顧 亞，李 毅，陳 銘，尹鵬濱，張里程，唐佩福解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 00853； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 骨科，北京 00853

外泌體是一種天然的脂質(zhì)體，在調(diào)控骨代謝過程中發(fā)揮重要作用。外泌體可以通過傳遞蛋白、核酸發(fā)揮細(xì)胞間通訊的作用。其還是一種比較理想的藥物載體，憑借歸巢能力，可被靶細(xì)胞特異性吸收。已有研究利用外泌體進(jìn)行骨組織修復(fù)，治療骨折、骨缺損和骨質(zhì)疏松等[1-4]。骨修復(fù)過程涉及骨微環(huán)境中的多種細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞相互影響、相互調(diào)節(jié)，進(jìn)而促使骨修復(fù)重建[5]。研究證明骨組織來源相關(guān)細(xì)胞分泌的外泌體中包含對骨重塑有重要作用的關(guān)鍵因子，如蛋白質(zhì)、miRNA、各種活性因子等[6]。在骨組織工程中，越來越多的研究開始用外泌體代替MSC進(jìn)行骨修復(fù)[7]。外泌體作用于靶向細(xì)胞的方式主要有三種：1)直接與靶細(xì)胞的胞膜融合，同時釋放mRNA、miRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；2)通過內(nèi)吞作用被靶細(xì)胞攝??；3)識別細(xì)胞表面的特異性受體[8]。不同細(xì)胞來源外泌體對骨組織的靶向性目前研究較少。本研究擬提取不同細(xì)胞來源的外泌體，通過在體、離體外泌體分布比較不同外泌體對骨組織的靶向性，篩選出具有高度骨靶向性的外泌體，為構(gòu)建外泌體靶向遞送系統(tǒng)提供參考，以期為臨床治療提供新思路。

材料和方法

1 實(shí)驗動物 36只8周齡C57BL/6雌性小鼠(由解放軍總醫(yī)院國家二級動物實(shí)驗中心提供)，小鼠體質(zhì)量(20±1) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)4周。動物實(shí)驗獲解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：HP2021-50-80403)，并按照《NIH實(shí)驗動物使用指南》(第4版，2008)進(jìn)行。

2 細(xì)胞、試劑和藥品 DMEM培養(yǎng)液、α-MEM培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素雙抗液、胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶 (Sigma公司)；MSC、乳腺癌細(xì)胞(4T1)、成骨前體細(xì)胞(MC-3T3-E1)細(xì)胞株、腎上皮細(xì)胞(293T)細(xì)胞株(均由解放軍總醫(yī)院骨科研究所提供)；細(xì)胞外囊泡 (外泌體) 分離柱(Izon公司)；超濾管 (Millipore公司)；異氟烷(瑞沃德)；DiR熒光染料，DiD熒光染料(北京泛博生物化學(xué)有限公司)；外泌體洗脫柱(Invitrogen)；小動物活體成像系統(tǒng)(美國Kodak公司)。

3 細(xì)胞培養(yǎng) 1) MC-3T3-E1：將MC-3T3-E1細(xì)胞株復(fù)蘇后置于含10%無外泌體胎牛血清、青鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基；2) MSC、4T1和293T：細(xì)胞株復(fù)蘇后均置于含10%無外泌體胎牛血清、青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基；3)以上4種細(xì)胞均置于37℃、5% CO2環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，每48 h換液1次，每天觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞增殖到培養(yǎng)皿面積80%時可進(jìn)行傳代。

4 外泌體提取 將收集的細(xì)胞上清液進(jìn)行濃縮，4 000 g 4℃離心1 h，采用凝膠排阻法對濃縮后的上清液進(jìn)行外泌體提取。收集提取后的外泌體于-80℃保存。

5 外泌體熒光染色 制備熒光標(biāo)記外泌體需全程避光。將制備好的外泌體從-80℃冰箱取出，用DiR熒光染料以1∶100體積比加入外泌體，放入37℃搖床1 h，使其染色充分。利用外泌體洗脫柱，800 g室溫離心3 min，收集離心后液體，鋁箔紙包裹，避光保存。

6 骨質(zhì)疏松模型制作及分組 待C57雌性小鼠到達(dá)12周齡后進(jìn)行去卵巢手術(shù)，術(shù)后8周行micro-CT確認(rèn)骨量降低，開始做小動物活體成像實(shí)驗，根據(jù)四種不同細(xì)胞來源外泌體將小鼠分為4組，每組9只小鼠，其中每組小鼠平均分為3小組，分別進(jìn)行小鼠動態(tài)活體成像、解剖后股骨活體成像和股骨病理切片觀測。

7 在體觀察外泌體分布 將不同細(xì)胞來源外泌體通過尾靜脈分別注射至4組骨質(zhì)疏松小鼠中，每組3只小鼠，在注入熒光外泌體后的1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d，用小動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行活體成像，觀測不同細(xì)胞來源外泌體在骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)的分布。

8 離體觀察外泌體分布 活體觀察發(fā)現(xiàn)在第3天時小鼠下肢骨組織熒光聚集最明顯，于是重新用DiR染色外泌體，分別尾靜脈注射至4組骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)，每組3只小鼠。待第3天處死小鼠，取小鼠心臟、肝、脾、肺、腎與雙下肢骨組織于10 cm2培養(yǎng)皿中，再次用活體成像機(jī)器進(jìn)行圖像采集，用于比較各臟器內(nèi)外泌體含量。

9 股骨病理觀察 大體觀察結(jié)束后，用DiD染色外泌體，分別尾靜脈注射至4組骨質(zhì)疏松小鼠，每組3只。待第3天處死小鼠，將股骨標(biāo)本置于100 g/L多聚甲醛4℃固定48 h后，放入10% EDTA液于4℃冰箱內(nèi)脫鈣24 h。常規(guī)沉糖脫水、OCT包埋，沿股骨冠狀位進(jìn)行切片，切取10 μm厚的病理切片，并利用DAPI染色，封片，觀察股骨內(nèi)熒光外泌體分布。

10 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件、GraphPad Prism 8軟件和Carestream MI SE完成，計量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析(兩兩比較采用t檢驗)；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同來源外泌體骨靶向性在體觀察 從圖1中可以看出MSC來源外泌體、MC-3T3-E1來源外泌體均具有骨靶向性，能夠在骨質(zhì)疏松嚴(yán)重的部位聚集且在第3天達(dá)到最高峰，隨時間延長熒光逐漸消失。293T和4T1來源外泌體在骨質(zhì)疏松嚴(yán)重部位有微量熒光且不隨時間變化而改變，說明其隨著血液循環(huán)在骨組織處停留。提示MSC來源外泌體、MC-3T3-E1來源外泌體具有骨靶向性，而293T、4T1來源外泌體無骨靶向性。

圖1 不同細(xì)胞來源外泌體在體熒光動態(tài)觀察A：活體成像觀察注入熒光外泌體后的體內(nèi)分布情況；B：熒光定量Fig.1 In vivo fluorescence dynamic observation of exosomes from different cell sourcesA: Observation of the distribution of fluorescent exosomes after injection by in vivo imaging; B: Fluorescence quantification

2 不同來源外泌體骨靶向性離體觀察 在外泌體骨聚集最強(qiáng)時間點(diǎn)解剖，進(jìn)行不同器官的離體熒光成像。離體熒光成像顯示四種外泌體均在肝處聚集最強(qiáng)，說明外泌體代謝途徑為肝代謝。其中MSC來源外泌體骨靶向性最好，MC-3T3-E1來源外泌體骨靶向性次之。圖2B為骨組織絕對熒光強(qiáng)度分析，其中MSC來源外泌體熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(P＜0.05)，293T與4T1無統(tǒng)計學(xué)差異。圖2C為骨組織占總體熒光強(qiáng)度的百分比，其結(jié)果與圖2B趨勢一致。

圖2 不同細(xì)胞來源外泌體離體熒光觀察(aP ＜ 0.01；bP ＜ 0.05；ns：not significant)A：熒光最強(qiáng)時間點(diǎn)各組織的分布情況；B：骨組織絕對熒光強(qiáng)度分析；C：骨組織占總體熒光強(qiáng)度的百分比Fig.2 In vitro fluorescence observation of exosomes from different cell sources (aP ＜ 0.01; bP ＜ 0.05; ns: not significant)A: The distribution of each tissue at the time point of the strongest fluorescence; B: Analysis of absolute fluorescence intensity of bone tissue; C: Percentage of bone tissue to overall fluorescence intensity

3 不同來源外泌體骨靶向性免疫熒光染色 股骨組織切片(圖3A)顯示不同來源外泌體均能夠通過血液進(jìn)入骨組織，而進(jìn)一步觀察骨小梁部位，MSC來源外泌體、MC-3T3-E1來源外泌體能夠顯著聚集在骨小梁周圍，293T、4T1來源外泌體在骨小梁聚集較少。骨組織病理切片熒光定量顯示，MSC來源外泌體骨組織內(nèi)熒光強(qiáng)度最高，且與其他三組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，見圖3B。

圖3 股骨組織切片觀察骨小梁部位不同細(xì)胞來源外泌體聚集情況(aP ＜ 0.01；ns：not significant)A：免疫熒光染色股骨組織切片觀察(黃色箭頭：外泌體)；B：熒光定量Fig.3 Femoral tissue section to observe the accumulation of exosomes from different cells in the trabecular bone (aP ＜ 0.01;ns: not significant)A: Observation of femoral tissue sections by immunofluorescence staining (yellow arrows: exosomes); B: Fluorescence quantification

討 論

近年來，外泌體在骨科疾病中的作用被人們廣泛關(guān)注，目前多種細(xì)胞來源外泌體已被證實(shí)參與骨代謝過程[9-10]。供體MSC來源的外泌體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)miR-26a恢復(fù)宿主MSC功能并緩解骨質(zhì)疏松[11]。Cui等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MC-3T3-E1分泌的外泌體能夠進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化，且miRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，進(jìn)一步研究提示成骨前體細(xì)胞來源外泌體可能募集骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行成骨分化。Vracar等[13]研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物依諾沙星能夠通過刺激4T1細(xì)胞分泌外泌體進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞形成。以上研究表明外泌體能夠廣泛參與骨調(diào)控，并能夠修復(fù)骨組織，促進(jìn)骨再生。

既往研究表明干細(xì)胞來源外泌體具有良好的促組織修復(fù)能力，因此被廣泛用于多種類型的組織修復(fù)[14]。Qi等[15]研究發(fā)現(xiàn)人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞可通過促進(jìn)骨再生和血管產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)大鼠臨界顱骨缺損的愈合。Furuta等[16]發(fā)現(xiàn)CD9-/-小鼠由于分泌外泌體量少，骨折愈合速度顯著低于野生型小鼠，而外源性給予間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體能夠加速骨折愈合，而Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過外泌體運(yùn)輸miR-126促進(jìn)骨折愈合。有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體能夠激活MAPK通路進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松癥狀。以上研究表明干細(xì)胞來源外泌體在促骨組織修復(fù)領(lǐng)域具有良好前景。

外泌體具有良好的生物活性，得益于外泌體表面的CD47，它能夠阻止外泌體在血液循環(huán)系統(tǒng)中被單核細(xì)胞清除，因此外泌體具有足夠時長的循環(huán)半衰期和免疫逃逸能力，且能夠加載多種不同的藥物[18]。目前已有多項研究通過對外泌體進(jìn)行工程化改造進(jìn)而治療骨科領(lǐng)域疾病。Song等[19]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體能夠顯著靶向骨組織，并能夠通過抑制破骨細(xì)胞活性進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松癥狀。后續(xù)研究者通過對外泌體進(jìn)行工程化改造以提高其靶向性和促再生能力，進(jìn)而提升修復(fù)效果。Luo等[20]將間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體結(jié)合干細(xì)胞特異性適配體，進(jìn)而增強(qiáng)其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的親和力。研究顯示經(jīng)過適配體修飾后的外泌體具有更好的促骨折愈合能力。以上研究提示我們不同來源的外泌體對骨組織靶向性有顯著差異，挑選合適來源的外泌體對構(gòu)建促組織修復(fù)載體具有重要意義。

為進(jìn)一步探索外泌體對骨的靶向性，本研究選取間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體、成骨前體細(xì)胞來源外泌體、腎上皮細(xì)胞來源外泌體、乳腺癌細(xì)胞來源外泌體進(jìn)行探索。我們推測干細(xì)胞來源、骨細(xì)胞來源以及具有高骨轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞來源的外泌體均可能具有骨靶向性，而腎上皮細(xì)胞系是研究中常用的惰性細(xì)胞系，可能不具有骨靶向性。本研究結(jié)果顯示干細(xì)胞、骨細(xì)胞來源的外泌體骨靶向性好，這與我們的預(yù)期一致。然而腫瘤細(xì)胞與腎上皮細(xì)胞細(xì)胞系來源外泌體均未觀察到骨靶向性。研究結(jié)果提示干細(xì)胞來源外泌體以及成骨前體細(xì)胞來源外泌體可能是構(gòu)建骨靶向性載體的理想選擇。后續(xù)研究需進(jìn)一步探索外泌體骨靶向性的分子機(jī)制，以期為構(gòu)建骨組織藥物遞送載體提供新思路。