胡冰瑩，韋陽(yáng)，孫瑩瑩，陳姍姍（杭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江省神經(jīng)精神疾病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310013）

格拉司瓊（granisetron）是一種強(qiáng)效高選擇性外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺3受體拮抗劑，可拮抗上端小腸腹部向心神經(jīng)纖維和孤束核或嘔吐化學(xué)感受區(qū)上的5-羥色胺3受體，從而預(yù)防和治療化療及放療等引起的惡心和嘔吐[1]。與其他止吐藥相比，格拉司瓊具有效應(yīng)高、選擇性高且毒性低等特點(diǎn)，是臨床止吐首選藥之一[2]。

臨床上，格拉司瓊制劑以片劑和注射劑為主[3]?？诜窭经傄蚴走^效應(yīng)明顯，絕對(duì)生物利用度僅為60%，且個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)差異很大，消除半衰期和總的血漿清除率有10倍以上的差異[4]。而注射劑的劑型特點(diǎn)限制了其使用。

貼劑為透皮給藥系統(tǒng)，能避免肝臟的首過效應(yīng)和藥物在胃腸道的降解，藥物吸收過程中的個(gè)體差異較口服給藥小，且患者依從性好，能突破格拉司瓊口服制劑和注射劑的多種局限[5-7]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2008年批準(zhǔn)了首個(gè)用于控制化療患者惡心與嘔吐的格拉司瓊透皮貼劑（SANCUSO）且已有該藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道[8-10]。國(guó)產(chǎn)格拉司瓊透皮貼劑的相關(guān)研究較少，僅有少量三天制劑[11-12]和六天制劑[13]的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，七天制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究尚未見報(bào)道。

巴馬香豬是中國(guó)特有的一種實(shí)驗(yàn)用小型豬，其皮膚的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及生理學(xué)特性都與人類的皮膚極為相似，適宜于在皮膚相關(guān)研究中作為動(dòng)物模型使用[14]。本研究以巴馬香豬為動(dòng)物模型，以SANCUSO為參比制劑，測(cè)定國(guó)產(chǎn)鹽酸格拉司瓊七天透皮給藥貼劑的藥代動(dòng)力學(xué)特性，評(píng)價(jià)其相對(duì)生物利用度。

1 材料

1.1 儀器

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（安捷倫1100雙泵、安捷倫1100脫氣儀、安捷倫1100自動(dòng)進(jìn)樣器；AB SCIEX API3000質(zhì)譜儀，Analyst 1.4工作站）。Allegra X-15R離心機(jī)（貝克曼）；AE100電子分析天平（梅特勒）；多管渦旋器（Cole-Parmer 4721-00）；超低溫冰箱（海爾）；移液器（Eppendorf）。

1.2 試藥

格拉司瓊對(duì)照品（含量：99.8%，批號(hào)：100558-200602）和鹽酸雷莫司瓊對(duì)照品（含量：99.5%，批號(hào)：100662-201202）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚和醋酸銨均為色譜純（美國(guó)TEDIA公司）；超純水由Millipore超純水儀制備。格拉司瓊七天透皮給藥貼劑（受試制劑，河南羚銳制藥股份有限公司研制，規(guī)格為每52 cm2含藥34.3 mg，批號(hào)：20130809）；格拉司瓊透皮貼劑（SANCUSO，參比制劑，ProStrakan公司，七天制劑，規(guī)格為每52 cm2含藥34.3 mg，批號(hào)：40282）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

巴馬香豬[江蘇泰州泰和生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2011-0002]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為有機(jī)相（30%甲醇-70%乙腈）∶水相（pH為4.1的12.5 mmol·L－1醋酸銨緩沖液）＝75∶25（V/V）；流速0.5 mL·min－1；進(jìn)樣量25 μL；柱溫45℃。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：Turbo Ionspray源；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；正離子模式；源溫度：400℃；離子噴霧電壓：5000 V；格拉司瓊的定量離子對(duì)為m/z313.1→m/z138.1，去簇電壓為85 V，碰撞能量為40 eV；內(nèi)標(biāo)（IS）雷莫司瓊的定量離子對(duì)為m/z280.1→m/z121.0，去簇電壓為65 V，碰撞能量為30 eV。

2.3 溶液配制

精密稱取格拉司瓊對(duì)照品兩份，用甲醇溶解并制成1.0 mg·mL－1的格拉司瓊對(duì)照品儲(chǔ)備液和質(zhì)控儲(chǔ)備液。用甲醇梯度稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備液得0.15、0.5、2.5、10、50、100、200 ng·mL－1的格拉司瓊標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用甲醇梯度稀釋質(zhì)控儲(chǔ)備液得0.15、0.25、25、150 ng·mL－1的格拉司瓊質(zhì)控工作溶液。

精密稱取鹽酸雷莫司瓊對(duì)照品溶解于適量甲醇中，制成1.0 mg·mL－1的儲(chǔ)備液，并用甲醇稀釋制備25 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

配制的溶液均于4℃保存。

2.4 樣品處理

血漿室溫下融化，渦旋10 s后，3000 r·min－1離心5 min，取0.5 mL上清液至已加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液的離心管中，加入100 μL 2 mol·L－1的NaOH，渦旋30 s混勻，加入5 mL甲基叔丁基醚，渦旋2 min，3000 r·min－1離心5 min。將離心管置于－80℃冷凍下層水相后約10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，40℃條件下氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL流動(dòng)相渦旋1 min，即得樣品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 取6份不同批次的空白血漿、定量限（LOQ，0.003 ng·mL－1）樣品和巴馬香豬使用受試制劑24 h后樣品（1.42 ng·mL－1），按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣。典型色譜圖見圖1，可見空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾格拉司瓊和內(nèi)標(biāo)雷莫司瓊的測(cè)定，方法專屬性良好。

圖1 格拉司瓊和內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖Fig 1 Representative chromatogram of granisetron and IS

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取格拉司瓊標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL和490 μL空白血漿，混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.003、0.01、0.05、0.2、1、2、4 ng·mL－1的格拉司瓊標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣。以血漿中格拉司瓊和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，以格拉司瓊和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)（1/χ）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝1.41x＋0.0115（r＝0.9999），線性范圍為0.003～4 ng·mL－1。

2.5.3 精密度和準(zhǔn)確度 精密移取格拉司瓊質(zhì)控工作溶液10 μL和490 μL空白血漿，混勻，制備4個(gè)質(zhì)量濃度水平的質(zhì)控樣品，分別為定量限濃度質(zhì)控（LOQ，0.003 ng·mL－1）、低濃度質(zhì)控（LQC，0.005 ng·mL－1）、中濃度質(zhì)控（MQC，0.5 ng·mL－1）和高濃度質(zhì)控（HQC，3 ng·mL－1）。質(zhì)控樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，考察方法的日內(nèi)及日間精密度（RSD）和準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1，表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表1 格拉司瓊分析方法的精密度和準(zhǔn)確度Tab 1 Precision and accuracy of analytical method for granisetron

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng) 取6個(gè)不同批次的空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行萃取，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至已分別加入10 μL 3個(gè)質(zhì)量濃度水平的格拉司瓊質(zhì)控工作溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液的離心管中，40℃條件下氮?dú)獯蹈?，加?00 μL流動(dòng)相渦旋1 min，進(jìn)樣25 μL。峰面積記為B。另取490 μL水代替490 μL空白血漿，重復(fù)以上操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行做6份，峰面積記為A。B/A的值即為基質(zhì)因子，并用內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子對(duì)格拉司瓊的基質(zhì)因子進(jìn)行歸一化。結(jié)果表明，在LQC、MQC和HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品中，格拉司瓊的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子分別為97.50%、125.20%和122.99%，且6個(gè)不同批次血漿間LQC、MQC、HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品中內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子的RSD分別為13.0%、6.0%和5.6%。

2.5.5 提取回收率 取LQC、MQC和HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度平行做5份，峰面積記為C。與“2.5.4”中用同一批空白血漿制備的樣品峰面積B計(jì)算比值C/B，即為提取回收率。結(jié)果表明，在LQC、MQC和HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品中格拉司瓊的提取回收率平均值分別為81.75%、89.76%、93.21%，RSD分別為12.6%、5.0%、5.9%，內(nèi)標(biāo)的提取回收率平均值為86.53%，RSD為12.0%。

2.5.6 穩(wěn)定性考察 取LQC、MQC和HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，在室溫下放置3 h、凍融3次和－80℃放置60 d后，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣。結(jié)果見表2，表明格拉司瓊在以上條件下均有良好的穩(wěn)定性。取LQC、MQC和HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法萃取，在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置12 h后分析測(cè)定。結(jié)果見表2，表明格拉司瓊在該條件下穩(wěn)定性良好。

表2 格拉司瓊的短期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和處理后樣品穩(wěn)定性(n＝3)Tab 2 Matrix stability and processed sample stability of granisetron (n＝3)

2.5.7 稀釋可靠性 配制6 ng·mL－1格拉司瓊血漿樣品，吸取100 μL該溶液到離心管中，再加入400 μL空白血漿，混勻，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，樣品平行做6份。結(jié)果表明，樣品經(jīng)稀釋5倍后測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度為102.08%，RSD為5.4%。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度

2.6.1 給藥方案 6月齡的健康巴馬香豬10只，雌雄各半，體質(zhì)量（15.20±1.98）kg，實(shí)驗(yàn)期間正常飲食。在給予貼劑前一日，將上腹部毛發(fā)剃干凈，給藥前再剃一次，應(yīng)保證皮膚不被創(chuàng)傷。

采用區(qū)組隨機(jī)、兩周期、自身交叉、單次給藥的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，將10只巴馬香豬分為兩組，每組5只。第一組先給予格拉司瓊透皮貼劑受試制劑，后給予參比制劑，第二組給藥順序相反。每次給藥時(shí)間為7 d，兩次給藥時(shí)間間隔為17 d。給藥劑量均為0.626 mg·kg－1，即0.9552 cm2·kg－1。

2.6.2 血漿樣品采集測(cè)定 在給藥前及給藥后6 h、12 h、24 h、d2、d3、d4、d5、d6、d7（移去貼劑前及移去貼劑后4 h、8 h和12 h）、d8、d9、d10和d11于豬前腔靜脈叢取血3 mL。血樣置于肝素抗凝管中并混勻，3000 r·min－1離心5 min，分離血漿，分成兩份（每份不少于0.5 mL），－80℃冷凍待測(cè)。待測(cè)樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定。計(jì)算平均血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖2。

圖2 10只巴馬香豬使用受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of 10 bama miniature pigs after the administration of test preparation（rhombus）and reference preparation（square）

2.6.3 貼劑藥物殘留量測(cè)定 格拉司瓊貼劑在巴馬香豬使用7 d后，取下貼劑由河南羚銳制藥完成貼劑藥物殘留量測(cè)定，經(jīng)測(cè)定殘留藥物占給藥量的1.68%～66.01%。

2.6.4 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 使用DAS 2.1.1軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其計(jì)算原理如下：取可檢測(cè)到藥物的最后3～5個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)，對(duì)相應(yīng)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，求得末端相消除速率常數(shù)λ；半衰期t1/2＝0.693/λ；tmax和Cmax取實(shí)測(cè)值；用梯形法求算藥-時(shí)曲線下面積AUC0～t值；AUC0～∞＝AUC0～t＋Ct/λ（Ct為末次可測(cè)樣本的血藥濃度）。結(jié)果見表3。

表3 巴馬香豬使用受試制劑及參比制劑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of bama miniature pigs after the administration of test preparation and reference preparation

2.6.5 統(tǒng)計(jì)分析及生物利用度計(jì)算Cmax、AUC0～t和AUC0～∞運(yùn)用多因素方差分析，tmax運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。相對(duì)生物利用度F（%）＝（AUC0～∞受試/AUC0～∞參比）×100%。

交叉給予受試制劑和參比制劑格拉司瓊透皮貼劑后，巴馬香豬體內(nèi)的tmax、Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。受試制劑相對(duì)參比制劑的F為102.3%。表明兩種制劑的吸收消除過程相似。

3 討論

巴馬香豬分別交叉給予受試制劑和參比制劑格拉司瓊透皮貼劑后，藥物經(jīng)皮吸收較好。血藥濃度在給藥12 h后達(dá)到峰值，隨后開始下降，但在給藥2 d內(nèi)均可維持在一個(gè)較高的濃度水平。給藥7 d后撤藥，撤藥后血藥濃度逐步降低，撤藥4 d后（即給藥11 d）血藥濃度已低于檢測(cè)方法的LOQ（0.003 ng·mL－1），這一現(xiàn)象在受試制劑和參比制劑之間并無明顯差異，推測(cè)不會(huì)對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和生物利用度結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

使用兩種制劑后的t1/2、tmax、Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均無顯著差異，表明兩種制劑的一致性較高，但給藥后個(gè)體間的代謝特征差異較大。受試制劑Cmax均值為1.658 ng·mL－1（變異系數(shù)CV為72.5%），AUC0～∞均值為2.962 ng·d·mL－1（CV為58.0%）；參比制劑Cmax均值為1.693 ng·mL－1（CV為87.2%），AUC0～∞均值為2.918 ng·d·mL－1（CV為47.1%）；而根據(jù)參比制劑的產(chǎn)品說明書，其臨床試驗(yàn)Cmax的均值為5.0 ng·mL－1（CV為170%），AUC0～168h均值為 527 ng·h·mL－1（CV為173%），同樣表現(xiàn)出個(gè)體差異較大的特征。此外，藥物殘留量也表現(xiàn)出較大差異（1.68%～66.01%），但同一給藥個(gè)體使用兩種制劑后的藥物殘留量具有較好的一致性，且AUC0～∞和藥物殘留量也表現(xiàn)出一定相關(guān)性，藥物殘留量較少的個(gè)體相對(duì)具有較大的AUC0～∞。