張靜，周倩，唐夢(mèng)君，張小燕，唐修君，陸俊賢，高玉時(shí)，顧榮

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

食品安全是關(guān)系到民生的重大事件，目前由于食源性致病菌引起的疾病在世界各國都引起重視，特別是微生物食物中毒事件[1]。國內(nèi)目前在禽肉食品中常見的食源性致病菌主要有沙門氏菌[2,3]、單增李斯特菌[4-6]、金黃色葡萄球菌[5,7]和空腸彎曲菌[8,9]。由于禽肉產(chǎn)品中的高攜帶率和污染狀況，建立能同時(shí)檢測(cè)上述4種菌快速檢測(cè)與鑒定方法是及時(shí)有效地控制和預(yù)防致病菌傳播的前提。

目前食源性致病菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法與生理生化檢驗(yàn)，以及包括酶聯(lián)免疫法、分子生物學(xué)方法等快速檢測(cè)技術(shù)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無法對(duì)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測(cè)，且耗時(shí)費(fèi)力，獲得結(jié)果通常需要幾天的時(shí)間，不能實(shí)現(xiàn)有效的監(jiān)測(cè)和預(yù)防作用。且單獨(dú)檢測(cè)一種致病菌已無法滿足現(xiàn)今社會(huì)對(duì)致病菌檢測(cè)高效率的要求。多重PCR是在同一反應(yīng)管中同時(shí)完成多種致病菌的高效PCR擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)多種致病菌DNA的同步快速檢測(cè)的技術(shù)。由于多重PCR可降低致病菌檢測(cè)過程中樣本、物資、試劑、工作量等占用的時(shí)間和空間，多重PCR技術(shù)在降低檢測(cè)成本方面顯得非常經(jīng)濟(jì)[10]。高分辨熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting，HRM）是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同熔解曲線的基因分析技術(shù)，通過與實(shí)時(shí)熒光PCR相結(jié)合，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度上升時(shí)雙鏈DNA的解鏈過程。且該技術(shù)達(dá)到了真正的閉管操作，避免傳統(tǒng)熒光操作和凝膠分離步驟，降低交叉污染的可能性及整體分析時(shí)間[11]。HRM技術(shù)以其高特異性、高通量、高靈敏度、低成本、快速等優(yōu)勢(shì)，在臨床診斷及基因分析上得到迅速發(fā)展，已成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)技術(shù)[12-20]，利用HRM技術(shù)能針對(duì)每一種細(xì)菌的固定DNA序列產(chǎn)生精確的Tm值，可將HRM分析技術(shù)應(yīng)用于多種致病菌的檢測(cè)中。因此，本文利用fimY、hly、nuc和orfC為靶基因，建立多重HRM-real time PCR檢測(cè)體系，采用高分辨熔解曲線分析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)4種禽肉中常見的食源性致病菌（沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌），并進(jìn)行了評(píng)價(jià)和初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與樣本

本實(shí)驗(yàn)選取S. EntericaCMCC50041，L.monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. jejuniATCC33560這四株菌株作為目標(biāo)試驗(yàn)菌株（本實(shí)驗(yàn)室自有或購買）。10份不含上述四種菌的空白雞肉樣本已經(jīng)過檢驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑

MeltDoctor TM HRM Master mix，美國Thermo公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；CCDA培養(yǎng)基和MH培養(yǎng)基，英國OXOID公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和脫纖維綿羊血，青島海博生物技術(shù)有限公司；DEPC水，混合氣（5%O2、10% CO2和85% N2），南京特種氣體廠有限公司。

1.1.3 主要儀器

生物安全柜（A2），日本ESCO公司；生化培養(yǎng)箱（HPS-150），太倉市華美生化儀器廠；高壓滅菌鍋（SANYO MLS-3750），日本；三用恒溫水槽（XMTD-204），金壇市文化儀器有限公司；離心機(jī)（XT15R），日本HITACHI；超純水分離系統(tǒng)（Mliili-Q Advantage A10），美國Millipore公司；超低溫冰箱（DW-86L828），海爾；低溫冰柜（BC/BD-318HD），海爾、電子天平（XS105），瑞士METTLER TOLEDO公司；TM-EXB5002S，南京湯姆斯衡器有限公司；移液槍，德國Eppendorf公司；恒溫磁力攪拌器（HJ-3），江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；渦旋混勻器（VTX-3000L），比利時(shí)LMS公司；QuantStudio? 6 Flex全功能定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

廣泛查閱資料，搜索目標(biāo)菌株內(nèi)保守、其他菌株間特異的基因片段，分別選取高度保守區(qū)域fimY、hly、nuc和orfC作為沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌的PCR擴(kuò)增靶基因。在GeneBank上查詢并下載所有靶基因序列，采用DNAStar軟件中的seqman進(jìn)行同源性分析，用生物軟件Primer Express V2.0對(duì)上述保守片段設(shè)計(jì)引物。所有引物對(duì)的可行性經(jīng)由NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，驗(yàn)證引物的保守性。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 用于多重HRM-real time PCR的引物Table 1 The primers of multiplex HRM-real time PCR

1.2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)

取保藏于-80 ℃的甘油保藏菌種，腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌用接種環(huán)蘸取少許菌液劃線接種至營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，復(fù)活菌種后接種環(huán)蘸取少許菌液混入LB營養(yǎng)肉湯中，37℃ 160 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)16 h；空腸彎曲菌用接種環(huán)蘸取少許菌液接種于CCDA平板微需氧條件下42 ℃培養(yǎng)36 h后富集培養(yǎng)于MH血平板。富集培養(yǎng)后的細(xì)菌置于4 ℃冰箱冷藏備用。

多重HRM-real time PCR法對(duì)食品樣本檢測(cè)后的增菌步驟用SSL復(fù)合增菌培養(yǎng)基進(jìn)行增菌。

1.2.3 DNA模板的提取

腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌采用液體LB培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，然后分別取1.5 mL菌液依照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，空腸彎曲菌將MH血平板純化培養(yǎng)的細(xì)菌用無菌棉簽刮下洗入PBS緩沖溶液，離心后去除上層液體。單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌按革蘭氏陽性菌提取，沙門氏菌和空腸彎曲桿菌按革蘭氏陰性菌提取，所提取的DNA模板作為反應(yīng)體系于-20 ℃貯存。

1.2.4 單重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)MeltDoctorTMHRM Master mix，每20 μL的PCR反應(yīng)體系包含10.0 μL MeltDoctor TM HRM Master mix，1.2 μL上游引物（5 μmol/L），1.2 μL下游引物（5 μmol/L），1.0 μL Template（反應(yīng)組以基因組DNA為模板，對(duì)照組的模板為無菌去離子水），其余以無菌去離子水補(bǔ)齊。

單重HRM-real time PCR反應(yīng)程序均為：95 ℃預(yù)變性1 min；以95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，熔解程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，0.025 ℃/s的速率升至95 ℃維持15 s，60 ℃ 15 s。程序設(shè)置：instrument type：QuantStudioTM6 Flex System；block：Fast 96-Well (0.1 mL)；experiment type: High Resolution Melt；reagents：MeltDoctorTMHRM Ragents；properties:Standard。

1.2.5 多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的建立

在單重HRM-real time PCR反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)管中，加入3對(duì)相應(yīng)的目標(biāo)菌的特異性引物對(duì)各0.1 μL，其他成分和PCR反應(yīng)程序與單重HRM-real time PCR反應(yīng)一致，如1.2.4所示。

1.2.6 多重HRM-real time PCR反應(yīng)特異性

在多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，以目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行多重HRM-real time PCR反應(yīng)，檢驗(yàn)所建立體系的特異性。選取大腸桿菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、結(jié)腸彎曲桿菌為非目標(biāo)菌株，以腸炎沙門氏菌、空腸彎曲菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對(duì)照，去離子水為陰性對(duì)照，進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。

1.2.7 多重HRM-real time PCR反應(yīng)靈敏度

選取S. EntericaCMCC50041、L. monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. jejuniATCC33560四種菌株作為HRM-real time PCR反應(yīng)體系敏感性試驗(yàn)的模板DNA來源。將四種菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。使用國標(biāo)法測(cè)定菌液濃度，取菌液濃度為108拷貝數(shù)/mL的菌液，用生理鹽水按十倍梯度遞增稀釋，制備濃度分別為108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL 8個(gè)濃度梯度的菌懸液。每個(gè)稀釋度分別取1.5 mL依照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.2.7.1 多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系檢測(cè)單一致病菌菌液的靈敏度

分別將四種目標(biāo)檢測(cè)菌108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL濃度菌液的基因組DNA作為檢測(cè)模板，進(jìn)行多重HRM-real time PCR反應(yīng)，從而驗(yàn)證該多重體系對(duì)單一目標(biāo)菌的檢測(cè)靈敏度。每個(gè)濃度制備至少3個(gè)重復(fù)樣本，只有所有3個(gè)重復(fù)樣本都被檢測(cè)為陽性的時(shí)候該樣本才能被判定為陽性。

1.2.7.2 多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系檢測(cè)多種致病菌菌液的靈敏度

將108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL的四種目標(biāo)菌菌懸液中同濃度的混合，進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，制備腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌四聯(lián)DNA模板，進(jìn)行多重HRM-real time PCR反應(yīng)。每個(gè)濃度制備至少3個(gè)重復(fù)樣本，只有所有3個(gè)重復(fù)樣本都被檢測(cè)為陽性的時(shí)候該樣本才能被判定為陽性。

1.2.8 多重HRM-real time PCR反應(yīng)重復(fù)性

對(duì)多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性考察包括試驗(yàn)間穩(wěn)定性和試驗(yàn)內(nèi)穩(wěn)定性。以敏感性試驗(yàn)中的S. EntericaCMCC50041，L. monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. JejuniATCC33560基因組DNA為檢測(cè)樣本，選取108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL 6個(gè)10*濃度梯度，每個(gè)濃度一式三份。同一樣本在同一試驗(yàn)中擴(kuò)增3次，用以評(píng)估該體系的批內(nèi)重復(fù)性，同一樣本分開3次不同時(shí)間進(jìn)行3次試驗(yàn)，以評(píng)估該體系的批間重復(fù)性。收集并計(jì)算每個(gè)稀釋度下檢測(cè)得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值得平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV值=standard deviation）。

1.2.9 人工染菌樣本的應(yīng)用

分別取 37 ℃過夜培養(yǎng)的S. EntericaCMCC50041，L. monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. jejuniATCC33560菌懸液各1 mL，用生理鹽水按10-1~10-6梯度進(jìn)行10倍稀釋，制備濃度梯度菌懸液。然后將每個(gè)濃度的四種菌懸液各1 mL，同時(shí)接種到25 g雞肉樣本中，設(shè)置5 CFU/25 g、10 CFU/25 g和20 CFU/25 g雞肉樣本三種接種濃度。接種后的樣本置于20 ℃存放1 h后，加入200 mL SSL，均質(zhì)10 s[21]。所有樣本經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)后，樣本1000 g離心5 min，并用濾袋（Tekmar，Cincinnati，ohio）過濾除去粗糙的食物殘?jiān)螅迷噭┖刑崛【wDNA，多重HRM-real time PCR體系進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重HRM-real time PCR反應(yīng)建立

單重PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增出了4種致病菌對(duì)應(yīng)的4條特異性高分辨率熔解曲線和熔點(diǎn)峰，具有典型的擴(kuò)增曲線，CT值在16.2~19.0之間，RSD值在0.28%~0.94%之間。如圖1所示，所對(duì)應(yīng)的沙門氏菌fimY基因的實(shí)際Tm值為82.2±0.019 ℃，單增李斯特菌hly基因的實(shí)際Tm值為78.2±0.022 ℃，金黃色葡萄球菌nuc基因的實(shí)際Tm值75.5±0.036 ℃，空腸彎曲菌orfC基因的實(shí)際Tm值為73.5±0.052 ℃。四種食源性致病菌Tm值之間均相互錯(cuò)開，為多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的建立奠定基礎(chǔ)。與Hoseinpour[22]等建立的檢測(cè)空腸彎曲桿菌的的Tm值為76.72±0.164 ℃相比，誤差更小。

圖1 四種菌單重HRM-real time PCR熔解曲線圖Fig.1 Four melt curve of HRM-real time PCR

2.2 多重HRM-real time PCR反應(yīng)建立

通過單重HRM-real time PCR反應(yīng)可知，4種目標(biāo)致病菌在退火溫度為60 ℃和熔解速率0.025 ℃/s時(shí)均能夠獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果，故選60 ℃和熔解速率0.025 ℃/s作為多重反應(yīng)程序的退火溫度和熔解速率。但若直接將單重體系中的模板及引物對(duì)簡(jiǎn)單的混合進(jìn)行多重HRM-real time PCR反應(yīng)，則擴(kuò)增效果不是很理想，熔解曲線峰不明顯，因此需要對(duì)多重反應(yīng)體系組分進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)并初步優(yōu)化。經(jīng)對(duì)不同模板濃度（1.0×108拷貝數(shù)/mL、1.0×109拷貝數(shù)/mL）和引物濃度（10 μmol/L、5 μmol/L）的選擇，按照低濃度優(yōu)先原則，建立了可擴(kuò)增出4個(gè)不同Tm值高分辨熔解曲線峰的多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系，熔解曲線如圖2所示。

圖2 多重HRM-real time PCR熔解曲線圖Fig.2 Melt curve of multiplex HRM-real time PCR

2.3 多重HRM-real time PCR反應(yīng)特異性

多重PCR反應(yīng)體系特異性檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有目標(biāo)菌均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，而其他非目標(biāo)菌株，均未出現(xiàn)擴(kuò)增。表明多重PCR反應(yīng)體系具有良好的特異性。

2.4 多重HRM-real time PCR反應(yīng)靈敏度

多重HRM-real time PCR反應(yīng)靈敏度結(jié)果見表2。表2表明，隨著稀釋梯度的不斷增加，即菌濃度的不斷減少，其對(duì)應(yīng)Ct值增大，各食源性致病菌Tm值保持穩(wěn)定，直至稀釋至102拷貝數(shù)/mL時(shí)達(dá)到檢出限，其平均Ct值為16.2~30.8之間，標(biāo)準(zhǔn)差在0.05~0.58之間。結(jié)合平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌的檢測(cè)靈敏度分別為102拷貝數(shù)/mL，結(jié)果表明上述多重HRM-real time PCR體系對(duì)上述4種單一食源性致病菌的檢測(cè)均具有良好的靈敏度。

表2 多重HRM-real time PCR反應(yīng)檢測(cè)單一致病菌的靈敏度Table 2 Sensitivity of multiplex HRM-real time PCR in simple bacterium

表3 是反應(yīng)體系同時(shí)檢測(cè)四種食源性致病菌結(jié)果，隨著稀釋梯度的不斷增加，即菌濃度的不斷減少，其Ct值對(duì)應(yīng)增大，4種食源性致病菌Tm值保持穩(wěn)定且都能檢出，直至稀釋至102拷貝數(shù)/mL時(shí)達(dá)到檢出限，其平均Ct值為14.4~30.3之間，標(biāo)準(zhǔn)差為0.17~0.96之間。對(duì)比兩個(gè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Ct值無顯著差異，表明多種菌混合并不會(huì)降低HRM-realtime PCR反應(yīng)的靈敏度，反應(yīng)體系穩(wěn)定性良好。對(duì)比類似體系，該多重檢測(cè)體系達(dá)到的靈敏度高于Forghani[23]等運(yùn)用該方法所建立的檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌、李斯特菌（3.7×103CFU/mL），周千渝[24]等利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速檢測(cè)并鑒定從鮮食蔬菜中分離到的5種食源性致病菌（106~109CFU/mL），楊夢(mèng)婕[25]等利用GeXP多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)沙門菌、大腸埃希菌0157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀菌和副溶血性弧菌（103CFU/mL）和楊國興[26]等利用多重PCR快速檢測(cè)肉制品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌（103CFU/mL）；與鞠鶴鵬[27]等利用結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和微流控芯片技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌三種食源性致病菌靈敏度接近（100 CFU/mL）。

表3 多重HRM-real time PCR反應(yīng)檢測(cè)多種致病菌的靈敏度Table 3 Sensitivity of multiplex HRM-real time PCR in four bacterium

2.5 多重HRM-real time PCR反應(yīng)重復(fù)性

多重HRM-real time PCR反應(yīng)重復(fù)性結(jié)果見表4。108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL 6個(gè)稀釋濃度的Tm值表明，多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系具有高度的重復(fù)性。Tm值的試驗(yàn)內(nèi)CV值為：沙門氏菌0.03%~0.12%，單增李斯特菌0.03%~0.12%，金黃色葡萄球菌0.06%~0.32%，空腸彎曲菌0.03%~0.21%；試驗(yàn)間CV值為：沙門氏菌0.55%~1.12%，單增李斯特菌0.53%~2.12%，金黃色葡萄球菌0.45%~2.02%，空腸彎曲菌0.66%~2.01%。組內(nèi)和組間Tm值的CV值均較低，提示該體系具有較高的重復(fù)性。

表4 多重HRM-real time PCR體系的重復(fù)性Table 4 Reproducibility of multiplex HRM-real time PCR

2.6 人工染菌樣本的檢測(cè)

陽性對(duì)照中沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌Tm值分別為82.20 ℃、78.24℃、75.45 ℃和73.45 ℃。實(shí)驗(yàn)表明，在Tm值上，5 CFU/25 g、10 CFU/25 g和20 CFU/25 g三種感染濃度下，10份雞肉樣本中四種目標(biāo)菌的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值與直接從目標(biāo)菌株菌液中提取出來的的Tm值對(duì)比，無顯著差異。在靈敏度上，感染樣本在進(jìn)行37 ℃24 h的增菌后，對(duì)沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌，多重HRM-real time PCR法均能達(dá)到5 CFU/25 g的檢測(cè)限，結(jié)果見表5。在人工染菌樣品的檢出限高于Germini A[28]等利用多重PCR檢測(cè)全蛋中大鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157:H7的檢出限（10 CFU/25 g）。

表5 多重HRM-real time PCR體系對(duì)人工感染樣本敏感度Table 5 Tm value of artificaially-inoculated samples in multiplex HRM-real time PCR

3 結(jié)論

綜上所述，相較于胡雙芳[29]等所建立的食源性致病菌檢測(cè)方法，本研究所構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合高分辨熔解曲線方法能在一個(gè)體系中同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌，具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為食品中多種致病菌污染的快速檢測(cè)提供了新的手段，有望發(fā)展為快速同時(shí)檢測(cè)食品中多種致病菌污染的有效手段。