魏立娜,李真玉,張 華,劉易峰

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211;2.天津醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，天津 300070)

隨著人們對微生態(tài)的認(rèn)識加深，不同器官部位微生態(tài)變化與相應(yīng)疾病進(jìn)展的相關(guān)性逐漸得到關(guān)注，許多有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)給臨床工作帶來了寶貴的啟示[1]。呼吸道菌群由共生和病原微生物組成，年齡、病情嚴(yán)重程度、機(jī)體生理功能可影響肺部菌群的負(fù)荷、豐度和多樣性[2]，菌群特點(diǎn)變化在許多肺部疾病發(fā)生、進(jìn)展、急性發(fā)作中起到重要作用[3-4]，但具體機(jī)制尚不明確。研究表明，呼吸道菌群與慢性阻塞性肺疾病(COPD)進(jìn)展、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發(fā)生和住院病死率相關(guān)，微生態(tài)平衡對疾病預(yù)后的作用不可忽視[5]。重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)患者原發(fā)病重、全身情況差、常伴有感染，導(dǎo)致肺部微生物群落改變，后者反過來促進(jìn)病情進(jìn)展和不良預(yù)后發(fā)生[6]。然而，國內(nèi)目前在這一領(lǐng)域少有相關(guān)研究，本文旨在深入探索ICU患者呼吸道菌群與死亡率相關(guān)性，豐富人體微生態(tài)研究，為ICU臨床工作帶來啟示，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2020年4月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院ICU收治的232例患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)因呼吸、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及腫瘤、中毒等引起的器官功能障礙、呼吸衰竭、頑固性心力衰竭等病情危重者；(2)年齡大于18歲；(3)ICU住院時(shí)間大于3 d至小于28 d；(4)因肺部感染、肺間質(zhì)性疾病、痰液滯留等原因必要或自愿行支氣管肺泡沖洗者；(5)患者或家屬已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有近期活動性大咯血、活動性肺結(jié)核等支氣管肺泡灌洗禁忌證者；(2)妊娠、近期有糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑應(yīng)用史者；(3)預(yù)計(jì)生存時(shí)間小于或等于24 h者；(4)嚴(yán)重創(chuàng)傷者。根據(jù)是否在ICU死亡分為存活組和死亡組。所有患者中男125例，女107例，平均年齡(49.78±17.26)歲；入ICU病因：呼吸系統(tǒng)疾病95例(40.95%)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病31例(13.36%)，心血管系統(tǒng)疾病43例(18.53%)，消化系統(tǒng)疾病24例(10.34%)，其他39例(16.81%)。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1病例采集

排除臨床資料不全和自動出院病例，收集患者入院病歷中相關(guān)資料，包括：年齡、性別、既往史、急性生理功能和慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分、序貫器官衰竭估計(jì)(SOFA)評分、血生化檢查結(jié)果等。所有患者于入ICU第1天行支氣管肺泡沖洗，回收沖洗液以行DNA提取。

1.2.2APACHEⅡ和SOFA評分[7]

根據(jù)患者年齡、血壓、肝腎功能、手術(shù)史等資料進(jìn)行APACHEⅡ評分，評分越高表示全身情況越差。SOFA評分涉及呼吸、凝血、肝臟、神經(jīng)、泌尿、循環(huán)系統(tǒng)，每個(gè)系統(tǒng)0～4分，總分24分，評分越高則器官功能越差。

1.2.3呼吸道菌群標(biāo)本采集與DNA提取

入ICU 24 h內(nèi)應(yīng)用生理鹽水對患者行支氣管肺泡沖洗操作，回收沖洗液，4 ℃保存。將沖洗液于14 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀物用200 μL的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸。應(yīng)用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)和PCR擴(kuò)增試劑盒(加拿大Fermentas公司)抽提懸浮物中DNA，操作依據(jù)說明書。

1.2.4引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

細(xì)菌基因組16S rDNA的V3～V5區(qū)序列由GenBank數(shù)據(jù)庫[8]提供，片段長度550 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。應(yīng)用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性(95 ℃、3 min)，變性(95 ℃、30 s)，退火(56 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、30 s)，行35個(gè)循環(huán)，于4 ℃下保存。

1.2.5測序結(jié)果

行16S rDNA拷貝數(shù)、豐度、多樣性分析，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后由深圳華大基因研究院完成16S rDNA宏基因組測序與定量，在PCR產(chǎn)物中加入樣品標(biāo)簽序列，然后行混合測序，根據(jù)基因表達(dá)標(biāo)簽分類細(xì)菌物種、分析群落豐度、多樣性等。菌落多樣性采用Mothur軟件計(jì)算，應(yīng)用Alpha多樣性分析根據(jù)實(shí)際觀測到的OTU數(shù)目評估，群落豐度觀察指標(biāo)選取chao、sobs、ace指數(shù)，數(shù)值越大則豐度越高；群落多樣性采用simpson和shannon指數(shù)評估，前者數(shù)值越大則多樣性越低，后者反之。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

存活組和死亡組各排除資料不完整或自動出院者7例和2例，最終納入223例。58例(26.01%)于ICU內(nèi)死亡，其中11例直接死因?yàn)楦腥荆溆嗨烙谠l(fā)病進(jìn)展；死亡組APACHEⅡ評分、SOFA評分、急性腎損傷比例均高于存活組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組呼吸道菌群負(fù)荷和多樣性比較

死亡組16S rDNA拷貝數(shù)、simpson指數(shù)高于存活組，chao、sobs、shannon、ace指數(shù)低于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組呼吸道菌群負(fù)荷和多樣性比較

2.3 ICU患者死亡相關(guān)因素logistic回歸分析

APACHEⅡ評分、SOFA評分、16S rDNA拷貝數(shù)為ICU患者死亡危險(xiǎn)因素(P<0.05)；chao指數(shù)、sobs指數(shù)、shannon指數(shù)、ace指數(shù)為保護(hù)因素(P<0.05)，見表3。

表3 ICU患者死亡相關(guān)因素logistic回歸分析

3 討 論

呼吸道擁有復(fù)雜的菌群系統(tǒng)，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)肺部微生態(tài)平衡遭到破壞后，促進(jìn)了肺部疾病和不良結(jié)局的發(fā)生[9-10]。ICU患者作為一個(gè)預(yù)后普遍較差的群體，所具有的病情不穩(wěn)定、生理紊亂嚴(yán)重、致病機(jī)制復(fù)雜等因素嚴(yán)重破壞了人體微生態(tài)平衡，既往研究多集中于腸道菌群，而失衡的肺部菌群環(huán)境推動了ARDS、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、不良預(yù)后的發(fā)生[11-12]，呼吸道微生態(tài)或在促進(jìn)患者死亡中扮演著特殊的角色[13]。因此，本文基于此點(diǎn)，挖掘ICU患者呼吸道菌群與死亡率的相關(guān)性，旨在為干預(yù)患者預(yù)后帶來新的思路。

良好的生理狀態(tài)和器官功能是支撐ICU患者好轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)，本研究中死亡組APACHEⅡ評分和SOFA評分均高于存活組，APACHEⅡ評分和SOFA評分為ICU患者死亡危險(xiǎn)因素。APACHEⅡ評分和SOFA評分可準(zhǔn)確反映患者機(jī)體狀態(tài)和器官功能，與預(yù)后相關(guān)，兩者已被廣泛應(yīng)用于許多疾病和危重病患者的預(yù)后評估中[14-15]。王力鵬等[16]報(bào)道APACHEⅡ和SOFA評分與急診重癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可有效預(yù)測預(yù)后，支持了本研究結(jié)論。

本研究對比ICU內(nèi)死亡患者和存活患者的呼吸道菌群負(fù)荷，觀察到死亡組16S rDNA拷貝數(shù)高于存活組，16S rDNA拷貝數(shù)為ICU患者死亡危險(xiǎn)因素。ICU患者在身體機(jī)能欠佳、生理狀態(tài)改變、感染風(fēng)險(xiǎn)高的基礎(chǔ)上長時(shí)間接觸大量病原體，這些都可能是呼吸道細(xì)菌數(shù)量增多的原因，不論是哪一者都將影響患者預(yù)后。DICKSON等[17]報(bào)道在膿毒癥、ARDS、重癥疾病狀態(tài)下，肺部菌群負(fù)荷增多、群落組成改變，其中最突出的變化是肺內(nèi)腸桿菌科成為優(yōu)勢菌群，而本研究未對ICU患者呼吸道菌群成分進(jìn)行分析、未明確呼吸道菌群負(fù)荷增多原因，有待完善。

肺部微生態(tài)的穩(wěn)定主要取決于菌群的組成、豐度和多樣性，本文中死亡組simpson指數(shù)高于存活組，chao、sobs、shannon、ace指數(shù)均低于存活組；chao指數(shù)、sobs指數(shù)、shannon指數(shù)、ace指數(shù)為ICU內(nèi)死亡的保護(hù)因素。死亡組入ICU 24 h內(nèi)菌群豐度和多樣性較低，可能是由致病菌繁殖和共生菌減少引起，并與預(yù)后相關(guān)。BUDDEN等[18]報(bào)道發(fā)生肺炎、肺囊性纖維化、ARDS等疾病時(shí)，患者呼吸道優(yōu)勢菌群和菌群多樣性發(fā)生改變，這種改變與感染、病情進(jìn)展可能存在相互作用的關(guān)系。另有研究表明肺部菌群負(fù)荷、組成成分、多樣性與ICU患者未使用呼吸機(jī)時(shí)間相關(guān)，肺內(nèi)腸桿菌的富集與患者發(fā)生ARDS有關(guān)，肺部菌群負(fù)荷、組成成分、多樣性可預(yù)測ICU患者預(yù)后[19]。這些結(jié)論均給本研究提供了一定理論支持。本文通過細(xì)菌載量、豐度、多樣性證實(shí)ICU死亡患者肺部菌群變化，升高的細(xì)菌載量和降低的多樣性反映了菌群組成變動，可能伴隨著優(yōu)勢菌群的改變，但本文未探索患者肺部菌群組成，此乃不足之處。同時(shí)本研究論證了危重病患者肺內(nèi)菌群狀態(tài)與預(yù)后相關(guān)，關(guān)于人體微生態(tài)的研究往往集中于腸道菌群，下呼吸道菌群由于采樣困難常被忽視，但越來越多的證據(jù)指出肺部微生態(tài)平衡可能是改善許多疾病患者預(yù)后的重要途徑[20]。然而，呼吸道菌群在ICU患者發(fā)病、進(jìn)展、死亡過程中的具體機(jī)制尚未明確，可能是通過推動感染和ARDS發(fā)生加重器官功能負(fù)擔(dān)，亦或是危重病情與肺部菌群相互作用的結(jié)果，需更多研究加以證實(shí)。

綜上所述，呼吸道微生態(tài)平衡和ICU患者病死率相關(guān)，深入對肺部菌群變化的探索，有助于為危重病患者提供更多改善方案。