彭龍 張立平

摘要 目的：采用16S rRNA高通量測序技術分析柴芪湯對代謝綜合征（MS）大鼠腸道菌群的影響。方法：通過Illumina Miseq PE300型高通量測序儀對大鼠糞便腸道菌群進行16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)檢測，運用Usearch、Mothur、LEfSe分析腸道菌群的組成結(jié)構及不同菌屬相對豐度變化。結(jié)果：柴芪湯能夠逆轉(zhuǎn)MS大鼠腸道菌群物種多樣性的下降，并糾正MS導致的菌群組成結(jié)構改變。研究發(fā)現(xiàn)MS大鼠的腸道菌群在菌屬水平有57個菌屬相對豐度發(fā)生顯著變化，而柴芪湯能將其中的54個菌屬恢復至正常水平。結(jié)論：從腸道微生態(tài)角度闡釋了MS的可能病機，柴芪湯可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群防治MS。

關鍵詞 代謝綜合征;柴芪湯;健脾疏肝;腸道菌群;16S rRNA高通量測序;炎癥反應;短鏈脂肪酸;脂多糖

Effects of Chaiqi Decoction on Gut Microbiota in MS Rats Based on 16S rRNA

High-Throughput Gene Sequencing Study

PENG Long，ZHANG Liping

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Chaiqi Decoction on gut microbiota in metabolic syndrome rats based on high-throughput 16S rRNA gene sequencing.Methods：Illumina Miseq PE300 high-throughput sequencer was used to detect the 16S rRNA gene V3-V4 variable region of rat fecal intestinal flora.Usearch，Mothur，and LEfSe were used to analyze the composition and structure of intestinal flora and the relative abundance of different bacteria.Results：Chaiqi Decoction can reverse the decline in the species diversity of the intestinal flora of rats with metabolic syndrome and correct the changes in the composition and structure of the flora caused by the metabolic syndrome.The study found that the relative abundance of 57 genera of the intestinal flora of rats with metabolic syndrome changed significantly at the level of genus，and Chaiqi Decoction could restore 54 of them to normal levels.Conclusion：The possible pathogenesis of metabolic syndrome from the perspective of intestinal microecology is explained.Chaiqi Decoction could prevent and treat metabolic syndrome by regulating the intestinal flora.

Keywords Metabolic syndrome; Chaiqi Decoction; Invigorating spleen and soothing liver; Gut microbiota; 16S rRNA high-throughput gene sequencing; Inflammation reaction; Short-chain fatty acids; Lipopolysaccharide

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.014

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）是一組復雜的代謝紊亂癥候群，包括糖代謝異常、腹型肥胖、血脂代謝異常和高血壓，是心腦血管疾病、慢性腎病、非酒精性脂肪肝等疾病的重要危險因素之一[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群是影響人體物質(zhì)能量代謝的重要因素，同時也是導致炎癥介質(zhì)過度表達、胰島素抵抗，并進一步引起MS重要原因[2]，而中醫(yī)學認為脾胃主運化，與腸道菌群功能相符，因此從調(diào)理脾胃即調(diào)節(jié)腸道菌群入手改善MS患者的代謝狀態(tài)成為近年來的研究熱點。張立平教授認為，肝失疏泄、脾失健運狀態(tài)導致物質(zhì)代謝能力下降是其發(fā)病的核心病機[3]，并提出應用健脾疏肝調(diào)理脾胃法治療MS，擬方“柴芪湯”。前期研究中課題組已經(jīng)證實柴芪湯能夠糾正代謝異常狀態(tài)，改善MS大鼠的胰島素抵抗，減輕血管內(nèi)皮損傷[4-10]。本研究采用微生物16S rRNA高通量測序技術，進一步研究MS及柴芪湯干預后大鼠腸道菌群結(jié)構與組成的變化，并鑒定豐度顯著差異的菌屬，從腸道微生態(tài)角度闡釋柴芪湯防治MS的機制，并為柴芪湯在防治MS臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠;體質(zhì)量（200±10）g;周齡：6～8周齡;來源：北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院SPF級動物實驗室[SYXK（京）2019-0013]中，室內(nèi)溫度：23～25 ℃，相對濕度（55±10）%，40 W日光燈照射，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜。自由進食、飲水。實驗中對實驗動物的處理遵循3R原則，并通過北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院倫理委員會審議（倫理審批號：201902）。

1.1.2 藥物 柴芪湯顆粒（柴胡10 g、黃芪30 g、白術10 g、枳實10 g、三七粉3 g）由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑中心制備。

1.1.3 試劑與儀器 1）試劑：E.Z.N.A. soil DNA kit（美國Omega Bio-tek公司，貨號：D5625-01）;瓊脂糖（西班牙biowest公司，貨號：BY-R0100）;NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（美國Bioo Scientific公司，貨號：5144-08）;FastPfu Polymerase，（TransGen公司，貨號：AP221-02）;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國Axygen Biosciences公司，貨號：AP-GX-50）;MiSeq Reagent Kit v3（美國Illumina公司，貨號：MS-102-3003）。2）儀器：超微量分光光度計（Thermo Scientific公司，美國，型號：NanoDrop2000型）;PCR儀（ABI公司，美國，型號：9700型）;高通量測序儀（Illumina公司，美國，型號：Miseq PE300型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

按照本課題組前期研究已建立的造模方法[4]，用高糖高脂高鹽飼料（基礎飼料50%、熟豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇2%、奶粉7.5%、果糖10%、棕櫚油5%、食用鹽3%、魚粉2%、膽鹽0.5%，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司）。喂養(yǎng)SD大鼠8周，以制備代謝綜合征動物模型，將造模成功后的大鼠應用隨機數(shù)字表法隨機分為模型組（7只）、觀察組（7只）;普通飼料喂養(yǎng)的SD大鼠作為正常組（7只）。

1.2.2 給藥方法 造模第9周，觀察組開始灌胃予柴芪湯藥液11.34 g/（kg·d），并恢復普通飼料，連續(xù)給藥4周;模型組繼續(xù)高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)，并與正常組同時給予等量蒸餾水灌胃。

1.2.3 檢測指標與方法 末次給藥24 h后收集糞便，采用微生物16S rRNA高通量測序技術對糞便菌群進行分析。

1.2.3.1 腸道菌群DNA提取 采用E.Z.N.A. soil DNA kit試劑盒參照說明書對糞便樣本進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。

1.2.3.2 16S rRNA基因PCR擴增及測序 1）預變性（95 ℃，3 min）。2）27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）。3）穩(wěn)定延伸（72 ℃，10 min）。4）保存（4 ℃，ABI GeneAmp 9700型PCR儀）。PCR體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上游引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）0.8 μL，下游引物和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL，每個樣本重復3次。

1.2.3.3 測序數(shù)據(jù)收集 1）回收（混合后，2%瓊脂糖凝膠回收）。2）純化（Purification）。3）檢測（2%瓊脂糖凝膠，Quantus Fluorometer定量檢測）。4）建庫（NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Ki）：a.接頭鏈接;b.磁珠篩選去除接頭自連片段;c.應用PCR擴增進行文庫模板的富集;d.磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。5）測序（Illumina Miseq PE300平臺，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序操作，原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫）。

1.2.3.4 測序數(shù)據(jù)分析 1）過濾：（窗口：50 bp;過濾：reads質(zhì)量<20，長度<50 bp，包含N堿基）。2）拼接：（軟件：FLASH;邏輯：PE reads之間的overlap關系;最小overlap長度為10 bp）。3）拼接篩選：（最大錯配比率：20%）。4）修正（barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2）。5）分析（軟件：UPARSE 7.1;相似度：97%;分析：OTU聚類分析;物種分類注釋：RDP classifier;比對：Silva數(shù)據(jù)庫（SSU128），比對閾值70%）。所有測序數(shù)據(jù)分析Trimmomatic質(zhì)控下進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示;多組間比較，方差齊性者采用單因素方差分析，方差不齊者的采用非參數(shù)檢驗，設置95%為置信區(qū)間。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

模型驗證及柴芪湯對MS大鼠代謝相關指標影響：本研究采用了與本課題組前期研究的造模方法，第16周檢測并記錄各組體質(zhì)量、血糖、血清總膽固醇（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、收縮壓/舒張壓，模型組上述指標均顯著高于正常組（P<0.05），同時符合《中國2型糖尿病防治指南2017版》及國際糖尿病聯(lián)盟[2]的MS診斷標準，造模成功。同時柴芪湯能夠顯著降低模型大鼠的上述體征及指標，與前期研究一致[4，10]。

2.1 測序結(jié)果質(zhì)量分析

1）14個樣本通過測序經(jīng)質(zhì)控過濾后共獲得816 954條有效序列數(shù)目，平均單個樣本產(chǎn)生58 354條有效序列，平均序列長度418.549;341 771 653 bp有效堿基，平均單個樣本24 412 261 bp有效堿基。在97%的相似度水平下對序列進行聚類，共發(fā)現(xiàn)735種OTUs。稀釋曲線結(jié)果顯示，曲線隨測序量增加而趨向平緩，各樣本物種豐度指數(shù)Sobs指數(shù)或多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)并不會隨測序數(shù)據(jù)量的增加而繼續(xù)增加。見圖1。表明本研究所有樣本序列充分，目前的測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種，獲得數(shù)據(jù)可以用于分析。2）腸道菌群Alpha多樣性分析：Alpha多樣性分析后可得到豐度指數(shù)Sobs、Ace、Chao，多樣性指數(shù)Shannon、Simpson，覆蓋度指數(shù)Coverage。見表1。結(jié)果顯示，各組覆蓋度良好，組間比較顯示，模型組Sobs指數(shù)較正常組顯著降低（P<0.05），模型組Ace指數(shù)、Chao指數(shù)較正常組顯著降低（P<0.01）;而觀察組Ace指數(shù)、Chao指數(shù)較模型組顯著升高（P<0.05）。提示MS可以導致腸道菌群豐度下降，而給予柴芪湯干預后能夠提高腸道菌群物種豐度。

2.2 物種組成分析

1）主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）得分圖中樣本組成差異的解釋度值主坐標值1（Principal Coordinates 1，PC1）、主坐標值2（Principal Coordinates 2，PC2）、主坐標值3（Principal Coordinates 3，PC3）分別為46.76%、20.58%、11.72%，其中模型組樣本與正常組樣本完全分開，觀察組樣本更接近于正常組，證明MS大鼠的腸道菌群結(jié)構較健康正常大鼠發(fā)生了較大變化，而柴芪湯能夠促進腸道菌群組成結(jié)構的恢復。見圖2。2）門水平下各樣本腸道菌群組成結(jié)構情況見圖3，所有樣本共檢測到細菌菌門6個，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）參與構成菌群的主要部分，模型組較正常組厚壁菌門/擬桿菌門比例升高，同時放線菌門（Actinobacteria）相對豐度增加，觀察組腸道菌群結(jié)構與正常組類似。3）LEfSe分析得出的多級物種層級樹圖見圖4，模型組較正常組有57個菌屬發(fā)生改變，包括Anaeroplasma、Bacteroides_pectinophilus_group、Muribaculum、norank_f_Christensenellaceae、Pygmaiobacter、Ruminiclostridium、Papillibacter、Ruminiclostridium_6、Ruminococcus_1、Odoribacter、Ruminiclostridium_1、Helicobacter、Ruminiclostridium_9、norank_o_Mollicutes_RF39、norank_f_Flavobacteriaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group、Clostridium_sensu_stricto_1、norank_f_Erysipelotrichaceae、Elusimicrobium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Alistipes、Tyzzerella、Harryflintia、norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group、norank_f_Muribaculaceae、Barnesiella、unclassified_f_Clostridiaceae_1、Intestinimonas、Oscillibacter、Ruminococcaceae_UCG_013、Ruminococcace-ae_UCG_010、Prevotella_1、unclassified_p_Firmicutes、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Candidatus_Saccharimonas、Blautia、Holdemania、Erysipelotrichaceae_UCG_003、Negativibacillus、Phascolarctobacterium、Ruminococcaceae_UCG_008、Anaerostipes、Sutterella、Ruminococcus_torques_group、unclassified_f_Lachnospiraceae、Enterococcus、Ruminococcus_gauvreauii_group、Candidatus_Stoquefichus、Fusicatenibacter、Globicatella、Clostridium_innocuum_group、Coprococcus_3、Lachnospiraceae_UCG_001、Streptococcus、Lachnospiraceae_UCG_010、Faecalitalea、Lachnoclostridium、Anaerofustis。而柴芪湯能夠?qū)⑵渲?4個菌屬調(diào)回至正常水平，并能將Parabacteroides、Erysipelatoclostridium、Roseburia、Catabacter、Family_XIII_UCG_001、cBacteroides 6個菌屬的相對豐度提高至正常水平以上。

3 討論

人類體內(nèi)的微生物群由多達10～100萬億微生物組成，而這個數(shù)字比構成人體的細胞至少多10倍，這意味著構成人體的細胞中有10%是人類的，90%是微生物的。腸道微生物群提供了我們?nèi)祟愋玛惔x無法完成的重要代謝和生物學功能，并在宿主能量穩(wěn)態(tài)和代謝功能中起重要作用。研究表明，腸道菌群通過影響能量平衡[12-14]、葡萄糖代謝和與肥胖和相關代謝紊亂及低度炎癥反應[15-17]參與全身代謝，其可能途徑包括參與能量和物質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)炎癥反應信號通路，干預免疫，影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)等。腸道菌群在代謝性疾病的發(fā)病過程中扮演了重要角色，這使我們看到了調(diào)節(jié)腸道菌群在針對MS及其相關并發(fā)癥的治療干預中的潛在重要性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)具有疏肝健脾作用的柴芪湯能夠改善MS大鼠的代謝異常狀態(tài)，結(jié)合中醫(yī)對脾胃功能的認知與腸道菌群功能的重合性，我們推測腸道菌群可能是柴芪湯防治MS的關鍵，故本研究采用16S rRNA高通量測序技術探究柴芪湯對MS大鼠腸道菌群組成結(jié)構的影響。

Alpha多樣性分析一般用于微生物群落的豐富度和多樣性分析，其結(jié)果為一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)，其中豐富度指數(shù)包括Sobs、Ace、Chao，多樣性指數(shù)包括Shannon、Simpson。經(jīng)過統(tǒng)計學分析，我們發(fā)現(xiàn)MS大鼠豐富度指數(shù)（Sobs、Ace、Chao）顯著降低，而多樣性指數(shù)與正常組和觀察組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明MS發(fā)病過程中伴隨著腸道菌群物種豐富度水平的下降，但是同時伴隨著其他菌群相對豐度異常升高，造成其均勻度相對較高，因此其多樣性指數(shù)變化不明顯。而柴芪湯可以明顯提高其物種豐富度，與前期研究中證實的其對MS代謝異常的改善作用相一致[4]。

LEfSe多級物種差異辨別分析發(fā)現(xiàn)MS大鼠與正常健康大鼠比較，有57個菌屬發(fā)生相對豐度改變，其中35個菌屬相對豐度下降，22個菌屬相對豐度升高。針對其中數(shù)據(jù)庫可明確分類識別的菌屬分析發(fā)現(xiàn)，相對豐度下降在門水平下擬桿菌門（Bacteroidetes）為主，其相對豐度減少是宿主肥胖的重要原因[18]。而在科水平下擬桿菌門中以Muribaculaceae菌科下降最明顯，后者參與宿主復雜碳水化合物（尤其是植物多糖）的代謝，其下降可能與飲食結(jié)構改變密切相關;同時下降明顯的還有瘤胃菌科（Ruminococcaceae）下的Ruminiclostridium、Ruminiclostridium_1、Ruminiclostridium_6、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG_013、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcus_1菌屬，該類菌屬能夠發(fā)酵抗酶解淀粉、膳食纖維和低聚多糖，產(chǎn)生丁酸鹽，后者是短鏈脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFA）的一種，并且有研究證實上述菌屬能夠減緩非酒精性脂肪肝?。∟onalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）的進展，其可能機制為通過其代謝產(chǎn)物丁酸鹽實現(xiàn)，后者具維持腸道屏障功能、維持腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等作用[19-22]。同時豐度下降菌屬中Clostridium_sensu_stricto_1、Intestinimonas、Barnesiella的代謝產(chǎn)物也以SCFA為主[23]。Prevotellaceae_NK3B31_group、Candidatus_Saccharimonas具有抗炎作用，其豐度下降可能會導致炎癥介質(zhì)的過度表達。Odoribacter已被證實其豐度與肥胖妊娠期女性的收縮壓、纖溶酶原激活物抑制劑-1濃度負相關[24]。其余菌屬如Prevotella_1、Alistipes、Rikenellaceae_RC9_gut_group豐度的降低也與NAFLD相關[25]。相對豐度升高的菌屬以毛螺菌科（Lachnospiraceae）為主，有學者發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝患者的糞便中毛螺菌科顯著高于正常人，提示其可能與脂質(zhì)代謝密切相關[26]。同時升高的還有Erysipelotrichaceae菌科，該菌科微生物群成員與代謝紊亂的臨床指標顯著相關，這可能與其釋放的脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）介導的炎癥反應有關[27]。在屬水平下，與炎癥反應相關的Blautia、Enterococcus、Negativibacillus相對豐度升高;代謝產(chǎn)物為三甲胺（Trimetlylamine，TMA）的Phascolarctobacterium、Anaerostipes[28]相對豐度升高，TMA可在肝臟中氧化形成具有促動脈粥樣硬化形成作用的氧化三甲胺（TMAO）;Lachnoclostridium、Streptococcus、Holdemania、Ruminococcus_gauvreauii_group的富集則與脂質(zhì)代謝異常密切相關[29-31]。而柴芪湯能將上述菌屬中的54個菌屬調(diào)回至正常水平，證明其對腸道菌群的重要調(diào)節(jié)作用。

本研究采用16S rRNA高通量測序技術研究了MS大鼠腸道菌群組成結(jié)構的變化及柴芪湯對其的干預作用，在屬水平下鑒定了57個豐度顯著改變的菌屬。研究發(fā)現(xiàn)在飲食誘導的MS發(fā)病過程中，腸道菌群的組成結(jié)構發(fā)生了巨大的變化，主要以與SCFA、LPS、炎癥反應、TMA、脂質(zhì)代謝相關的菌屬變化為主，驗證了腸道菌群在MS及其并發(fā)癥發(fā)病過程中的重要作用。同時研究證明柴芪湯能夠逆轉(zhuǎn)這種菌群結(jié)構異常，驗證了柴芪湯對MS菌群失調(diào)的改善作用，但其調(diào)節(jié)腸道菌群的具體機制及通過菌群糾正MS代謝異常的機制還有待進一步研究。

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（2020-04-02收稿 責任編輯：芮莉莉）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81273695）

作者簡介：彭龍（1992.02—），男，博士，研究方向：中醫(yī)藥防治代謝綜合征，E-mail：772699670@qq.com

通信作者：張立平（1963.11—），女，博士，教授，研究方向：中醫(yī)藥防治代謝綜合征，E-mail：lpzhang2005@126.com