王 新，蔣彩云，李玲玲，劉海浪，馮鑫葦

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 健康學(xué)院，江蘇 南京 211168)

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪的干燥成熟種子，主要含有沙苑子甙、沙苑子新甙、沙苑子楊梅甙、紫云英甙、山柰素，以及多肽、蛋白質(zhì)、酚類等成分。作為傳統(tǒng)中藥，其性溫味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有溫補(bǔ)肝腎、降壓降脂、利尿澀精等功效[1-2]，可用于治療肝腎虧虛、白濁帶下、頭暈?zāi)垦５劝Y。

于猛等人通過計(jì)算機(jī)模擬的方法，初步探討了沙苑子苷A潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)，并采用CDOCKER進(jìn)行分子對(duì)接初步驗(yàn)證。結(jié)果表明，沙苑子苷A可調(diào)控原癌基因酪氨酸蛋白激酶以及蛋白纖維生長的受體，從而進(jìn)一步得出沙苑子苷A確實(shí)能夠調(diào)控血管生長的相關(guān)靶點(diǎn)，可能是抗腫瘤作用的主要活性成分[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，沙苑子具有抗疲勞、延緩機(jī)體衰老等保健功能。同時(shí)，沙苑子及其復(fù)方制劑也可以通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫和非特異性免疫的方式發(fā)揮抗炎、抗癌的功效[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，沙苑子的化學(xué)成分主要包括黃酮類、三萜皂苷類、脂肪酸、氨基酸、多糖等[6-7]。其中，沙苑子總黃酮具有較強(qiáng)的抗癌、抗氧化能力[8-9]，是沙苑子發(fā)揮藥理作用的主要成分。

本文選用的標(biāo)準(zhǔn)參照物為維生素C，結(jié)合單因素考察法和正交試驗(yàn)法，分析沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝，并進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

沙苑子(安徽省亳州市雙華中藥飲片廠)、無水乙醇、1,3-丁二醇、甲醇、1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、維生素C，實(shí)驗(yàn)用水皆為去離子純凈水。

1.1.2 設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州金壇宏華儀器廠；DR2800型紫外分光光度計(jì)：上海坤權(quán)生物科技有限公司；BS223S型電子天平：瑞士Mettler公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：華飛電熱設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙苑子中活性成分的提取

稱取沙苑子藥材，放入烘箱烘干至恒重，放入粉碎機(jī)進(jìn)行研磨粉碎，然后過篩。準(zhǔn)備等體積的不同提取劑，分別稱取沙苑子粉末1.0 g置于提取劑中，設(shè)定不同的提取條件，得到相應(yīng)含沙苑子抗氧化成分的提取液。

1.2.2 DPPH法評(píng)價(jià)沙苑子提取液的抗氧化性

1.2.2.1 配制DPPH溶液

取39.0 mg 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，加入無水乙醇使其充分溶解，定容，配制濃度為0.1 mmoL/L 的DPPH溶液，將其移至棕色試劑瓶中，避光貯存，備用。

1.2.2.2 DPPH清除率的計(jì)算方法

空樣溶液：取0.1 mmoL/L的DPPH溶液10 mL，加入比色管。

反應(yīng)溶液：取5 mL沙苑子提取液和5 mL DPPH溶液，加入比色管。

空白溶液：取10 mL空白溶劑，加入比色管。

將上述溶液置于超聲波中進(jìn)行充分混合，避光反應(yīng)半個(gè)小時(shí)。使用分光光度計(jì)，設(shè)定波長為517 nm，分別測定吸光度值(Abs)，即A空樣液，A反應(yīng)液，A空白液。

DPPH清除率(%)=[A空樣液-(A反應(yīng)液-A空白液)/A空樣液]×100%

1.2.3 DPPH法評(píng)價(jià)維生素C的抗氧化性

1.2.3.1 配制維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液

取12.5 mg維生素C粉末，置于50 mL燒杯中，加入少量純凈水使其完全溶解，移至500 mL容量瓶中定容，配制成0.025 mg/mL的維生素C溶液。分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL維生素C溶液于10 mL比色管中逐級(jí)稀釋，定容至10 mL。維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0.0015、0.0020、0.0025、0.0030、0.0035、0.0040、0.0045、0.0050 mg/mL。

1.2.3.2 制作維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2.2中的操作步驟，將反應(yīng)溶液改為5 mL不同濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用分光光度計(jì)，設(shè)定波長為517 nm，分別測定吸光度值，得出DPPH清除率的對(duì)應(yīng)值。

1.2.4 每克沙苑子樣品中抗氧化成分相當(dāng)于維生素C的含量測定

取1.0 g沙苑子樣品，在最佳提取條件下，測定所得提取液的DPPH清除率，再根據(jù)維生素C濃度與DPPH清除率的線性方程，計(jì)算每克沙苑子樣品中含有的抗氧化成分相對(duì)于維生素C的當(dāng)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的抗氧化性

采用評(píng)價(jià)自由基清除效果和挑選天然抗氧化劑最常用的方法——DPPH分光光度法，測定已知標(biāo)準(zhǔn)濃度的維生素C的抗氧化性。以維生素C濃度為橫坐標(biāo)、DPPH清除率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。兩者之間符合線性關(guān)系，得到線性方程y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)。根據(jù)線性方程，構(gòu)建評(píng)價(jià)體系，測定單位沙苑子中抗氧化活性成分相對(duì)于維生素C的當(dāng)量。

圖1 VC濃度與DPPH清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 因素水平的有效選擇

2.2.1 提取溶劑對(duì)抗氧化物提取效果的影響

分別選用無水乙醇、75%乙醇、純水、甲醇、1，3-丁二醇為提取溶劑，40 ℃加熱，攪拌30 min，過濾，得到相應(yīng)的提取液，計(jì)算各提取液的DPPH清除率。從圖2可以看出，以75%乙醇為提取溶劑時(shí)，抗氧化物提取效果最佳，純水次之。

圖2 不同提取溶劑對(duì)DPPH清除率的影響

2.2.2 提取溶劑濃度對(duì)抗氧化物提取效果的影響

分別取濃度40%、50%、60%、70%、75%、80%的乙醇，40 ℃水浴加熱30 min，抽濾，得到相應(yīng)的提取液，測定提取液的抗氧化能力。從圖3可以看出，50%乙醇的抗氧化物提取效果最佳。

圖3 不同提取溶劑濃度對(duì)DPPH清除率的影響

2.2.3 料液比對(duì)抗氧化物提取效果的影響

選用50%乙醇，40 ℃條件下提取30 min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，測定提取液的抗氧化能力。由圖4可以看出，最佳料液比為1∶30。

圖4 不同料液比對(duì)DPPH清除率的影響

2.2.4 提取溫度對(duì)抗氧化物提取效果的影響

選用50%乙醇，提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，提取時(shí)間30 min，測定提取液的抗氧化能力。從圖5可以看出，DPPH清除率隨溫度升高而升高。但是實(shí)驗(yàn)過程中需要考慮溫度過高容易導(dǎo)致溶劑量的損失及抗氧化物失活，因此，提取溫度選定70 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)DPPH清除率的影響

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)抗氧化物提取效果的影響

選用50%乙醇，提取溫度40 ℃，分別提取20、30、40、50、60 min，測定提取液的抗氧化能力。從圖6可以看出，提取30 min時(shí)，DPPH清除效果最佳。

圖6 不同提取時(shí)間對(duì)DPPH清除率的影響

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L20(44)正交試驗(yàn)，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2可知，各因素對(duì)沙苑子活性成分提取效果的影響順序?yàn)榱弦罕?提取溫度>提取溶劑濃度>提取時(shí)間。得出最佳提取工藝條件：45%乙醇、料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間30 min。

根據(jù)最佳提取工藝條件，精確量取1.0 g沙苑子粉末，加入32 mL 45%乙醇，70 ℃水浴加熱，攪拌30 min，得到提取液，稀釋后測定沙苑子提取物的DPPH清除率。平行實(shí)驗(yàn)三次，測定結(jié)果分別為：72.1%、73.0%、72.3%，得出抗氧化率的平均值為72.5%。

2.4 每克沙苑子樣品中抗氧化成分相當(dāng)于維生素C的含量

根據(jù)2.3最佳提取條件得到的平均抗氧化率為72.5%，由維生素C溶液與DPPH溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)，計(jì)算出單位質(zhì)量沙苑子樣品中抗氧化成分相當(dāng)于維生素C的含量為46.2 mg。

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)的方法，考察提取溶劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等因素對(duì)沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)提取效果的影響。選用維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，對(duì)沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件：料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取溶劑45%乙醇、提取時(shí)間30 min。