孫 玲， 王 月， 陳 閩， 孫小芹， 杭悅宇， 張艷梅

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

薯蕷屬(DioscoreaLinn.)為單子葉攀緣植物，其葉腋處常形成一種特殊的側(cè)枝變態(tài)器官——莖生珠芽，也稱為零余子，是薯蕷屬植物重要的無性繁殖器官。薯蕷(D.polystachyaTurcz.)又稱山藥，是傳統(tǒng)的中藥和補(bǔ)益食品[1-2]，目前主要采用塊莖繁殖。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于薯蕷塊莖繁殖過程中往往存在嚴(yán)重的病蟲害感染，會導(dǎo)致品種退化，因而，其莖生珠芽常被用于薯蕷品種的復(fù)壯[3-6]。莖生珠芽與卷須、枝刺等其他側(cè)枝變態(tài)類似，均由側(cè)生分生組織發(fā)育而來，因此，探討薯蕷莖生珠芽發(fā)生的遺傳機(jī)制，對薯蕷品種繁育及植物側(cè)枝發(fā)育機(jī)制探討均具有重要意義。

在自然界中，除薯蕷外，具珠芽的植物還有龍舌蘭(AgaveamericanaLinn.)[7]、臺閩苣苔〔Titanotrichumoldhamii(Hemsl.) Soler.〕[8]、半夏〔Pinelliaternata(Thunb.) Breit.〕[9]、淡黃花百合(LiliumsulphureumBaker apud Hook. f.)[10]和白花虎眼萬年青(OrnithogalumarabicumLinn.)[11]等。目前關(guān)于植物珠芽發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在3個(gè)方面：一是光照和溫度等環(huán)境因子的影響效應(yīng)[12-13]；二是生長素和細(xì)胞分裂素等激素的影響效應(yīng)[14-15]；三是遺傳基因的調(diào)控機(jī)制[7-8，11]。例如：在龍舌蘭花序珠芽的不同發(fā)育期，KNOXⅠ基因在花序珠芽起始處，特別是在分生組織發(fā)育的特定部位中有表達(dá)[7]；臺閩苣苔的GFLO基因在其花序和花序珠芽原基中均有特異性表達(dá)，且表達(dá)量在花序珠芽發(fā)生過程中明顯下降[8]；姜福星等[11]篩選出白花虎眼萬年青葉面珠芽形成過程中差異表達(dá)的關(guān)鍵基因EMB和FKBP等。上述這些種類的花序珠芽或葉面珠芽的發(fā)生機(jī)制與莖生珠芽存在一定的差異。

He等[16]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在卷丹(LiliumtigrinumKer Gawler)莖生珠芽的發(fā)育過程中，細(xì)胞分裂素合成基因IPT1/5和細(xì)胞分裂素激活基因LOG1/3/5/7的表達(dá)量增加，而細(xì)胞分裂素降解基因CKX4的表達(dá)量減少，導(dǎo)致其內(nèi)源性iPA型細(xì)胞分裂素的含量增加，并促進(jìn)了細(xì)胞分裂素信號通路基因(AHK2/3/4、AHP1和ARR1/2/12)的表達(dá)。Wu等[17]通過轉(zhuǎn)錄組測序，對參薯(DioscoreaalataLinn.)不同發(fā)育階段的莖生珠芽進(jìn)行了研究，認(rèn)為生長素、細(xì)胞分裂素和脫落酸合成相關(guān)基因(WRKY、bHLH和MYB等)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等均可能參與了參薯莖生珠芽的發(fā)育調(diào)控。但表達(dá)量發(fā)生變化，只能說明上述基因或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可能參與了珠芽發(fā)育過程的調(diào)控，并不能直接佐證他們與珠芽的發(fā)生有關(guān)，因而，目前關(guān)于珠芽發(fā)生的分子機(jī)制仍不明確。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族的TFL1-like基因，主要表達(dá)于次級分生組織，包括腋生分生組織、維管形成層和中間分生組織，可抑制莖頂端分生組織形成花原基，目前已知其具有延遲開花、維持莖尖分生組織營養(yǎng)生長、促進(jìn)側(cè)枝產(chǎn)生等功能[18]。例如：過表達(dá)RCN基因能導(dǎo)致水稻(OryzasativaLinn.)開花延遲，并產(chǎn)生更多分蘗和多穗的圓錐花序[19]；過表達(dá)CmTFL1c基因能導(dǎo)致杭白菊(Chrysanthemum×morifoliumRamat．)的側(cè)枝明顯增多、開花延遲，且花形態(tài)發(fā)生異常[20]。qRT-PCR研究結(jié)果[21]表明：在半夏的莖生珠芽不同發(fā)育期，PteTFL1基因的表達(dá)量存在顯著性差異，且隨其莖生珠芽的發(fā)育，PteTFL1基因表達(dá)水平先升高后降低，在莖生珠芽剛發(fā)生時(shí)的表達(dá)量最大，暗示PteTFL1基因在半夏莖生珠芽的生長發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用。據(jù)此，在薯蕷莖生珠芽的發(fā)生過程中TFL1-like基因是否也具有同樣的作用？有待深入探討。

薯蕷品種‘鐵棍山藥’(Dioscoreapolystachya‘Tiegun’)和‘花籽山藥’(D.polystachya‘Huazi’)的遺傳背景極為一致，但前者莖中上部葉腋通常具莖生珠芽，基部葉腋則不具莖生珠芽，屬于具莖生珠芽品種；后者莖上不具有珠芽，屬于無莖生珠芽品種。作者以上述2個(gè)薯蕷品種為實(shí)驗(yàn)材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘可能參與調(diào)控薯蕷莖生珠芽發(fā)生的相關(guān)基因，并探究與側(cè)枝發(fā)生密切相關(guān)的TFL1-like基因及其在薯蕷莖生珠芽發(fā)生過程中的作用，以期為薯蕷品種繁育及植物側(cè)枝發(fā)育機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2015年6月在徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)苗圃選取長勢良好的‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’植株，在‘鐵棍山藥’的莖上采集具莖生珠芽的葉腋部位(S1)、莖基部無莖生珠芽的葉腋部位(S2)和莖上部無莖生珠芽的葉腋部位(S3)3組樣品，在‘花籽山藥’的莖上采集葉腋部位(S4)1組樣品，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

在‘鐵棍山藥’莖上采集不同發(fā)育期莖生珠芽的葉腋部位，包括莖生珠芽的未發(fā)育期(葉腋部位未見珠芽，T0期)、發(fā)育初期(葉腋部位冒出白色小珠芽，T1期)、發(fā)育中期(葉腋部位珠芽由白色剛變?yōu)樽厣?，T2期)和發(fā)育成熟期(葉腋部位珠芽全變?yōu)樽厣琓3期)的4組樣品，用于DpTFL1基因表達(dá)量分析。

取樣時(shí)，使用刀片在葉腋部位割取面積約4 mm2的表皮，包含珠芽但不包含維管組織。樣品經(jīng)液氮速凍后于-70 ℃保存、備用。每個(gè)部位或每個(gè)時(shí)期各采集約10株樣株，混合后作為1份樣品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及純化 將300 mg樣品置于液氮中研磨成粉末，用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)提取總RNA；獲得的RNA用不含RNase的DNase Ⅰ(美國Invitrogen公司)于37 ℃下消化處理30 min，去除DNA污染，然后用Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司)檢測RNA樣品的完整性和純度；最后使用Dynabeads mRNA Purification Kit試劑盒(美國Invitrogen公司)對mRNA進(jìn)行分離純化。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建 用Fragmentation Buffer試劑(美國Invitrogen公司)將mRNA隨機(jī)切割成150～200 nt的片段；以片段化的mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA的第1鏈，并在RNase H和DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成雙鏈cDNA；對雙鏈cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)及3′末端加‘A’堿基，并在片段兩端連接上特定的測序接頭；經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)后回收長度約200 bp的cDNA片段，通過PCR擴(kuò)增富集測序樣本。擴(kuò)增體系總體積25.0 μL，包括20.0 μL金牌Mix (green)(北京擎科新業(yè)生物科技有限公司)、10 μmol·L-1正向和反向檢測引物各2.0 μL以及0.05 ng·μL-1cDNA 1.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s、58 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。并用QIAquick Gel Purification Kit試劑盒(德國Qiagen公司)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.3 Illumina測序和RNA-seq分析 構(gòu)建完成的cDNA文庫用Agilent 2100生物分析儀和StepOnePlus Real-Time PCR System(美國ABI公司)質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM2000測序平臺(美國Illumina公司)進(jìn)行測序，并將所得的圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核苷酸序列數(shù)據(jù)，獲得原始測序數(shù)據(jù)。

在原始測序數(shù)據(jù)中去除接頭序列和低質(zhì)量reads(Q<20)，獲得clean reads；使用Trinity分析軟件(https：∥trinityrnaseq.sourceforge.net/)對獲得的高質(zhì)量序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組denovo拼接；使用TGICL軟件對拼接的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聚類去冗余得到unigenes序列，并對各樣品的unigenes再次進(jìn)行聚類去冗余得到最終的unigenes，命名為“All-unigenes”，用于后續(xù)分析；對組裝的contigs和unigenes進(jìn)行長度分布統(tǒng)計(jì)。使用DESeq2軟件對各樣品進(jìn)行差異表達(dá)水平分析，采用FPKM(每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片)方法[22]進(jìn)行定量分析，其中差異unigenes的篩選使用表達(dá)差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)的方法，判斷條件為︱log2FC︱≥1(P≤0.05)[23]。

使用Blast2GO軟件(https：∥www.blast2go.com)將所得的unigenes序列與NR數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)進(jìn)行BLASTx批量比對(E≤10-5)，獲取最佳功能注釋；根據(jù)NR注釋信息進(jìn)行GO功能注釋，在獲得每個(gè)unigene的GO注釋后，使用WEGO軟件(http：∥wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)對所有unigenes進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)；將BLASTx所得unigenes與COG數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)進(jìn)行比對分析(E<10-5)，獲得基因的COG功能注釋和COG功能分類；通過KEGG數(shù)據(jù)庫(https：∥www.genome.jp/kegg)的注釋信息得到unigenes的Pathway注釋；按NR、NT、GO、COG、KEGG、SwissProt和InterPro的順序?qū)nigenes序列與以上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTx比對，翻譯后得到該unigene編碼區(qū)的核酸序列(序列方向?yàn)?′→3′)和氨基酸序列并預(yù)測編碼蛋白框(CDS)，沒有得到比對結(jié)果的unigenes則使用ESTScan軟件預(yù)測其編碼區(qū)。

1.2.4 PEBP家族基因的鑒定和表達(dá)量分析 從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https：∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕和水稻基因組序列和注釋信息，從Ensemble 數(shù)據(jù)庫(ftp：∥ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-49/fasta/dioscorea_rotundata/dna/)下載幾內(nèi)亞薯蕷(DioscorearotundataPoir.)基因組序列和注釋信息。以PEBP家族基因中保守的乙醇胺結(jié)合域(PF01161)為問詢序列，采用BLAST和HMM(隱馬爾科夫模型)方法，對獲得的‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及擬南芥、水稻和幾內(nèi)亞薯蕷基因組蛋白序列進(jìn)行同源性比對(E值設(shè)為10-4)，使用MEGA 7.0軟件中的ClustalW對同源序列進(jìn)行比對，并使用PhyML軟件對同源序列進(jìn)行系統(tǒng)演化樹構(gòu)建[24-25]。以FPKM值表示轉(zhuǎn)錄本豐度，對具莖生珠芽和無莖生珠芽樣本的轉(zhuǎn)錄組中全部PEBP家族基因的表達(dá)量進(jìn)行分析和比較。

1.2.5 qRT-PCR分析 按前述方法提取‘鐵棍山藥’不同發(fā)育期莖生珠芽葉腋樣品的RNA，并對DpTFL1基因表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析。使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，DpTFL1基因正向引物qDpTFL1-F和反向引物qDpTFL1-R的序列分別為5′-GAGGGAGGTGGTGGAGTATGAA-3′和5′-ATTGAAGAAGACAGCGGCG-3′；參照文獻(xiàn)[17]，根據(jù)薯蕷Actin基因設(shè)計(jì)引物，正向引物DpActin-F和反向引物DpActin-R的序列分別為5′-TGACGAGGATATTCAACCCCT-3′和5′-GATACCCCTCTTGGATTGAGC-3′。

采用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行qRT-PCR分析。擴(kuò)增體系總體積20.0 μL，包括SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)10.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.8 μL以及0.05 ng·μL-1cDNA 2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，分析程序：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法[26]進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0軟件對‘鐵棍山藥’不同發(fā)育期葉腋樣品DpTFL1基因的相對表達(dá)量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(t-檢驗(yàn)，α=0.05)。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序和de novo組裝結(jié)果

‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’不同部位樣品中轉(zhuǎn)錄組unigenes的質(zhì)量指標(biāo)見表1，2個(gè)品種葉腋部位轉(zhuǎn)錄組unigenes的長度分布圖見圖1。

表1 薯蕷品種‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’不同部位樣品中轉(zhuǎn)錄組unigenes的質(zhì)量指標(biāo)

圖1 薯蕷品種‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’葉腋部位轉(zhuǎn)錄組unigenes的長度分布圖

結(jié)果顯示：共獲得77 981個(gè)All-unigenes，長度主要集中于300～3 000 bp，占總量的99.44%。All-unigenes的平均長度為1 050 bp，N50值為1 764 bp，GC含量為42.66%。4組樣品的unigenes總數(shù)、總長度、平均長度、N50值、N90值和GC含量均有不同程度的差異。

2.2 功能注釋分析

2.2.1 功能注釋結(jié)果 將獲得的unigenes序列比對到7大功能數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示：NR數(shù)據(jù)庫注釋了50 030個(gè)unigenes，NT數(shù)據(jù)庫注釋了44 565個(gè)unigenes，GO數(shù)據(jù)庫注釋了5 392個(gè)unigenes，COG數(shù)據(jù)庫注釋了22 961個(gè)unigenes，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋了38 681個(gè)unigenes，SwissProt數(shù)據(jù)庫注釋了35 872個(gè)unigenes，InterPro數(shù)據(jù)庫注釋了38 807個(gè)unigenes。其中，NR數(shù)據(jù)庫提供了比其他數(shù)據(jù)庫更多的unigenes注釋，大約占All-unigenes數(shù)的64.2%。

將‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’不同部位樣品的轉(zhuǎn)錄組unigenes與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果顯示：供試2個(gè)品種的轉(zhuǎn)錄組unigenes與4個(gè)種類具有較高的同源性，其中，與油棕(ElaeisguineensisJacq.)的同源性最高，有17 580個(gè)unigenes相似，占注釋unigenes總數(shù)的35.1%；與海棗(PhoenixdactyliferaLinn.)有12 768個(gè)unigenes相似，占注釋unigenes總數(shù)的25.5%；與小果野蕉(MusaacuminataColla)的1個(gè)亞種Musaacuminatasubsp.malaccensis(Ridl.) N. W. Simmonds有4 658個(gè)unigenes相似，占注釋unigenes總數(shù)的9.3%；與蓮(NelumbonuciferaGaertn.)有1 556個(gè)unigenes相似，占注釋unigenes總數(shù)的3.1%；與其他種類的unigenes相似性較低，占注釋unigenes總數(shù)的26.9%。從種類的屬性看，薯蕷為單子葉植物，與薯蕷轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果同源性較高的前3個(gè)種類也同為單子葉植物。

2.2.2 GO注釋分析 在GO數(shù)據(jù)庫對具莖生珠芽的葉腋樣品(S1)與無莖生珠芽的葉腋樣品(S2、S3和S4)的轉(zhuǎn)錄組unigenes功能進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：分別有6 098、8 840和9 141個(gè)差異unigenes注釋在細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3大類43個(gè)亞類中。

： 樣品S1與樣品S2的差異unigenes富集通路Enrichment pathway of differential unigenes between sample S1 and sample S2； ： 樣品S1與樣品S3的差異unigenes富集通路Enrichment pathway of differential unigenes between sample S2 and sample S3； ： 樣品S1與樣品S4的差異unigenes富集通路Enrichment pathway of differential unigenes between sample S1 and sample S4. S1，S2，S3. 具莖生珠芽的薯蕷品種‘鐵棍山藥’的葉腋樣品Leaf axil samples from Dioscorea polystachya ‘Tiegun’with stem bulbils： S1. 具莖生珠芽的葉腋樣品Leaf axil sample with stem bulbils； S2. 莖基部無莖生珠芽的葉腋樣品Leaf axil sample without stem bulbil on base part of stem； S3. 莖上部無莖生珠芽的葉腋樣品Leaf axil sample without stem bulbil on upper part of stem. S4. 無莖生珠芽的薯蕷品種‘花籽山藥’的葉腋樣品Leaf axil sample from D. polystachya ‘Huazi’ without stem bulbil.

在生物過程的19個(gè)亞類中，3組差異unigenes主要注釋在細(xì)胞過程、代謝過程和單一生物過程3個(gè)亞類中。其中，注釋在細(xì)胞過程的差異unigenes分別有569、844和864個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的9.3%、9.5%和9.5%；注釋在代謝過程的差異unigenes分別有647、926和978個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的10.6%、10.5%和10.7%；注釋在單一生物過程的差異unigenes分別有417、575和619個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的6.8%、6.5%和6.8%。

在細(xì)胞組分的14個(gè)亞類中，3組差異unigenes主要注釋在細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器3個(gè)亞類中。其中，注釋在細(xì)胞的差異unigenes分別有588、838和825個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的9.6%、9.5%和9.0%；注釋在細(xì)胞部分的差異unigenes分別有588、838和825個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的9.6%、9.5%和9.0%；注釋在細(xì)胞器的差異unigenes分別有470、681和653個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的7.7%、7.7%和9.3%。

在分子功能的10個(gè)亞類中，3組差異unigenes主要注釋在2個(gè)亞類中：一是結(jié)合亞類，分別有538、809和786個(gè)差異unigenes，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的8.8%、9.2%和8.6%；二是催化活性亞類，分別有628、849和960個(gè)unigenes，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的10.3%、9.6%和10.5%。

2.2.3 KEGG代謝通路分析 在KEGG數(shù)據(jù)庫中對具莖生珠芽的葉腋樣品與無莖生珠芽的葉腋樣品的轉(zhuǎn)錄組unigenes功能進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示：3組轉(zhuǎn)錄組分別有11 182、13 552和15 918個(gè)差異unigenes注釋在KEGG代謝通路，共5大類18亞類，且主要集中在代謝和遺傳信息處理。

： 樣品S1與樣品S2的差異unigenes富集通路Enrichment pathway of differential unigenes between sample S1 and sample S2； ： 樣品S1與樣品S3的差異unigenes富集通路Enrichment pathway of differential unigenes between sample S2 and sample S3； ： 樣品S1與樣品S4的差異unigenes富集通路Enrichment pathway of differential unigenes between sample S1 and sample S4. S1，S2，S3. 具莖生珠芽的薯蕷品種‘鐵棍山藥’的葉腋樣品Leaf axil samples from Dioscorea polystachya ‘Tiegun’with stem bulbils： S1. 具莖生珠芽的葉腋樣品Leaf axil sample with stem bulbils； S2. 莖基部無莖生珠芽的葉腋樣品Leaf axil sample without stem bulbil on base part of stem； S3. 莖上部無莖生珠芽的葉腋樣品Leaf axil sample without stem bulbil on upper part of stem. S4. 無莖生珠芽的薯蕷品種‘花籽山藥’的葉腋樣品Leaf axil sample from D. polystachya ‘Huazi’ without stem bulbil.

注釋在代謝相關(guān)通路的差異unigenes數(shù)最多，分別有7 100、8 265和9 882個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的63.5%、61.0%和62.1%，涉及碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成等11個(gè)亞類。

注釋在遺傳信息處理相關(guān)通路的差異unigenes分別有1 969、2 925和3 220個(gè)，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的17.6%、21.6%和20.2%，涉及翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)以及折疊、分類和降解4個(gè)亞類。

在環(huán)境信息處理相關(guān)通路中，分別有459、521和612個(gè)差異unigenes注釋在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亞類，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的4.1%、3.8%和3.8%。在細(xì)胞過程相關(guān)通路中，分別有691、829和966個(gè)差異unigenes注釋在運(yùn)輸和分解代謝亞類，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的6.2%、6.1%和6.1%。在生物系統(tǒng)相關(guān)通路中，分別有757、816和951個(gè)差異unigenes注釋在環(huán)境適應(yīng)性亞類，各占對應(yīng)注釋unigenes總數(shù)的6.8%、6.0%和6.0%。

2.3 基因表達(dá)分析

2.3.1 unigenes的表達(dá)量比較 對‘鐵棍山藥’具莖生珠芽的葉腋樣品(S1)與其他3個(gè)無莖生珠芽的葉腋樣品(S2、S3和S4)的轉(zhuǎn)錄組unigenes的表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：與‘花籽山藥’的葉腋樣品相比，表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的unigenes分別有12 258和7 597個(gè)；與莖上部無莖生珠芽的葉腋樣品相比，表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的unigenes分別有10 679和5 610個(gè)；與莖基部無莖生珠芽的葉腋樣品相比，表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的unigenes分別有5 938和7 386個(gè)。其中，前兩組樣品中表達(dá)量上調(diào)的unigenes明顯多于表達(dá)量下調(diào)的unigenes數(shù)量，前者是后者的1.6～1.9倍；而后一組樣品中表達(dá)量上調(diào)的unigenes則少于表達(dá)量下調(diào)的unigenes。

將‘鐵棍山藥’具莖生珠芽的葉腋樣品與其他3組無莖生珠芽的葉腋樣品進(jìn)行總體比較，結(jié)果顯示：表達(dá)量均上調(diào)的unigenes有3 531個(gè)，表達(dá)量均下調(diào)的unigenes有1 084個(gè)。在具莖生珠芽的葉腋樣品中特異性表達(dá)的unigenes有235個(gè)，而在3組無莖生珠芽的葉腋樣品中均特異性表達(dá)的unigene僅1個(gè)。

2.3.2 PEBP家族基因的鑒定和表達(dá)量分析 在薯蕷品種‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’不同部位樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定出11個(gè)PEBP家族成員，將這些PEBP家族成員與擬南芥、水稻和幾內(nèi)亞薯蕷的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對，依次比對出同源基因6、19和11個(gè)。

薯蕷轉(zhuǎn)錄組與擬南芥、水稻和幾內(nèi)亞薯蕷基因組中PEBP家庭成員的系統(tǒng)演化樹見圖4。由圖4可以看出：供試2個(gè)薯蕷品種的PEBP家族基因主要分布在TFL1-like和FT-like2個(gè)分支上，其中編號為Unigene40804_All的基因(命名為DpTFL1)與擬南芥中已知功能的TFL1基因(基因編號為At5G03840.1)以較高的支持率(88%)聚為一支。

Os： 水稻基因組Oryza sativa Linn. genome； AT： 擬南芥基因組Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh. genome； Dr： 幾內(nèi)亞薯蕷基因組Dioscorea rotundata Poir. genome； CL，Unigene： 薯蕷轉(zhuǎn)錄組Dioscorea polystachya Turcz. transcriptome.

‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’不同部位樣品中PEBP家族成員的表達(dá)豐度見表2。由表2可以看出：分布在TFL1-like分支的5個(gè)基因(基因編號分別為CL1415.Contig6_All、CL1415.Contig3_All、Unigene40804_All、Unigene8060_All以及CL1415.Contig7_All)均在‘鐵棍山藥’具莖生珠芽的葉腋樣品中表達(dá)豐度最高，在其他3個(gè)無莖生珠芽的葉腋樣品中表達(dá)豐度均較低。另外，Unigene40804_All(即DpTFL1基因)只在‘鐵棍山藥’具莖生珠芽的葉腋樣品中特異性表達(dá)，推測該基因可能與莖生珠芽的發(fā)生有關(guān)。

表2 薯蕷品種‘鐵棍山藥’和‘花籽山藥’不同部位樣品中PEBP家族成員的表達(dá)豐度

2.3.3 在莖生珠芽不同發(fā)育期DpTFL1基因的表達(dá)量變化 擴(kuò)增結(jié)果顯示：使用DpTFL1基因的正向引物qDpTFL1-F和反向引物qDpTFL1-R能夠擴(kuò)增出單一條帶，獲得的目的片段長度為187 bp；使用內(nèi)參正向引物DpActin-F和反向引物DpActin-R也能夠擴(kuò)增出單一條帶，獲得的目的片段長度為190 bp。

采用qRT-PCR技術(shù)對DpTFL1基因在‘鐵棍山藥’莖生珠芽4個(gè)不同發(fā)育期的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果(圖5)顯示：DpTFL1基因相對表達(dá)量在‘鐵棍山藥’的莖生珠芽未發(fā)育期最低，但隨發(fā)育過程推進(jìn)，DpTFL1基因表達(dá)水平逐漸升高，DpTFL1基因的相對表達(dá)量在莖生珠芽發(fā)育初期、中期和成熟期均顯著高于莖生珠芽未發(fā)育期；DpTFL1基因的相對表達(dá)量在莖生珠芽發(fā)育成熟期達(dá)到最高，為莖生珠芽發(fā)生初期的10倍。表明DpTFL1基因是薯蕷莖生珠芽特異性表達(dá)基因，且其表達(dá)量隨珠芽的發(fā)育而變化。

T0： 莖生珠芽未發(fā)育期Undeveloped stage of stem bulbil； T1： 莖生珠芽發(fā)育初期Early development stage of stem bulbil； T2： 莖生珠芽發(fā)育中期Middle development stage of stem bulbil； T3： 莖生珠芽發(fā)育成熟期Mature development stage of stem bulbil.

3 討 論

上述研究結(jié)果表明：薯蕷品種‘鐵棍山藥’的具莖生珠芽葉腋部位與其莖上部無莖生珠芽葉腋部位以及無莖生珠芽品種‘花籽上藥’的葉腋部位相比，表達(dá)量上調(diào)的unigenes數(shù)明顯多于表達(dá)量下調(diào)的unigenes數(shù)，說明大部分差異unigenes在莖生珠芽的起始和形成過程中上調(diào)，提示莖生珠芽的啟動過程可能需要更多基因的上調(diào)表達(dá)。前人在白花虎眼萬年青和卷丹的葉面珠芽形成過程中也發(fā)現(xiàn)上調(diào)unigenes數(shù)多于下調(diào)unigenes數(shù)[11，16]。值得注意的是，Weber等[27]和姜福星等[28]的研究結(jié)果表明：注釋為BTB/POZ基因的unigenes表達(dá)量在具葉面莖生珠芽的葉腋部位明顯上調(diào)，該基因能夠調(diào)控其下游基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分裂和分化進(jìn)程。由于在白花虎眼萬年青的葉面珠芽發(fā)育過程中BTB/POZ基因的表達(dá)量也顯著上調(diào)[28]，因此，該基因可能與啟動珠芽發(fā)生相關(guān)。另外，在‘鐵棍山藥’的具莖生珠芽葉腋部位顯著上調(diào)表達(dá)的基因還有蔗糖合成酶基因SUS(另文發(fā)表)，該基因是淀粉合成通路中的重要基因，而淀粉合成在珠芽的起始過程中起重要作用，多糖能夠在莖生珠芽細(xì)胞的成熟過程中積累并促使莖生珠芽的形成[6]，而SUS基因在卷丹莖生珠芽發(fā)育過程中也上調(diào)表達(dá)[16]。因此，推測與淀粉合成相關(guān)的SUS等基因與薯蕷莖生珠芽發(fā)生相關(guān)。

在‘鐵棍山藥’的具莖生珠芽葉腋部位，還發(fā)現(xiàn)多個(gè)與生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素等與激素相關(guān)的基因表達(dá)量明顯上調(diào)，如生長素生物合成基因YUCCA1、生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因ABCB19和LAX2以及細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)運(yùn)基因ENT3等(另文發(fā)表)；這些基因的表達(dá)量在參薯的莖生珠芽發(fā)育期也顯著上調(diào)[17]；在卷丹的莖生珠芽形成過程中，與赤霉素合成相關(guān)的4個(gè)GA2OX基因的表達(dá)量不同程度上調(diào)[15]。因此，在‘鐵棍山藥’的具莖生珠芽葉腋部位中，表達(dá)量顯著上調(diào)的與激素相關(guān)基因也很可能參與了薯蕷莖生珠芽發(fā)育的調(diào)控。

在‘鐵棍山藥’具莖生珠芽葉腋樣品中，特異性表達(dá)的unigenes數(shù)(235)明顯多于3組無莖生珠芽的葉腋樣品(1)，提示在莖生珠芽的形成過程中可能需要更多基因在特定部位表達(dá)。在‘鐵棍山藥’具莖生珠芽葉腋部位特異表達(dá)的基因中，包含一些與細(xì)胞壁修飾相關(guān)的基因，如木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因XET和果膠酶基因PE等，以及18個(gè)與糖合成和運(yùn)輸有關(guān)的基因，如蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因VIF1和海藻糖-磷酸合成酶基因TPS等(另文發(fā)表)。在參薯珠芽發(fā)育初期和馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)塊莖發(fā)生過程中，這些與細(xì)胞壁修飾以及糖合成和運(yùn)輸有關(guān)的基因也顯著上調(diào)表達(dá)[17，29]；而在‘鐵棍山藥’和參薯莖生珠芽的發(fā)育過程中可溶性糖含量呈曲線上升[6，17]。說明這些參與糖代謝的相關(guān)基因可能也參與了薯蕷莖生珠芽發(fā)育的調(diào)控。

在‘鐵棍山藥’具莖生珠芽葉腋部位特異性表達(dá)的與側(cè)枝發(fā)生相關(guān)的unigenes中，Unigenes40804_All被注釋為PEBP家族的TFL1-like同源基因(命名為DpTFL1基因)，其表達(dá)豐度最高。TFL1-like基因可能與植物的莖生珠芽發(fā)生、側(cè)枝形成和塊莖生長相關(guān)，如：在杭白菊中CmTFL1c基因的過表達(dá)可導(dǎo)致其側(cè)枝數(shù)明顯增多[20]；在半夏莖生珠芽的生長發(fā)育過程中PteTFL1基因可能發(fā)揮重要作用[21]；而馬鈴薯的StTFL1基因則可通過調(diào)控糖代謝途徑誘導(dǎo)促進(jìn)馬鈴薯塊莖的形成[30]等。據(jù)此推測DpTFL1基因可能與薯蕷莖生珠芽發(fā)育密切相關(guān)，這一結(jié)論仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，在3組無莖生珠芽的葉腋樣品中特異性表達(dá)的1個(gè)unigene的表達(dá)豐度并不高(FPKM≤1.09)，且該基因在7大功能數(shù)據(jù)庫中均未被注釋為已知功能基因，該基因的功能仍需進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果顯示：隨‘鐵棍山藥’莖生珠芽發(fā)育，DpTFL1基因表達(dá)量逐漸升高，并在莖生珠芽發(fā)育成熟期達(dá)到最高。實(shí)際上TFL1-like基因在不同植物的不同分生組織發(fā)育過程中的表達(dá)模式存在一定差異，例如：半夏的PteTFL1基因在半夏莖生珠芽原基形成期表達(dá)量高，而在其莖生珠芽原基分化期、膨大期和成熟期表達(dá)量則有所減少[21]；在白梨(PyrusbretschneideriRehd.)的花器官發(fā)育過程中，pbTFL1基因在花芽分化初期表達(dá)量最高，在花啟動期明顯下降，在花器官原基開始時(shí)降至很低，之后表達(dá)量不再升高并保持低水平[31]；而金魚草(AntirrhinummajusLinn.)的CEN基因(TFL1同源基因)在花序分生組織中表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，且僅在花序發(fā)育后期表達(dá)量較高，在營養(yǎng)生長期則不表達(dá)[32]。Goretti等[33]認(rèn)為，TFL1-like基因編碼的蛋白能夠通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD形成復(fù)合物，并與特定的染色質(zhì)結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)，如LFY(LEAFY)、AP1(APETALA1)以及FDL1(FD-like1)基因等，從而調(diào)控植物的營養(yǎng)生長與生殖生長，并決定分生組織的命運(yùn)。

此外，TFL1-like基因調(diào)控的下游基因也包括與多種激素通路相關(guān)的基因，以及與糖合成、運(yùn)輸相關(guān)的基因，且與多種激素通路相關(guān)聯(lián)[34]。但不同植物在各類分生組織發(fā)育過程中相關(guān)激素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)以及糖的合成、運(yùn)輸和儲存機(jī)制并不相同，導(dǎo)致在不同的植物中TFL1-like基因表達(dá)量的變化規(guī)律可能存在異同。本研究僅僅闡明了DpTFL1基因在‘鐵棍山藥’莖生珠芽發(fā)育過程中的表達(dá)模式，但該基因是否調(diào)控莖生珠芽的發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。