劉雨婷，張祥，李平平，謝志和，鄧明華,2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650201；2.云南省通海縣經(jīng)濟作物工作站,玉溪市鄧明華專家基層科研工作站,云南 玉溪 652700）

花青素作為植物自身兩大次生代謝產(chǎn)物，在植物生理功能和觀賞價值上具有重要作用?；ㄇ嗨貫橹匾乃苄灾参锷?，屬于酚類化合物中的類黃酮，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中［1］，其生物合成途徑已被闡明［2］?；ㄇ嗨貙儆诙喾拥囊粋€大的亞組，被稱為類黃酮。在化學(xué)上，花青素是糖苷，其苷元是2-苯基苯并吡喃鹽的多羥基或聚甲氧基衍生物。在過去的幾年中，這些天然化合物由于其潛在的健康益處而引起了越來越多的關(guān)注。有人提出，食用富含花青素的蔬菜或水果，可對人或動物的大腦、肝臟和腎臟產(chǎn)生有效的保護作用，而且，對預(yù)防心血管疾病、控制肥胖或癌癥治療也有價值。除此之外，花青素對植物的色素沉著、抗氧化氧化以及防止紫外線和病原的損害也具有生理調(diào)節(jié)功能［3-4］。目前，自然界中已分離和鑒定的花青素多達600種,而它們主要從6 種花青素衍生而來，即天竺葵色素、矢車菊素、芍藥色素、飛燕草色素、矮牽牛色素和錦葵色素［5］。

花青素的生物合成主要進行場所是植物的液泡，同時花青素也是植物能夠顯現(xiàn)出不同顏色的主要因素?；ㄇ嗨卦谥参锛毎幸员奖彼釣榈孜?，逐步經(jīng)過?；?、甲基化、羧基化、糖基化修飾后，在被轉(zhuǎn)運、富集至液泡中［6］?；ㄉc花瓣中的色素組成、液泡內(nèi)pH 值、金屬離子以及生長環(huán)境等多種因素有關(guān),但其中最重要的影響因素是色素組成［7］。主要的花青素含量及組成不同導(dǎo)致花色的差異，在已查閱的文獻中，飛燕草色素主要在藍色系植物中含量較多，而在自然界中除藍色系以外的植物及花卉并不含此類色素。矢車菊色素在藍色、紫色、紅色、白色植物中存在，在6 種常見的花色素中，其抗氧化作用最強。矮牽牛色素在酸性條件中呈紅色和藍紫色，在堿性環(huán)境中呈黃綠色。錦葵色素在紫色系植物中存在較多，而天竺葵色素和芍藥色素在自然界中主要存在于紅色系的植物中。

在不同觀賞花卉中，對花色素的研究各不相同。酢漿草又名酸漿草、酸味草、斑鳩草、三葉草，為酢漿草科植物，酢漿草Oxalis-corniculate的全草［8］，其在色素提取和測定的相關(guān)報道較少。瓜葉菊Senecio cruentus DC屬于菊科千里光屬，原產(chǎn)西班牙，性喜冷涼，不耐高溫和霜凍，由于品種繁多，花色豐富常用于環(huán)境美化。紫薇Lagerstroemia indica，為千屈菜科，紫薇屬，觀賞價值很高，Egolf等人［9］的研究中發(fā)現(xiàn)在紫薇的花瓣中只含有飛燕草素、矮牽牛素和錦葵素，而李文芳等人［10］研究表明紫薇花色素屬于花色苷類化合物，且存在6 種花色苷成分。目前對觀賞花卉色素研究方面已有相關(guān)研究，但總體來看，這方面的研究主要以單種觀賞花卉作為對象，整體研究較為分散，有些花卉在此方面的研究幾乎為空白，如紫嬌花等。另外局限于技術(shù)等原因，在同種花卉色素的研究上存在差異。

在植物花色素的檢測方面，常用的有高效液相色譜法、分光光度法（包括pH 示差分光光度計法）等，由于高效液相色譜法成本較高，許多研究常用分光光度計法來測定植物花青素［11］。分光光度計法雖然具有方便、成本低的優(yōu)點，但其在檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性上比高效液相色譜法差。同時由于花青素性質(zhì)不穩(wěn)定的原因，利用不同的方法測定的結(jié)果也不盡相同，所以完善的測定方法可在一定程度上提高花青素測定的準(zhǔn)確性。

校園觀賞花卉在綠化、美化等日趨發(fā)揮著重要作用，通常用于裝飾花叢、花壇、花臺等。在自然界中，藍色系是較少的花卉色系，對于藍色系花卉品種的培育是世界上許多園藝育種專家的研究重點，此次利用校園中藍色系的觀賞花卉進行了分析及研究。但在經(jīng)筆者查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)對校園觀賞植物花青素相關(guān)研究較少，且花青素液相測定條件較為嚴(yán)苛。因而，從此角度出發(fā)，本研究隨機選擇云南農(nóng)業(yè)大學(xué)整個校園中觀賞花卉：采集酢漿草、紫嬌花、瓜葉菊、紫薇、沿階草和長春花測定了其花青素含量及組分。研究花青素含量及組分對觀賞花卉花色的影響。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

于2020年7月至8月，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中隨機采集觀賞花卉：酢漿草（Oxalis corniculata）、紫嬌花（Tulbaghia violacea）、瓜葉菊（Pericallis hybrida）、紫薇（Lagerstroemia indica）、沿階草（Ophiopogon bodinieri）和長春花（Catharanthus roseus）用于測定花青素含量及組分。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器

UV-1601 型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)；1260 高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配有自動進樣器、UVW 檢測器和Chemstation工作站)；Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國Agilent 公司）；HC-3018 型離心機(安徽中科中佳儀器有限公司)；FA224 型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SB-5200 DTDN型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；純水機（ELGA，英國）。

1.2.2 試劑

矢車菊素(Cyanidin , ≥98%) 、飛燕草素( Delphinidin,≥97%)、錦葵色素(Malvidin,≥97%)、芍藥色素(Peonidin,≥97%)、天竺葵色素(Pelargonidin,≥97%)、矮牽牛色素(Petunidin , ≥95%)均購于EXTRASYNTHESE(法國，熱奈)；濃鹽酸(優(yōu)級純)、甲醇(色譜純，天津市進豐化工有限公司)；甲酸(色譜純，山東西亞化學(xué)股份有限公司)。實驗用水為超純水。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 花青素的檢測

1.3.1 樣品制備和提取

花青素提取和檢測參考Gordon J等人［8］的方法，具體方法如下：取0.5 g 樣品用液氮預(yù)冷后，放入研缽中加液氮后研磨，研磨成粉后按料液比1∶30(g/mL)加15 ml 的95%乙醇∶1.5 mol/L 鹽酸(85∶15，V/V)提取液，倒入50 ml離心管中，用提取液洗研缽，超聲處理30 min，在5 000 r/min離心5 min，吸取上清液；利用濾渣重復(fù)提取1 次，將2 次的提取液合并，定容至45 ml。

將上述提取液與濃鹽酸(3∶1，V/V)混合，在90 ℃水浴40 min 后，放置于冰盒冷卻，使花色苷在強酸環(huán)境中充分水解成花青素。水解后的溶液用提取液定容到4 ml，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后用于HPLC 分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別精確稱取花青素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶解于10 ml 溶劑（提取液：濃鹽酸，3∶1，V/V）中，配制成100μg/mL的儲備液，再分別稀釋成1、5、10、15、20、25 μg/mL的工作液。

1.3.3 總花青素測定

總花青素測定［12］具體實驗過程如下：

（1）打開分光光度計。在測量前，允許儀器預(yù)熱至少30 min。

（2）通過用氯化鉀緩沖液稀釋來確定樣品的適當(dāng)稀釋系數(shù)，pH 1.0，直到樣品在NVIS-max 時的吸光度在分光光度計的線性范圍內(nèi)（對于大多數(shù)分光光度計，吸光度應(yīng)小于1.2）。將樣品的最終體積除以初始體積以獲得稀釋因子（DF：參見步驟7）。

（3）用蒸餾水調(diào)零分光光度計的所用波長（510、520 、530 和700 nm）。

（4）制備樣品的兩種稀釋液，一種用pH 1.0 的氯化鉀緩沖液稀釋，另一種用pH 4.5 的乙酸鈉緩沖液稀釋，分別用先前的稀釋度稀釋。確定稀釋因子（步驟2）。讓這些稀釋液平衡15 min。

（5）在充滿蒸餾水的空白對照玻璃比色皿中測量每種稀釋液在Amax和700 nm 處的吸光度（以校正霧度）

（6）計算稀釋樣品（A）的吸光度，如下所示：

A=（Amax-A700）pH1.0- （Amax-A700）pH4.5

（7）使用以下公式計算原始樣品總花青素含量中：

其中MW 是分子量，DF 是稀釋倍數(shù)，ε為摩爾吸光系數(shù)（MW = 449.2 ，ε= 26 900）。

1.4 HPLC分析

花青素HPLC分析條件：色譜柱：Zorbax SB-C18 4.6 mm×250 mm 5μm；流動相：A：10%甲酸水溶液，B：10%甲酸甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～5 min 90%A；15 min從90%A 到70%A；20 min 從70%A 到40%A；10 min 從40%A 到90%A；流速為：0.8 ml/min；檢測波長：520 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μl。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2007 和SPSS 23 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，多重比較采用LSD 法。每個指標(biāo)3 個重復(fù)，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC花青素混標(biāo)

以矢車菊色素(Cyanidin ,≥98%) 、飛燕草色素(Delphinidin,≥97%)、 錦葵色素(Malvidin,≥97%)、芍藥色素(Peonidin, ≥97%)、天竺葵色素(Pelargonidin,≥97%)、矮牽牛色素(Petunidin ,≥95%)為標(biāo)準(zhǔn)品，建立花青素混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1)，其中，最先在20.912 0 min 出峰的色素為飛燕草色素，隨后在25.296 0 min、 26.991 0 min、 29.127 0 min、30.523 0 min、31.263 0 min 處出峰的分別為矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素。以各梯度質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到單體化合物的回歸方程如下：飛燕草色素，峰面積=40.19*C-24.09，相關(guān)系數(shù)：0.996 1；錦葵色素，峰面積=39.35*C-25.03，相關(guān)系數(shù)：0.995 9；矮牽牛色素，峰面積=37.02*C-23.47，相關(guān)系數(shù)：0.995 7；芍藥色素，峰面積=44.32*C-24.46，相關(guān)系數(shù)：0.997 7；矢車菊色素，峰面積=38.17*C -23.98，相關(guān)系數(shù)：0.996 9；天竺葵色素，峰面積=38.57*C-19.38，相關(guān)系數(shù)：0.995 9，線性范圍為1.00～25.00 μg/mL。

圖1 花青素混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of anthocyanin mixed standard

2.2 HPLC所測花卉中花青素單體

以圖1中的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖為參照，在所測六種觀賞花卉中（圖2），酢漿草在31.287 0 min 出峰，其所含花青素單體主要為錦葵色素，峰面積為17.142 8 mAU*s；紫嬌花在25.254 0 min 出峰，所含花青素單體主要為矢車菊色素，峰面積為6.320 4 mAU*s；瓜葉菊在21.048 0 min 和25.368 0 min 都有出峰，分別為飛燕草色素和矢車菊色素，峰面積分別為57.694 8 mAU*s和9.512 4 mAU*s；紫薇花在21.046 0 min，27.050 0 min和31.303 0 min 出峰，所測出物質(zhì)分別為飛燕草色素、矮牽牛色素和錦葵色素，其峰面積分別為24.368 9 mAU*s、10.665 1 mAU*s和14.032 2 mAU*s；沿階草只在31.300 0 min 處出峰，為錦葵色素，峰面積為19.278 8 mAU*s，而長春花在34.344 0 min 處檢測出未知組分。

圖2 HPLC 所檢測不同種類校園常見花卉花青素單體色譜圖Fig.2 Chromatograms of anthocyanin monomers of different kinds of campus flowers detected by HPLC

2.3 幾種校園常見觀賞花卉花青素含量分析

由表1可知，除紫嬌花未檢測出總花青素外，其余五種都檢測出總花青素；瓜葉菊、紫薇和沿階草總花青素含量顯著（P＜0.05）高于酢漿草和長春花，長春花和酢漿草中總花青素含量之間沒有顯著性差異（P＞0.05），瓜葉菊、紫薇和沿階草中總花青素含量之間也有顯著性差異（P＜0.05），其中含量最高為瓜葉菊，為0.287 70±0.028 820 mg/g。利用HPLC 測定花青素單體（圖3），基于回歸方程計算可知，在所測定的六種校園觀賞花卉中，瓜葉菊中含有飛燕草色素和矢車菊色素且其含量均為所測六種花中最高，分別為732.599 9 μg/g 和310.306 7 μg/g；紫薇花檢測出飛燕草色素、矮牽牛色素和錦葵色素，含量分別為434.097 3 μg/g、331.930 9 μg/g、338.283 6 μg/g；沿階草檢測出錦葵色素為六種花中含量最高的，含量為399.483 3 μg/g；酢漿草檢測出錦葵色素，為394.339 5 μg/g；紫嬌花中為矢車菊色素，含量為297.323 2 μg/g；在長春花中未檢測出六種常見的花青素。在所測的六種花中均未檢測出天竺葵色素，芍藥色素。

表1 不同種類校園常見花卉總花青素顏色與濃度Table 1 The color and concentration of total anthocyanins of different types of common campus flowers

圖3 HPLC 測得不同種類觀賞花卉的花青素組分及含量Fig.3 The anthocyanin components and contents of different kinds of ornamental flowers measured by HPLC

3 討論與結(jié)論

花色是被子植物花器官非常重要的表型性狀，是觀賞花卉植物極其重要的觀賞性狀之一，在新品種選育、鑒定和保護過程中具有重要意義，而花青素、類胡蘿卜素等色素及其他相關(guān)物理化學(xué)因素決定花色的形成［13-14］?；ㄇ嗨氐姆诸愔饕鶕?jù)羥基和甲氧基取代基的數(shù)目和位置，目前被報道的天然花青素已經(jīng)有20 多種，其中最常見的有6 種：飛燕草色素(delphinidin)顯藍紫色、矢車菊色素(cyanidin)顯艷紅色、天竺葵色素(pelargonidin)顯深紅色、矮牽牛素(petunidin)顯紫色、芍藥色素(peonidin）顯橘紅色和錦葵素(malvidin)顯淡紫色［15-18］。結(jié)合本研究選取材料來看所檢測出單體物質(zhì)與報道的花青素單體常見顏色來看，基本符合實際花色，即都為紫色花；而對于只檢測出矢車菊素的紫嬌花來說，本應(yīng)表現(xiàn)為鮮艷紅色，但可能由于其內(nèi)含有輔助色素，如：黃酮、糖、有機酸等一系列次生代謝物導(dǎo)致花色苷吸收波長較長進而導(dǎo)致其顏色呈現(xiàn)出淡紫色［19］。

紫葉酢漿草色素屬花青素類色素，pH 值對色素影響明顯，在酸性條件下色澤穩(wěn)定且具有熱穩(wěn)定性；光照能加快色素降解；金屬離子Na+、Ca2+、A13+、Cu2+、Zn2+對色素色澤無影響，而Fe3+、Pb2+有不良影響［20］。pH 對紅花酢漿草色素的穩(wěn)定性影響較大，在pH2～3 時呈穩(wěn)定的紅色，pH 增大時顏色變紫變黑。紅花酢漿草色素在暗處穩(wěn)定性最高,自然光下次之,日光燈下低。紅花酢漿草色素在50 ℃以下熱穩(wěn)定性較好，50 ℃以上熱穩(wěn)定性降低［21］。蔗糖、氯化鈉、蘋果酸、檸檬酸和乳酸對紅花酢漿草色素均有明顯的增色、護色作用,可明顯改善或提高其穩(wěn)定性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在花青素測定分析過程中，總花青素含量除紫嬌花以外其余都檢測到，但利用HPLC檢測時，發(fā)現(xiàn)紫嬌花卻出現(xiàn)矢車菊素吸收峰，表明紫嬌花含有該物質(zhì)，該特殊現(xiàn)象的出現(xiàn)，推測可能由于測定總花青素采用pH 示差法，即利用1.3.2 描述方法計算出花青素總量，由于花青素的結(jié)構(gòu)存在不完全轉(zhuǎn)化造成實際測得的濃度要低于花青素的理論濃度，且不能測定單體造成的［22］。而對于總花青素含量最低的長春花來說，HPLC 并未檢測出六種常見花青素單體，但檢測出一個未知組分對于此結(jié)果，可能存在兩種原因。第一，本次測定的六種單體的含量在長春花中未到達高效液相色譜的檢出限，即可能由于濃度太低未檢出。另外可能是因為其含有除測定六種以外花青素單體，具體原因有待后續(xù)研究。

對于分光光度計法測定總花青素的含量與HPLC測定單體含量在數(shù)據(jù)上存在沖突的問題而言，在使用分光光度和高相液相色譜法測定花青素的相關(guān)研究中也存在同樣的問題。紀(jì)鵬飛等人［11］利用分光光度計法測定葡萄酒中花青素，盡管其在分光光度計法上做了相關(guān)優(yōu)化，但總體來看分光光度計所測得的花青素含量要低于高效液相色譜法。所以本研究認(rèn)為，由于分光光度計法的局限性，其在一定程度上測定的總花青素含量僅僅只能作為所測植株是否具有該類物質(zhì)的一個粗略判斷依據(jù)，其測定的值并不能真實反應(yīng)該類物質(zhì)的真實含量。本文采集了云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中酢漿草、紫嬌花、瓜葉菊、紫薇、沿階草和長春花，測定并分析了相應(yīng)花青素含量及組分。由于分光光度計法在測定花青素組份及含量上的局限性，研究在分光光度計法的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法與其相互印證，提高了花青素檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在對不同觀賞花卉花青素組分及含量進行測定分析后發(fā)現(xiàn)，不同觀賞花卉的花青素種類與該物種觀賞花卉的花色相符，表明在觀賞花卉中其花青素的種類與含量對該種植物的花色具有重要影響。旨在為以后校園觀賞植物花色研究，及相關(guān)色素的研究提供相應(yīng)參考。