孫 娟 王思睿

（北京市第五十七中學(xué) 北京 100038）

高中生物學(xué)教材涉及大量實(shí)驗(yàn)，例如，在生物學(xué)選修1 中有微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、微生物的分離與計(jì)數(shù)[1]等，在選修3 中有基因工程實(shí)驗(yàn)等內(nèi)容。教材中大部分實(shí)驗(yàn)操作都是孤立存在的，更多的是展示一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)的開展和完成過(guò)程，但在解決實(shí)際問(wèn)題時(shí)，學(xué)生往往缺乏將所學(xué)習(xí)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容融會(huì)貫通地組合應(yīng)用，并設(shè)計(jì)一個(gè)完整實(shí)驗(yàn)的相關(guān)訓(xùn)練。

通過(guò)學(xué)習(xí)，學(xué)生可掌握實(shí)驗(yàn)技巧，卻難以深刻理解每個(gè)實(shí)驗(yàn)在科研工作中的實(shí)際應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)旨在使學(xué)生在一個(gè)較為完整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中融會(huì)貫通地應(yīng)用所學(xué)知識(shí)。本實(shí)驗(yàn)將選修1、選修3 中的相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行融合，通過(guò)將紅色熒光基因（Cherry）轉(zhuǎn)入大腸桿菌的科學(xué)實(shí)踐活動(dòng)，促進(jìn)學(xué)生領(lǐng)悟在實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)地應(yīng)用教材知識(shí)，從而進(jìn)一步拓展學(xué)生的視野、提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和動(dòng)手能力，在活動(dòng)中提升學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)原理

質(zhì)粒是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，存在于細(xì)菌擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的小型環(huán)狀DNA 分子[2]。利用質(zhì)粒作為基因工程的載體，能有效將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)PCR 等技術(shù)獲得目的基因，利用限制酶和DNA 連接酶可將目的基因連入質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

經(jīng)Ca2+處理后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞能吸收周圍環(huán)境中的DNA 分子，利用熱激法可將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞。目的基因隨著重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化[3]。

本實(shí)驗(yàn)采用的質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌能在含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中存活，并且目的基因可表達(dá)出紅色熒光蛋白，以上2 點(diǎn)均為篩選轉(zhuǎn)化成功大腸桿菌的依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

儀器與耗材：恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、電子秤、錐形瓶、酒精燈、藥匙、1.5 mL EP 管等。

材料與試劑：含有紅色熒光基因的重組質(zhì)粒、大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞（此感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率高，且常用于目的基因的表達(dá)）、瓊脂、NaCl、酵母粉、蛋白胨、氨芐青霉素等。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3.1 制備培養(yǎng)基

1）稱量：稱取蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g。

2）熔化：將稱量好的蛋白胨、酵母膏和NaCl 加入燒杯中，用玻璃棒攪拌，使其溶解。加入瓊脂，加熱使其熔化。當(dāng)瓊脂完全熔化后，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL。液體培養(yǎng)基不加入瓊脂（同時(shí)制備不含瓊脂的液體培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)的保存）。

3）滅菌：將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，封口，并用皮筋勒緊，再置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃，滅菌20～30 min。

4）倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。其中，一部分培養(yǎng)基添加氨芐青霉素，使其終濃度為100 μg/mL，制備抗性平板培養(yǎng)基。

3.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

1）將100 μL 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化。

2）向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μL 帶有紅色熒光基因的重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰上放置30 min。

3）將離心管置于42℃水浴鍋中放置90 s，然后快速轉(zhuǎn)移至冰中放置2～3 min，注意不要搖動(dòng)離心管。

4）向離心管中加入500 μL 無(wú)菌、無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)1 h。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

3.3 涂布平板

1）取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞菌液，滴加至含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基表面。涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，例如，轉(zhuǎn)化的DNA 總量較多，可取100 μL 左右轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板；反之，如果轉(zhuǎn)化的DNA 總量較少，可取200～300 μL 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。

2）將涂布器在火焰上灼燒，冷卻。

3）用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面，使菌液分布均勻。

4）涂布剩余的菌液4℃保存。如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少，可將剩余的菌液再涂布新的平板。

3.4 過(guò)夜培養(yǎng) 將涂布完的平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃的條件下培養(yǎng)24 h。

3.5 篩選與純化

1）培養(yǎng)12 h 后，觀察菌落的形態(tài)和顏色；如果沒(méi)有紅色菌落，則繼續(xù)培養(yǎng)24～36 h，挑選出培養(yǎng)基上紅色的菌落。

圖1 轉(zhuǎn)化成功后的紅色菌落（方框內(nèi)所示）

2）用滅菌的牙簽挑取紅色菌落，在LB 培養(yǎng)基上通過(guò)平板劃線法純化紅色大腸桿菌，以上操作皆在酒精燈火焰旁完成，接種環(huán)在接觸菌液和每次劃線前都要在酒精燈上灼燒。

3）第1 次劃線完成后培養(yǎng)24 h，挑選出紅色基因表現(xiàn)最明顯的菌落再進(jìn)行培養(yǎng)。劃線操作可重復(fù)多次以達(dá)到純化目的。

圖2 平板劃線法純化獲得的紅色大腸桿菌菌落

4）將最后得到的純化過(guò)的紅色大腸桿菌冷凍保存在含有30%甘油的LB 液體培養(yǎng)基中。

3.6 課時(shí)安排建議 本實(shí)踐活動(dòng)可分3 課時(shí)完成。第1 課時(shí)，學(xué)生可學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的配制、滅菌技術(shù)、倒平板等操作；第2 課時(shí)，學(xué)生可完成細(xì)菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、稀釋涂布等操作；第3 課時(shí)，學(xué)生可完成轉(zhuǎn)化細(xì)菌的篩選和鑒定，并作進(jìn)一步的分離純化（平板劃線法）。有條件的情況下，還可進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)紅色熒光細(xì)菌，并提取其中含有紅色熒光基因的重組質(zhì)粒。

每節(jié)實(shí)踐活動(dòng)都以“理論+實(shí)踐”的模式進(jìn)行，以理論指導(dǎo)實(shí)踐，以實(shí)踐驗(yàn)證理論，在探索活動(dòng)中促進(jìn)學(xué)生全面學(xué)習(xí)。

4 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)將教材中零散的實(shí)驗(yàn)知識(shí)整合，使學(xué)生對(duì)所學(xué)實(shí)驗(yàn)知識(shí)在實(shí)際科研中的應(yīng)用有了更加具體、清晰地認(rèn)識(shí)，體驗(yàn)較系統(tǒng)、完整的實(shí)驗(yàn)操作流程。在支架式教學(xué)理念中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)都是按“最近發(fā)展區(qū)”的要求建立基礎(chǔ)概念的過(guò)程，通過(guò)創(chuàng)建“獲取紅色熒光細(xì)菌”的情境，學(xué)生可在獨(dú)立探索和協(xié)作學(xué)習(xí)中，更好地體會(huì)、領(lǐng)悟各小實(shí)驗(yàn)在大實(shí)驗(yàn)流程中的價(jià)值，在實(shí)驗(yàn)開展和結(jié)束后不斷進(jìn)行效果評(píng)價(jià)，并針對(duì)出現(xiàn)的問(wèn)題加以解決，從而促進(jìn)知識(shí)的學(xué)習(xí)和能力的提升。

通過(guò)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)對(duì)于中學(xué)生難度并不大，學(xué)生能在不占用太多課余時(shí)間的情況下完成實(shí)驗(yàn)。學(xué)生親身體驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程有助于提升學(xué)生學(xué)習(xí)生物學(xué)的興趣、培養(yǎng)學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、動(dòng)手操作也培養(yǎng)了學(xué)生的動(dòng)手能力和解決問(wèn)題的能力[4]。本實(shí)驗(yàn)由于條件受限，直接采購(gòu)了含有Cherry基因的質(zhì)粒，希望在將來(lái)能將DNA 的提取、質(zhì)粒的提取、PCR 和瓊脂糖凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)過(guò)程都加入其中，使學(xué)生能感受更加完整、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。