李磊，董亞輝，楊探，李秋芳，聶永梅，李光，于風(fēng)旭

心肌成纖維細(xì)胞約占非心肌細(xì)胞90%以上，在維持心臟結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。有研究表明，心肌微血管密度下降可能導(dǎo)致心肌纖維化加重[1]。此外，當(dāng)某些刺激因素比如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）等刺激心肌成纖維細(xì)胞后，心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞，后者可大量合成Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）等細(xì)胞外基質(zhì)[2]。大量膠原致過(guò)度沉積及異常分布將導(dǎo)致心臟間質(zhì)重構(gòu)，進(jìn)而引起心肌纖維化。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（big conductance Ca2+-activated K+channel,BKCa）是鉀通道中重要成員之一，不僅對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度具有敏感性，對(duì)電壓也具有敏感特性[3]。大量研究表明，BKCa 的開(kāi)放、關(guān)閉以及突變與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[4-5]。Ha 等[6]發(fā)現(xiàn)硫化氫（H2S）可下調(diào)人心房成纖維細(xì)胞上BKCa的表達(dá)從而抑制心肌纖維化的進(jìn)展，表明BKCa 可能參與心肌纖維化過(guò)程。

TGF-β1 是目前已知最強(qiáng)的促進(jìn)纖維化的細(xì)胞因子之一[7]。有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1 是心肌纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵因子[8-10]。而TGF-β1 參與心肌細(xì)胞纖維化的機(jī)制是否與BKCa 有關(guān)目前還不得而知。SB431542 被證明具有抑制TGF-β1 介導(dǎo)的纖維化作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)使用SB431542 抑制TGF-β1 信號(hào)通路，探索TGF-β1 在促進(jìn)纖維化過(guò)程中與BKCa 可能的關(guān)系，以為心肌纖維化的預(yù)防和治療提供思路。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生 2～3 d 的乳大鼠，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

主要實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國(guó)），TGF-β1（Bioyknbs 公司，美國(guó)），SB431542（Sigma 公司，美國(guó)），超純RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)公司，中國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋坊公司，日本），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（Qiagen 公司，德國(guó)），BKCa 抗體（Abcam公司，美國(guó)），α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（Abcam 公司，美國(guó)），Collagen Ⅰ抗體（Abcam公司，美國(guó)），Collagen Ⅲ（Abcam 公司，美國(guó)），TGF-β1 受體抗體（Abcam 公司，美國(guó)），蛋白裂解緩沖液（碧云天公司，中國(guó)），DAB 顯色試劑盒（邁新公司，中國(guó)）。

乳大鼠心室成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代：將2～3 d乳大鼠開(kāi)胸取心臟，將心室剪碎、消化后收集細(xì)胞，以差速貼壁法培養(yǎng)成為成纖維細(xì)胞，傳至1 代后制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種到6 孔板，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

qRT-PCR ：根據(jù)實(shí)時(shí)PCR 引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。細(xì)胞總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所提RNA -80℃保存?zhèn)溆谩２捎米贤夥止夤舛扔?jì)檢測(cè)RNA 純度合格后逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），cDNA 置于-80℃冰箱保存。按照qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃，2 min；95℃，15 s；57℃，30 s；循環(huán) 40 次。添加溶解曲線以驗(yàn)證目的基因擴(kuò)增特異性：95℃，15 s；60℃，15 s；95℃，15 s。采用 2-△△CT值的方法分析目的基因的表達(dá)水平。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

單通道及全細(xì)胞膜片鉗記錄 BKCa 電流：?jiǎn)瓮ǖ烙涗洠恒Q制電壓為-80 mV,刺激電壓為-60 mV。每隔1 s 刺激并記錄一次，采樣頻率為10 kH,濾波為2 kH。電極電阻為3～5 mΩ。用Clampfit 軟件分析BKCa 電流幅值、開(kāi)放概率、開(kāi)放時(shí)間及關(guān)閉時(shí)間。全細(xì)胞記錄：鉗制電壓為-80 mV，測(cè)試電壓從-60 mV去極化到+60 mV，脈沖階躍為+10 mV，脈沖時(shí)程為300 ms。采樣頻率為10 kH,濾波為2 kH。電極電阻為2～3 mΩ。用Clampfit 軟件分析BKCa 電流幅值、電壓依賴性、Rmap 電流峰值。

不同TGF-β1 水平對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞 上α-SMA、Collagen Ⅰ、Collag Ⅲ和BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平影響的檢測(cè)：將乳大鼠心室纖維細(xì)胞分為3 組：對(duì)照組、TGF-β1 5 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml 組。對(duì)照組不做處理，TGF-β1組分別給予5 ng/ml,10 ng/ml TGF-β1 處理細(xì)胞 24 h后收集細(xì)胞。qRT-PCR、蛋白免疫印跡（Western blot）分別檢測(cè)TGF-β1 處理組和對(duì)照組細(xì)胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的mRNA 和 蛋白表達(dá)水平，僅檢測(cè)TGF-β1 10 ng/ml 組BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平（經(jīng)實(shí)驗(yàn)組前期進(jìn)行的藥物濃度和時(shí)間的篩選確定）。采用目的mRNA 和β-actin 2-△△CT做比值的方法來(lái)統(tǒng)計(jì)目的mRNA 的表達(dá)差異，采用目的蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）灰度值做比值的方法來(lái)統(tǒng)計(jì)目的蛋白的表達(dá)差異。

TGF-β1 及SB431542 對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì) 胞TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平影響的檢測(cè)：將乳大鼠心室成纖維細(xì)胞分為三組：對(duì)照組、TGF-β1 組 和TGF-β1+SB431542 組（TGFβ1+SB 組）。對(duì)照組不做任何處理，TGF-β1 組加入 10 ng/ml TGF-β1。TGF-β1+SB 組又設(shè)置三個(gè)濃度梯度：在加入10 ng/ml TGF-β1 基礎(chǔ)上又分別加入SB431542 0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。處理 24 h 后將以上組別細(xì)胞收集，檢測(cè)TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、BKCa mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。

TGF-β1 對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞上BKCa 電流影響的檢測(cè)：將乳大鼠心室成纖維細(xì)胞分為對(duì)照組和TGF-β1 組，對(duì)照組不做任何處理，TGF-β1組經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)篩查確定加入10 ng/ml TGF-β1 處理24 h，利用單通道膜片鉗技術(shù)記錄 BKCa 電流幅值、開(kāi)放概率、開(kāi)放時(shí)間及關(guān)閉時(shí)間。此外，還利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄BKCa 的全細(xì)胞電流幅值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組及以上采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳大鼠心室成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

傳代后的乳大鼠心室成纖維細(xì)胞排列逐漸緊密，相互融合（圖1），運(yùn)用免疫熒光對(duì)第一代成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組均加入DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。實(shí)驗(yàn)組加入波形蛋白抗體，對(duì)照組未加入波形蛋白抗體。結(jié)果顯示，對(duì)照組僅能見(jiàn)到藍(lán)色細(xì)胞核（圖1A），實(shí)驗(yàn)組不僅能看見(jiàn)藍(lán)色細(xì)胞核，還能看見(jiàn)綠色呈絲狀改變的胞漿，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性（圖1B），證明所培養(yǎng)細(xì)胞為乳大鼠心室成纖維細(xì)胞。

圖1 乳大鼠心室第一代心室成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定圖

2.2 不同TGF-β1 水平對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞上α-SMA、Collagen Ⅰ、Collag Ⅲ和BKCa 的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

TGF-β1 5 ng/ml 組 和10 ng/ml 組α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（圖2 A～F）。TGF-β1 10 ng/ml 組BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（P均＜0.05，圖2 G～H）。

圖2 TGF-β1 對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞上α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ和BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響（n＞3）

2.3 TGF-β1 及SB431542 對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞上 TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響

TGF-β1 10 ng/ml 組 的TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 的mRNA 和蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯上調(diào)，與TGF-β1 10 ng/ml+SB431542 0.1 μmol/L 組相比無(wú)明顯差異，與TGF-β1 10 ng/ml+SB431542 1 μmol/L 組，與TGF-β1 10 ng/ml+SB431542 10 μmol/L 組相比均明顯上調(diào)（P均＜0.05，圖3 A～G）。

圖3 TGF-β1 及TGF-β1 受體阻斷劑 SB431542 對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞上TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響(n＞3)

TGF-β1 10 ng/ml組 BKCa 的mRNA和蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯下調(diào)，與10 ng/ml TGF-β1+10 μmol/L SB431542 組相比明顯下調(diào)（P＜0.05，圖3 H～I(xiàn)）。

2.4 TGF-β1 對(duì)乳大鼠心室成纖維細(xì)胞上BKCa 電流的影響（圖4）

圖4 單通道膜片鉗記錄TGF-β1 對(duì)BKCa 電流的影響（n＞3）

在+60 mV 鉗制電壓下，與對(duì)照組相比，加入TGF-β1 后，BKCa 電流幅值被抑制，開(kāi)放概率被抑制，開(kāi)放時(shí)間顯著減少，而關(guān)閉時(shí)間顯著延長(zhǎng)。全細(xì)胞膜片鉗記錄 TGF-β1 對(duì)BKCa 電流的影響結(jié)果顯示：在-60 mV 至+60 mV 鉗制電壓下，隨著刺激電壓的升高，通道電流幅值明顯升高，并且TGF-β1 組的電流幅值均低于對(duì)照組，表明BKCa具有明顯的電壓依賴性，并且在TGF-β1 處理后，BKCa 全細(xì)胞電流幅值被顯著抑制。進(jìn)一步采用Ramp 電壓鉗模式記錄全細(xì)胞電流仍然表明，在TGF-β1 處理后，BKCa 全細(xì)胞電流幅值被顯著抑制。

3 討論

心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞是心肌纖維化的關(guān)鍵步驟，抑制這一過(guò)程是治療心肌纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究以乳大鼠心室成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，成功構(gòu)建纖維化模型，以TGF-β1 和SB431542 為因變量，檢測(cè)細(xì)胞中TGF-β1 受體的蛋白，α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1 可明顯上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1 受體和纖維化指標(biāo)的表達(dá)，同時(shí)可抑制 BKCa 的表達(dá)，TGF-β1 受體阻斷劑 SB431542 可明顯下調(diào)心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1受體和纖維化指標(biāo)的表達(dá)，同時(shí)可促進(jìn)BKCa 的表達(dá)，此外我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)心房成纖維細(xì)胞的BKCa 可以明顯抑制成纖維細(xì)胞α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)[13]，且 Ang Ⅱ通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞上BKCa 的電流從而促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)程。因此推測(cè)TGF-β1 可能是通過(guò)抑制BKCa 電流來(lái)參與心肌細(xì)胞纖維化的，該過(guò)程可能是由TGF-β1 受體介導(dǎo)的，BKCa 可能是Ang Ⅱ與TGF-β1 促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化的共同作用靶點(diǎn)。

在乳腺癌細(xì)胞上BKCa 的作用與本研究結(jié)果一致[14]。然而，Sheng 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，H2S 可抑制成纖維細(xì)胞的增殖，可能是通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞上BKCa 的表達(dá)進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的增殖。同時(shí)，在子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞[16]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[17]上與本研究結(jié)果不一致。目前有關(guān)BKCa 的激活、失活，對(duì)細(xì)胞增殖起到增強(qiáng)或抑制作用，尚不完全清楚，這也為未來(lái)的研究提供了新的方向。但就目前本研究結(jié)果分析，BKCa 參與心肌纖維化的過(guò)程，BKCa 和TGF-β1 受體可能成為心肌纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突