吳曉軍，胡喜貴，陳向東，姜小苓，張雪寧，王玉泉，董 娜，胡鐵柱，李笑慧，茹振鋼

(河南科技學院 小麥中心，河南省雜交小麥重點實驗室，現代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

小麥是世界主要糧食作物之一，不斷提高產量、品質和抗逆性是小麥育種的主要目標[1]。近幾十年來，干旱已經成為影響小麥生產的主要非生物因素之一，隨著全球氣候變暖，預計干旱的嚴重程度和發(fā)生頻率會進一步增加[2-3]。因此，選育小麥強抗旱性品種將是促進小麥生產持續(xù)高產、穩(wěn)產的有效途徑[4-5]。隨著分子生物學和基因組學的深入研究，小麥抗旱性分子機制得以逐漸解析，并發(fā)現了一些與抗旱性相關的功能基因和緊密連鎖的分子標記，分子標記與常規(guī)育種相結合有利于提升小麥抗旱性育種效率。

植物在干旱等非生物因素脅迫下會產生滲透脅迫、離子脅迫和由于活性氧積累而產生的次級氧化脅迫[6]。鐵結合蛋白(Ferritin，Fer)是一種存在于植物體內的鐵儲藏蛋白，具有調節(jié)植物體內鐵吸收與釋放以及提高植物抗氧化脅迫能力的功能[7]。鞠麗萍等[8]利用強抗旱和弱抗旱小麥品種中TaFer基因在染色體A1上的序列差異，設計出共顯性標記FerA1-intrl，在150份小麥材料中檢測出2種變異類型，分別是TaFer-A1a(167 bp條帶)和TaFer-A1b(170 bp條帶)，單倍型TaFer-A1a材料的萌發(fā)期抗旱性極顯著高于單倍型TaFer-A1b。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類在生物體內廣泛分布的高度保守低分子質量蛋白質，具有多種生物學功能，參與調節(jié)體內氧化還原反應平衡，調節(jié)細胞生長，抑制凋亡，調節(jié)抗逆基因表達和抗氧化脅迫過程[9-11]。張帆等[12]在普通小麥5B染色體短臂上克隆了1個硫氧還蛋白超家族新基因TaNRX-B1，開發(fā)了2對顯性互補STS標記，在150份小麥品種(系)中檢測到2種與抗旱性相關的變異類型，分別為抗旱型TaNRX-B1a(841 bp條帶)和敏感型TaNRX-B1b(870 bp條帶)。劉芳軍等[13]對117份寧夏小麥品種(系)以及孫曉燕等[14]對137份內蒙古春小麥品種(系)育種材料進行了FerA1-intrl標記和TaNRX-B1標記檢測分析，結果表明，2個分子標記對小麥抗旱性進行選擇是有效的。

小麥花前可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)占莖鞘總干質量的40%以上[15]，是籽粒灌漿的重要碳源，對籽粒產量的貢獻率在20%左右，在干旱脅迫條件下貢獻率可高達50%以上[16]。果聚糖是小麥莖鞘中WSC的主要存在形式，最高可達莖鞘WSC的85%，當莖鞘 WSC 轉運時，果聚糖外切水解酶(Fructan exohydrolase，FEH)將果聚糖催化降解為蔗糖，再運輸到籽粒中，對小麥高產穩(wěn)產具有重要作用[17-18]。Zhang等[19-20]利用2個普通小麥材料Westonia和Kauz克隆了3個1-FEH相關基因，其中位于6B染色體的1-FEHw3基因是催化果聚糖降解的主要基因，序列分析表明，在其啟動子上游279 bp的位置存在1個SNP位點，進一步分析發(fā)現，該位點與小麥品種Westonia在干旱條件下的高千粒質量相關，小麥品種Kauz雖然也是耐旱品種，但是在干旱條件下的千粒質量低于Westonia。據此設計出1對CAPS標記，用以區(qū)分高千粒質量抗旱型Westonia type(102 bp條帶)和低千粒質量抗旱型Kauz type(116 bp條帶)。

脫水反應元件結合蛋白(DREB)屬于AP2/ERF轉錄因子家族成員，能夠調控一些干旱、高鹽和低溫等相關基因的表達，在植物抗逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[21]。雷夢林等[22]研究發(fā)現，在PEG、NaCl、ABA和低溫脅迫下，Dreb-A1、Dreb-B1基因在葉片和幼根中均上調表達。王計平等[23]對43份小麥材料進行苗期抗旱性鑒定，其中人工合成六倍體小麥W7984的抗旱性等級為中等抗旱性，普通小麥Opata 85為干旱敏感。Wei等[24]利用2個小麥材料Opata85和W7984克隆TaDreb基因，序列分析發(fā)現，位于TaDreb-B1基因片段上的內含子具有2個SNP (646 bp和770 bp位置)差異，根據基因770 bp處的 SNP(A/C)設計等位基因特異性PCR(Allele specific PCR，AS-PCR )引物，將TaDreb-B1基因定位于3B染色體長臂上，開發(fā)的多態(tài)性分子標記TaDreb-B1在人工合成六倍體小麥W7984中擴增出2條帶(616 bp條帶和低于600 bp的條帶)，為抗旱型TaDreb-B1a，而在普通小麥Opata85中只擴增出1條616 bp條帶，為干旱敏感型TaDreb-B1b。

黃淮麥區(qū)是我國小麥主產區(qū)，生長期內降水量少，干旱天氣對小麥生產影響較大，近年來受全球變暖影響，干旱天氣更是頻發(fā)[25-26]。因此，在小麥育種中應特別注重親本材料抗旱性的鑒定及改良。為此，對48份國外引進的小麥種質進行相對發(fā)芽率表型鑒定，并利用4個小麥抗旱性相關基因1-feh-w3、Dreb-B1、NRX-B1和FerA1的分子標記進行抗旱性檢測，以評價這些抗旱性相關分子標記的有效性，篩選抗旱能力突出的抗旱基因組合及相關小麥種質，為小麥育種中的親本選擇和抗旱性分子標記利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

48份國外小麥種質分別引自澳大利亞、墨西哥、法國、智利等10多個國家，其中Madsen、Attila、Pavon、Pastor、Norin61、Salmone、Kanto107、Manital、Opata、Glenlea、RL6077共11份材料，由山東省農業(yè)科學院作物研究所資源庫提供，其余材料由河南科技學院小麥中心保存并提供。

1.2 萌發(fā)期抗旱性鑒定

按照小麥抗旱性鑒定評價技術規(guī)范(GB/T 21127—2007)測定小麥種子的相對發(fā)芽率(20% PEG-6000溶液培養(yǎng)7 d的小麥種子發(fā)芽率與蒸餾水培養(yǎng)7 d的小麥種子發(fā)芽率的比值)。根據相對發(fā)芽率數值劃分抗旱等級，分為極強(相對發(fā)芽率≥90.0%)、強(70.0%～89.9%)、中等(50.0%～69.9%)、弱(30.0%～49.9%)、極弱(相對發(fā)芽率≤29.9%)5個等級[27]。

1.3 DNA提取和分子標記檢測

小麥基因組總DNA采用CTAB法提取，將DNA原液稀釋至100 ng/μL質量濃度，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4個抗旱性相關基因1-feh-w3(CAPs分子標記)、Dreb-B1(AS-PCR)、FerA1(SSR分子標記)和NRX-B1(STS分子標記)的分子標記引物均由上海賽默飛世爾科技有限公司合成，引物信息見表1。PCR擴增體系為20 μL，包含2×TaqMaster Mix 10 μL(北京康為世紀生物有限公司)、10 μmol/L正反向引物各0.6 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL、ddH2O 7.8 μL。PCR反應擴增程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，52～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，32～35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

表1 4個分子標記的引物信息Tab.1 Primer information of 4 molecular markers

1-feh-w3基因的CAPs分子標記 PCR擴增產物長度為241 bp，使用限制性內切酶BsoBⅠ對擴增產物進行酶切，15 μL酶切體系包括限制性內切酶BsoBⅠ 0.3 μL、DNA 10 μL、10×NEBuffer 1.5 μL、ddH2O 3.2 μL，然后將酶切產物使用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測。Dreb-B1基因的分子標記根據基因770 bp處的 SNP設計等位基因特異性PCR(AS-PCR)引物，NRX-B1基因的分子標記為顯性互補STS標記，它們的擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。FerA1基因的分子標記為 SSR分子標記，擴增產物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，銀染后分析結果。

1.4 統(tǒng)計分析

使用軟件Excel 2016、SPSS 25.0進行數據統(tǒng)計分析。參考張海萍等[28]的方法，對含有該等位基因的品種賦值為“1”，不含該等位基因的品種賦值為“0”，采用SPSS 25.0進行分子標記單倍型與相對發(fā)芽率的相關性分析，利用Spearman相關分析模型評估每個等位基因與相對發(fā)芽率的相關顯著性。

2 結果與分析

2.1 48份小麥外引種質的種子相對發(fā)芽率

相對發(fā)芽率測定結果顯示，48份小麥外引種質材料相對發(fā)芽率為34.9%～94.5%，平均相對發(fā)芽率為70.0%(表2)，種質材料的相對發(fā)芽率間存在明顯差異。其中，抗旱性等級達極強、強、中等、弱和極弱的種質材料分別為3，22，16，7，0份，占到供試材料的6.3%，45.8%，33.3%，14.6%和0；中等及以上抗旱等級的種質材料占85.4%；其中，種質墨S139、CL0442、Salmone的相對發(fā)芽率分別為94.5%，93.8%，93.0%，達極強抗旱等級(表2)。

表2 48份外引種質中抗旱基因單倍型類型及相對發(fā)芽率Tab.2 Haplotypes and relative germination rate of drought resistant genes in 48 introduced germplasms

表2(續(xù))

2.2 1-feh-w3基因的分子標記檢測

利用1-feh-w3基因的CAPs分子標記(引物6BPF2、6B60R)對48份外引小麥種質進行檢測，擴增產物長為241 bp，再經限制性內切酶BsoBⅠ酶切，切出102 bp條帶的為Westonia type，切出116 bp條帶的為Kauz type。結果顯示，31份小麥種質酶切切出102 bp特異性條帶，為高千粒質量抗旱型Westonia type，占64.6%，其余17份小麥種質酶切切出116 bp特異性條帶，為低千粒質量抗旱型Kauz type，占35.4%(圖1、表2)。

2.3 Dreb-B1基因的分子標記檢測

利用Dreb-B1基因序列770 bp處的SNP設計AS-PCR引物(P40、P18R)，對48份外引種質進行檢測，其中擴增產物有2條帶(1條為616 bp，1條小于616 bp)的為抗旱型TaDreb-B1a，擴增產物只有1條616 bp特異性條帶的為干旱敏感型TaDreb-B1b。結果顯示，17份小麥種質擴增出1條616 bp特異性條帶，為干旱敏感型TaDreb-B1b，占35.4%，其余31份小麥種質擴增出2條特異性條帶，為抗旱型TaDreb-B1a，占64.6%(圖2、表2)。

2.4 NRX-B1基因的分子標記檢測

利用NRX-B1基因顯性互補STS標記對48份外引種質進行檢測，在25份小麥種質中擴增出抗旱型TaNRX-B1a單倍型的841 bp特異性條帶，占52.1%；在18份小麥種質中擴增出干旱敏感型TaNRX-B1b單倍型的870 bp特異性條帶，占37.5%；48份外引種質中有5份小麥種質沒有擴增出條帶，占10.4%(圖3、表2)。

2.5 FerA1基因的分子標記檢測

利用FerA1基因的共顯性STS標記對48份外引小麥種質進行檢測，結果顯示，有2份小麥種質擴增出170 bp特異性條帶，為干旱敏感型TaFer-A1b單倍型，占4.2%；其余46份小麥種質均同時擴增出167，170 bp 2條帶，為FerA1基因雜合型位點，占95.8%(圖4、表2)。

2.6 基因單倍型與相對發(fā)芽率的關系及相關性分析

本研究中，每個抗旱相關基因均包含2種單倍型，就單個基因2種單倍型的平均相對發(fā)芽率來看，1-feh-w3基因的Westonia type 單倍型與Kauz type單倍型沒有顯著差異；Dreb-B1基因和FerA1基因各自的2種單倍型間差異均達顯著水平；NRX-B1基因的TaNRX-B1b單倍型平均相對發(fā)芽率略高于TaNRX-B1a，但差異不顯著(表3)。其中，TaDreb-B1a單倍型的平均相對發(fā)芽率最高，為72.75%，TaFer-A1(H)單倍型平均相對發(fā)芽率次之，為70.94%。

4個抗旱性基因單倍型與平均相對發(fā)芽率的相關性分析結果顯示，1-feh-w3基因的單倍型Westonia type和Kauz type，NRX-B1基因的單倍型TaNRX-B1a和TaNRX-B1b與相對發(fā)芽率相關性不顯著；Dreb-B1基因的TaDreb-B1a單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著正相關，TaDreb-B1b單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著負相關；FerA1基因的TaFer-A1(H)單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著正相關，TaFer-A1b單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著負相關(表3)。

在外引種質材料中，4個基因共有10種單倍型組合類型(表4)，單倍型組合Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b占總數比例最高，為20.8%，達強抗旱性等級，Kauz type/TaDreb-B1b/TaFer-A1(H)的比例最低，為2.1%，達中等抗旱性等級。平均相對發(fā)芽率最高的單倍型組合是Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a，達77.35%，其次Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b，為75.82%，Kauz type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a，為75.39%，以上單倍型組合均達到強抗旱性等級；平均相對發(fā)芽率最低的單倍型組合是Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1b，為48.16%，且未檢測到TaNRX-B1基因的單倍型，為弱抗旱性等級。Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a、Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b、Kauz type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a單倍型組合類型中，中等及以上抗旱性等級種質材料分別占該組合類型的100.0%,90.0%,100.0%(表4)。

表3 不同基因單倍型對種子相對發(fā)芽率的影響及相關性分析Tab.3 Performance of seed relative germination rate of different haplotypes and correlation analysis

表4 不同單倍型組合對種子相對發(fā)芽率的影響Tab.4 Performance of seed relative germination rate of different haplotype combinations %

3 結論與討論

相對發(fā)芽率與抗旱指數呈極顯著正相關關系，能在一定程度上反映小麥全生育期的抗旱性，是評估小麥抗旱性的重要指標[29]。雖然對于小麥抗旱相關基因位點的研究取得了較多進展，但相關抗旱性分子標記在小麥育種中的應用還較為有限[30]。張帆等[12]利用開發(fā)的TaNRX-B1基因抗旱性分子標記對150份小麥品種(系)進行檢測，平均相對發(fā)芽率達到中等及以上抗旱性等級品種(系)占70.0%，TaNRX-B1a單倍型的平均相對發(fā)芽率顯著高于TaNRX-B1b單倍型。劉芳軍等[13]利用TaFer-A1和TaNRX-B1基因的抗旱性分子標記 對117份寧夏小麥品種(系)進行檢測，并鑒定了種子萌發(fā)期的相對發(fā)芽率，結果顯示，寧夏小麥種子萌發(fā)期平均相對發(fā)芽率達到73.3%，中等及以上抗旱性等級品種(系)占75.2%；TaFer-A1和TaNRX-B1基因的分子標記檢測結果與平均相對發(fā)芽率表型一致性較好，可以用于小麥抗旱性的鑒定和篩選。孫曉燕等[14]利用TaFer-A1和TaNRX-B1基因的抗旱性分子標記對137份內蒙古春小麥育種材料進行檢測，有58份材料屬于抗旱基因型。本研究中，48份外引小麥種質的平均相對發(fā)芽率達到70.0%，而中等及以上抗旱性等級的種質材料占到85.4%，明顯超過以上國內研究中的抗旱小麥種質的比例?？赡艿脑蚴?，一直以來從不同地區(qū)引進的小麥種質資源對改良國內小麥的產量性狀、品質性狀和抗逆性等起到了重要作用[31]，一般都具有優(yōu)良的農藝性狀，經過優(yōu)選引入國內，總體上來說平均抗旱水平相對高出一些。

本研究中，TaDreb-B1a單倍型的平均相對發(fā)芽率最高，為72.75%，TaFer-A1(H)單倍型平均相對發(fā)芽率為70.94%，兩者均與平均相對發(fā)芽率表型呈顯著正相關關系，且TaDreb-B1a單倍型與TaDreb-B1b單倍型，TaFer-A1(H)單倍型與TaFer-A1b單倍型的平均相對發(fā)芽率差異均達到顯著水平，說明Dreb-B1和FerA1基因的抗旱性分子標記可用于小麥抗旱性的鑒定和篩選。而1-feh-w3和NRX-B1基因的抗旱性分子標記與供試材料的平均相對發(fā)芽率相關并不顯著。1-feh-w3基因的Westonia type單倍型與Kauz type單倍型，NRX-B1基因的TaNRX-B1a單倍型與TaNRX-B1b單倍型間平均相對發(fā)芽率差異均不顯著。分析認為，1-feh-w3基因的單倍型Westonia type與Kauz type的抗旱性表型差異研究是基于小麥品種Westonia和Kauz為親本創(chuàng)制的DH系，在其他小麥品種(系)中的驗證研究還未見報道，在本研究中的檢測效果并不理想。NRX-B1基因的單倍型TaNRX-B1a與TaNRX-B1b在前人研究中具有顯著差異，對小麥抗旱性檢測是有效的[13-14]，但并未進行相關性分析，基因效應大小也不明確，而在本研究中顯示檢測效果并不理想，還有待進一步驗證。

10種單倍型組合的平均相對發(fā)芽率值大小與各基因抗旱性單倍型累加結果基本一致。平均相對發(fā)芽率以單倍型組合Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a最高，Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b次之，Kauz type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a稍低于Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b。除此之外，單倍型組合Westonia type/TaDreb-B1b/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a的平均相對發(fā)芽率低于Westonia type/TaDreb-B1b/TaFer-A1(H) /TaNRX-B1b，充分表明NRX-B1基因在本研究中對抗旱性的檢測是無效的。小麥抗旱性是由眾多基因控制的復雜數量性狀，雖然許多抗旱相關基因被克隆出來，但涉及不同代謝通路，抗旱機制十分復雜，而且受環(huán)境因素的影響也較大[29]，這就需要進一步加強基因功能及其調控研究，并使用更多的小麥品種(系)對相關抗旱性分子標記的有效性進行充分驗證。

本研究對48份小麥外引種質材料的相對發(fā)芽率進行測定，利用4個分子標記檢測所含抗旱性基因單倍型類型，鑒定出一些抗旱種質資源。并首次驗證了抗旱性相關基因Dreb-B1分子標記的有效性，初步證明了1-feh-w3基因2種單倍型對抗旱性選擇是無效的。研究結果為外引種質的有效利用和抗旱性分子標記輔助選擇技術在小麥育種中的應用提供了一些科學依據。