Average methane content in biogas produced by corn strawuntreated and different biological pretreatment times

由表2可以看出，復(fù)合菌劑預(yù)處理不僅能提高玉米秸稈所產(chǎn)生物氣體積，還能提高其中甲烷的含量，即提高其品質(zhì)。

3 結(jié) 論

在本研究中，對(duì)復(fù)合菌劑預(yù)處理玉米秸稈的重要影響因素進(jìn)行了深入分析，對(duì)秸稈表面微觀物理結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了SEM掃描觀察，化學(xué)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了XRD分析，化學(xué)成分變化進(jìn)行了半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量和每日產(chǎn)氣量，累積產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)氣率等的測(cè)定，主要結(jié)果如下：

（1）通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈的表面物理結(jié)構(gòu)變得疏松和凹凸不平，出現(xiàn)了明顯的分層脫落和很多水解破洞，且去纖維化隨著預(yù)處理時(shí)間的延長而加劇。被木質(zhì)素緊裹的纖維素和半纖維素裸露出來，使得其更易被厭氧消化細(xì)菌接觸到并消化利用。

（2）通過XRD分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈中纖維素的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化顯著，部分纖維素和半纖維素中的重要連接鍵被破壞，從而被降解成了易消化利用的小分子物質(zhì)。此外，木質(zhì)素和纖維素、半纖維素之間的酯鍵發(fā)生斷裂，從而使木質(zhì)纖維素的網(wǎng)聯(lián)結(jié)構(gòu)遭到破壞。

（3）通過纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量有了明顯的降低，并且預(yù)處理時(shí)間越長，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量下降越多。

（4）經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理樣品的產(chǎn)氣性能出現(xiàn)了明顯的加強(qiáng)，可厭氧消化的有效成分增多，從而在相同的秸稈量下有更多的生物氣產(chǎn)量，即單位玉米秸稈的產(chǎn)氣量得到了明顯提高。

（5）復(fù)合菌劑預(yù)處理不僅能夠提高玉米秸稈所產(chǎn)生物氣的體積，還能提高其中甲烷的含量，即提高其品質(zhì)。經(jīng)復(fù)合菌劑預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率相對(duì)于未預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率有明顯提高，由此證明了復(fù)合菌劑預(yù)處理能有效地提高玉米秸稈可生物降解性和甲烷產(chǎn)率。