桑昆昆,劉曉鳳,熊智強(qiáng),張匯,王光強(qiáng),宋馨,艾連中,夏永軍

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海食品微生物工程技術(shù)研究中心,上海,200093)

透明質(zhì)酸由D-葡萄糖醛酸(aldehydo-D-glucuronic acid，GlcUA)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)的雙糖重復(fù)序列組成,β-1,3和β-1,4糖苷鍵交替連接[1]。透明質(zhì)酸在自然界分布廣泛,主要存在于人體臍帶、皮膚等位置,主要用于保持體內(nèi)水分,保護(hù)關(guān)節(jié)滑順[2]；動(dòng)物體內(nèi)主要存在于眼玻璃體和各組織細(xì)胞中；在某些鏈球菌屬細(xì)胞莢膜中大量存在,保護(hù)細(xì)胞免受氧氣的侵害,這也是目前大量獲得透明質(zhì)酸的主要途徑。傳統(tǒng)工藝中,透明質(zhì)酸是從雞冠、人臍帶、牛眼玻璃體中提取或者化學(xué)合成得到[3],但提取率低,工藝復(fù)雜,成本高,目前透明質(zhì)酸的生產(chǎn)主要通過(guò)微生物發(fā)酵。透明質(zhì)酸的生物學(xué)功能和特異性應(yīng)用取決于其分子質(zhì)量,高分子透明質(zhì)酸(分子質(zhì)量范圍1.8 M～2.2 MDa)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,常用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-7]；中分子透明質(zhì)酸(分子質(zhì)量范圍1.0 M～1.8 MDa)可保持關(guān)節(jié)潤(rùn)滑,長(zhǎng)久保濕,在骨關(guān)節(jié)炎治療中有顯著療效[8]；小分子透明質(zhì)酸(分子質(zhì)量范圍400 k～1.0 MDa)能滲入真皮,擴(kuò)張毛細(xì)血管,主要用于化妝品領(lǐng)域[9]。目前,透明質(zhì)酸產(chǎn)量不論在發(fā)酵水平還是分子水平都已達(dá)到瓶頸,僅僅提升產(chǎn)量不利于透明質(zhì)酸的推廣應(yīng)用,因此為擴(kuò)大透明質(zhì)酸的應(yīng)用范圍以及制備更好的生物醫(yī)學(xué)、保健產(chǎn)品,對(duì)于調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量大小的研究非常重要,這也是近年來(lái)學(xué)者們的研究重點(diǎn)。

本文分別在發(fā)酵水平和分子層面上對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量的研究進(jìn)行總結(jié),同時(shí)對(duì)分子生物技術(shù)、代謝工程在生產(chǎn)特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸方面的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行展望,旨在對(duì)未來(lái)提高透明質(zhì)酸分子質(zhì)量與開(kāi)發(fā)特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的研究方法提供參考。

1 發(fā)酵水平調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量

隨著發(fā)酵技術(shù)、設(shè)備的進(jìn)步成熟,發(fā)酵工程在生產(chǎn)多糖類物質(zhì)中的地位越來(lái)越高。透明質(zhì)酸發(fā)酵中主要通過(guò)控制以下幾方面來(lái)調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量。

1.1 通過(guò)pH調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量

研究表明,鏈球菌在37 ℃,pH為7.0下透明質(zhì)酸產(chǎn)量最高,在30 ℃,pH為8.0時(shí)則產(chǎn)生分子質(zhì)量較高的透明質(zhì)酸[10-11]。李志敏[12]在發(fā)酵前10 h采用弱堿性和低溫條件來(lái)提高透明質(zhì)酸分子質(zhì)量,之后將pH和溫度調(diào)為7.0和37 ℃,將發(fā)酵過(guò)程分階段調(diào)控,透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量分別達(dá)到4.55 g/L和2.2 MDa。汪偉等[13]采用2種pH調(diào)控模式(分段調(diào)控和周期調(diào)控),分段調(diào)控即在前6 h將發(fā)酵液pH控制為7.0,之后調(diào)為8.0直至發(fā)酵結(jié)束；周期調(diào)控即在發(fā)酵前6 h將pH控制為7.0,在6～7 h控制為8.0,8～9 h控制為7.0,如此循環(huán)直至發(fā)酵結(jié)束。其中分段調(diào)控pH下透明質(zhì)酸分子質(zhì)量比對(duì)照組提高了10.6%,且透明質(zhì)酸分子質(zhì)量的分布發(fā)生改變,在高分子質(zhì)量范圍內(nèi)的透明質(zhì)酸含量顯著增加。其分子質(zhì)量的改變可能是因?yàn)樗釅A環(huán)境的脅迫作用導(dǎo)致細(xì)胞的產(chǎn)能途徑和葡萄糖流量分布發(fā)生變化,有利于透明質(zhì)酸鏈長(zhǎng)的延伸；pH調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量的機(jī)制還不清晰,對(duì)其進(jìn)行深入探究將對(duì)未來(lái)在發(fā)酵水平上精準(zhǔn)化調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1.2 通過(guò)溶氧調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量

鏈球菌是一種兼性厭氧菌,莢膜中含有透明質(zhì)酸用來(lái)防止氧氣對(duì)細(xì)胞的毒害。但是透明質(zhì)酸作為一種黏多糖,分泌在發(fā)酵液中會(huì)顯著降低發(fā)酵液溶氧水平,同時(shí)還會(huì)阻止細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸,阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)。WANG等[14]在重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵體系中加入重組水蛭透明質(zhì)酸酶發(fā)現(xiàn),透明質(zhì)酸酶的加入有利于透明質(zhì)酸的脫落,提高了溶氧水平,同時(shí)增加了細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸空間,成功將透明質(zhì)酸產(chǎn)量提升至74.1 g/L,并且通過(guò)控制添加水蛭透明質(zhì)酸酶的濃度來(lái)有效控制透明質(zhì)酸分子質(zhì)量。劉龍[15]在發(fā)酵8和12 h時(shí)加入透明質(zhì)酸酶和過(guò)氧化氫來(lái)降解透明質(zhì)酸,其分子質(zhì)量降至20 kDa左右,產(chǎn)量提高20%,且發(fā)酵液黏度顯著降低,溶氧水平明顯提升。在發(fā)酵液中加入上述2種物質(zhì),通過(guò)控制其濃度能夠通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)特定范圍分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸,這是首次提出利用發(fā)酵法獲得較低分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的報(bào)道。

1.3 通過(guò)培養(yǎng)基組成與比例調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量

組成鏈球菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基一般包括葡萄糖、蔗糖、酵母粉、蛋白胨和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。JAGANNATH等[16]研究表明,培養(yǎng)基組分中氮源濃度過(guò)高或者通過(guò)流加氨水方式補(bǔ)加氮源均不利于Streptococcuszooepidemicus合成高分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸,而低濃度的復(fù)合氮源可以防止菌體快速生長(zhǎng),減小與透明質(zhì)酸合成的競(jìng)爭(zhēng),提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子質(zhì)量。DON等[17]通過(guò)建立非結(jié)構(gòu)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)了鏈球菌耐受葡萄糖的最高質(zhì)量濃度為40 g/L。李志敏[12]發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖供給水平和方式對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量大小有重要作用。吳祥坤等[18]采用分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行發(fā)酵,當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)透明質(zhì)酸產(chǎn)量為5.94 g/L,分子質(zhì)量達(dá)到1.68×106Da；采用補(bǔ)料發(fā)酵模式時(shí),葡萄糖總質(zhì)量濃度為80 g/L,用初始葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L,在發(fā)酵6 h時(shí)一次性將剩余的40 g/L葡萄糖補(bǔ)加到發(fā)酵罐中的方式,透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高28.5%,平均分子質(zhì)量為1.56×106Da。

前體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中均含有尿嘧啶核苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP),UDP參與了透明質(zhì)酸的合成,在發(fā)酵液中加入少量尿嘧啶既能保證細(xì)胞正常代謝又能提高合成透明質(zhì)酸的2種前體濃度,進(jìn)而提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量[19]。ARMSTRONG等[20]以谷氨酰胺為氮源在培養(yǎng)基中去除幾種常見(jiàn)氨基酸的合成途徑,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比下降60%,透明質(zhì)酸產(chǎn)量降低50%左右,同時(shí)確定11種氨基酸是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的,通過(guò)外源添加氨基酸等可以提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量。

1.4 通過(guò)細(xì)胞膜通透性調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量

研究表明[21],透明質(zhì)酸的合成只需要透明質(zhì)酸合成酶(hyaluronic acid synthase,HAS)的參與,HAS的催化功能主要依賴其特殊的跨膜結(jié)構(gòu),最新研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸合成酶結(jié)構(gòu)中存在7個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域,如圖1。這7個(gè)結(jié)構(gòu)域圍繞構(gòu)成一個(gè)跨膜蛋白孔隙。PUMMILL等[22]通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)研究脊椎動(dòng)物HAS的各種突變體,不僅發(fā)現(xiàn)了多種單一突變體導(dǎo)致透明質(zhì)酸分子質(zhì)量變大或變小,而且還發(fā)現(xiàn)了一種特定的氨基酸,可以通過(guò)突變產(chǎn)生分子質(zhì)量大小不一的透明質(zhì)酸。他們推測(cè)氨基酸的突變導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,而這些變化就與蛋白孔隙有關(guān)。WEIGEL等[23]認(rèn)為透明質(zhì)酸的跨膜運(yùn)輸分泌可能是由HAS孔隙與細(xì)胞膜上的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)共同完成的；MEDINA等[24]將純化的SeHAS添加到預(yù)載熒光染料的脂質(zhì)體中模擬體外跨膜運(yùn)輸,證明HAS內(nèi)存在一個(gè)蛋白孔隙且通過(guò)自身將透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外。

UDP- ：UDP-GlcNAc；UDP- ：UDP-GlcUA；透明質(zhì)酸合成酶的7個(gè)結(jié)構(gòu)域：1：UDP-GlcNAc結(jié)合部位；2：UDP-GlcUA結(jié)合部位；3：透明質(zhì)酸-GlcUA-UDP供給部位；4：透明質(zhì)酸-GlcNAc-UDP供給部位；5：UDP-GIcUA糖基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)；6：UDP-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)；7：透明質(zhì)酸跨膜位點(diǎn)圖1 透明質(zhì)酸在細(xì)胞膜上的合成與分泌Fig.1 Synthesis and secretion of hyaluronic acid on cell membrane

透明質(zhì)酸的跨膜機(jī)制并不清晰,對(duì)機(jī)制的研究集中在細(xì)胞膜微環(huán)境對(duì)HAS活性的影響以及HAS在跨膜過(guò)程中細(xì)胞基質(zhì)的改變,研究其機(jī)制對(duì)未來(lái)控制透明質(zhì)酸分子質(zhì)量有重大意義。

溫琦等[25]在發(fā)酵液中加入表面活性劑來(lái)探究對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響,發(fā)酵12 h加入20 mg/mL的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB),透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高20%,CTAB的加入改變了細(xì)胞外基質(zhì),有利于透明質(zhì)酸莢膜的脫落,但CTAB的毒性使得透明質(zhì)酸分子質(zhì)量略有下降。李志敏[12]在發(fā)酵8 h添加磷脂酰膽堿,使透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量分別達(dá)到5.61 g/L和2.54 MDa,基本實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)量與高分子質(zhì)量的統(tǒng)一。

隨著發(fā)酵技術(shù)的逐漸發(fā)展,發(fā)酵工程在透明質(zhì)酸發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越大,主要體現(xiàn)在操作簡(jiǎn)單,便于控制,易于實(shí)現(xiàn)等方面。而且在發(fā)酵水平上對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量進(jìn)行調(diào)控的手段較多,比如氮源種類、其他生長(zhǎng)因子以及與其他學(xué)科的交叉應(yīng)用等。但在發(fā)酵水平上對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量控制精確度較差,只能得到分子質(zhì)量較低的透明質(zhì)酸,對(duì)于高分子質(zhì)量以及特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的生產(chǎn)還不成熟,并且控制透明質(zhì)酸分子質(zhì)量不論是成本還是原材料上消耗比較大,是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題[26-27]。盡管發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件已經(jīng)基本確定,但是不同條件以及不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)量以及分子質(zhì)量影響的具體機(jī)制并不清晰,因此在分子、代謝水平上對(duì)透明質(zhì)酸合成相關(guān)基因和代謝途徑進(jìn)行調(diào)控能夠分析其機(jī)制且對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化調(diào)控。

2 分子水平調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量

近年來(lái),隨著大量關(guān)于微生物多糖生物合成代謝途徑和相關(guān)基因的深入了解,對(duì)優(yōu)良菌株進(jìn)行基因改造成為一條降低成本、增加菌株安全性、提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量和控制分子質(zhì)量的切實(shí)可行途徑。合成透明質(zhì)酸的2個(gè)前體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc在HAS的作用下合成透明質(zhì)酸,其在獸疫鏈球菌中的合成途徑如圖2所示。其中的基因包括編碼HAS的hasA、UDP-葡萄糖脫氫酶(UGDH)編碼基因hasB/ugd、葡萄糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶的編碼基因hasC/galU、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶的編碼基因hasD/glmU以及編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的hasE/pgi[28],如圖3所示。

1-己糖激酶；2-葡萄糖磷酸變位酶；3-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；4-UDP-葡萄糖脫氫酶；5-磷酸葡糖異構(gòu)酶；6-氨基轉(zhuǎn)移酶；7-變位酶；8-乙酰轉(zhuǎn)移酶；9-焦磷酸化酶；10-透明質(zhì)酸合成酶；11-透明質(zhì)酸酶；12-乳酸脫氫酶；13-乙酸激酶圖2 獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸代謝合成途徑Fig.2 Hyaluronic acid anabolic pathway in S.epizooides

圖3 獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成基因簇Fig.3 The hyaluronic acid synthesis gene cluster of S.epizoides

2.1 調(diào)控透明質(zhì)酸合成前體濃度

2種前體的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)刺激HAS的合成,對(duì)其聚合速率影響較大,因此可能存在兩底物之間的最佳比例使透明質(zhì)酸分子質(zhì)量達(dá)到最大。HMAR等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)2種前體的濃度比例接近1時(shí),產(chǎn)生較高分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸；當(dāng)該比例遠(yuǎn)大于或遠(yuǎn)小于1時(shí),產(chǎn)生較低分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸。由于鏈球菌是條件致病菌,目前在分子水平上調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量的方法大多通過(guò)異源表達(dá)透明質(zhì)酸來(lái)降低致病風(fēng)險(xiǎn),目前研究較多的宿主細(xì)胞有枯草芽孢桿菌[30]、乳酸乳球菌[31]、大腸桿菌[32]、谷氨酸棒狀桿菌[33]等。PRASAD等[31]將獸疫鏈球菌中合成透明質(zhì)酸的基因?qū)肴樗崛榍蚓袝r(shí),發(fā)現(xiàn)將szhasA、szhasB、szhasC同時(shí)導(dǎo)入乳酸乳球菌中,透明質(zhì)酸產(chǎn)量比只導(dǎo)入szhasA、szhasB的重組菌株提高了119%?？梢?jiàn)2種前體的濃度與比例是提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。CHEN等[34]通過(guò)對(duì)不同透明質(zhì)酸合成基因的過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)前體UDP-GlcNAc的濃度是透明質(zhì)酸分子質(zhì)量大小的關(guān)鍵限制因子,并指出UDP-GlcUA與UDP-GlcNAc的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系一方面是對(duì)HAS上結(jié)合位點(diǎn)的親和力不同,UDP-GlcNAc親和力較差；另一方面是對(duì)UDP的競(jìng)爭(zhēng)。進(jìn)一步將與透明質(zhì)酸合成的相關(guān)基因過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因hasE顯著提高透明質(zhì)酸分子質(zhì)量,因?yàn)榱姿崞咸烟钱悩?gòu)酶濃度的提高使更多的葡萄糖6-磷酸流向果糖6-磷酸,產(chǎn)生更多的UDP-GlcNAc。由此提出3種策略增加UDP-GlcNAc：1)降低磷酸果糖激酶活性;2)其他酶基因在UDP-GlcNAc通路(如GlmS或GlmM)的過(guò)表達(dá);3)在發(fā)酵液中加入葡萄糖胺。JIA等[35]通過(guò)構(gòu)建2個(gè)人工操縱子分別將多殺性巴斯德菌hasA基因置于可誘導(dǎo)木糖啟動(dòng)子控制下和將透明質(zhì)酸合成前體基因置于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子IPTG下,通過(guò)誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)控制基因表達(dá)水平,控制透明質(zhì)酸分子質(zhì)量。然后通過(guò)兩階段誘導(dǎo)策略成功構(gòu)建出高產(chǎn)高分子質(zhì)量的菌株,產(chǎn)量達(dá)6.8 g/L,分子質(zhì)量為4.5 MDa,分子質(zhì)量可控范圍為8 k～5.4 MDa。通過(guò)對(duì)宿主的UDP-GlcNAc/UDP-GlcUA值進(jìn)行定位,或者通過(guò)精細(xì)化表達(dá)、動(dòng)態(tài)監(jiān)控等手段來(lái)調(diào)控兩種前體糖的最佳配比將是一種更精確生產(chǎn)特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的方法。

2.2 透明質(zhì)酸合成途徑的代謝調(diào)控

葡萄糖-1-磷酸、UDP-GlcUA和UDP-GlcNAC同時(shí)用于合成透明質(zhì)酸和細(xì)菌細(xì)胞壁,即細(xì)胞自身生長(zhǎng)與透明質(zhì)酸合成存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。乳酸的大量積累又同時(shí)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和透明質(zhì)酸合成,具體機(jī)制見(jiàn)圖4[36]。通過(guò)抑制或完全去除這些途徑使更多的ATP和葡萄糖中間產(chǎn)物流向透明質(zhì)酸合成途徑進(jìn)而提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量。JIN等[33]在構(gòu)建的枯草芽孢桿菌重組菌中,分別用TTG或GTG替換pfkA(編碼果糖-6-磷酸激酶)的起始密碼子ATG抑制pfkA的表達(dá),使更多的果糖-6-磷酸用來(lái)合成前體UDP-GlcNAc,然后通過(guò)共表達(dá)前體基因,搖瓶水平下,重組枯草芽孢桿菌E168G(GTG)和E168T(TTG)與E168A(ATG)相比,透明質(zhì)酸產(chǎn)量分別增加13%和18%分子質(zhì)量范圍在1.4 M～1.83 MDa。CHENG等[37]通過(guò)敲除zwf(Glc-6-磷酸脫氫酶基因)消除磷酸戊糖途徑同時(shí)弱化FBA(Fuc-1-6二磷酸醛縮酶)的表達(dá)減弱糖酵解途徑,又通過(guò)單交叉同源重組法敲除重組菌株(Corynebacteriumglutamicum)中l(wèi)dh基因(編碼乳酸脫氫酶LDH催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸),在C.glutamicum中經(jīng)過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵模式使透明質(zhì)酸產(chǎn)量增加到28.7 g/L,分子質(zhì)量為0.21 MDa。

圖4 細(xì)胞內(nèi)葡萄糖消耗的分布Fig.4 Glucose consumption distribution in cells

透明質(zhì)酸的合成過(guò)程中伴隨著能量的代謝,需要消耗大量NAD+和ATP,NAD+的生成主要依靠丙酮轉(zhuǎn)化成乳酸,但是乳酸的合成導(dǎo)致發(fā)酵液pH降低阻礙細(xì)胞生長(zhǎng),且1 mol葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸時(shí)只產(chǎn)生2 mol ATP,而產(chǎn)乙酸時(shí)則產(chǎn)4 mol ATP。因此利用近幾年發(fā)展的前沿技術(shù)工具[38-39]精確地調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝物質(zhì)或者基因工程開(kāi)發(fā)出其他代謝途徑或改變細(xì)胞能量代謝途徑使更多的ATP流向透明質(zhì)酸合成通路是提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量的可行途徑。張晉宇[40]克隆Wautersiaeutropha的PHB(聚羥基丁酸)合成基因phbCAB導(dǎo)入獸疫鏈球菌,在phbCAB蛋白催化作用下NADH向NAD+轉(zhuǎn)化為細(xì)胞提供一個(gè)全新的NAD+補(bǔ)給途徑,在發(fā)酵罐水平下乳酸產(chǎn)量從64 g/L降低到41 g/L,透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高了1 g/L左右。

2.3 調(diào)控HAS和透明質(zhì)酸酶

HAS作為將2種前體糖連接起來(lái)的關(guān)鍵物質(zhì)對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量和產(chǎn)量起到重要作用,透明質(zhì)酸分子質(zhì)量也可以說(shuō)是HAS的內(nèi)在參數(shù)。KUMARI等[41]通過(guò)在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HAS中保守半胱氨酸的突變或者其他氨基酸的突變導(dǎo)致透明質(zhì)酸分子質(zhì)量下降,但對(duì)透明質(zhì)酸合成速率以及產(chǎn)量影響較小。而在脊椎動(dòng)物HAS中氨基酸的突變和突變形成的氨基酸則會(huì)控制透明質(zhì)酸分子質(zhì)量大小。WANG[14]將不同物種中的HAS合成基因hasA在枯草芽孢桿菌中單獨(dú)過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)不同物種的HAS合成透明質(zhì)酸的能力不同,對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)HAS的第1個(gè)跨膜螺旋在透明質(zhì)酸調(diào)控中發(fā)揮重要作用。透明質(zhì)酸酶作為一種內(nèi)源性N-乙酰己糖氨基酶通過(guò)消除透明質(zhì)酸單體之間的β-1-4鍵來(lái)降解透明質(zhì)酸使透明質(zhì)酸分子質(zhì)量變小[22,42]。JIN等[43]通過(guò)擴(kuò)增cDNA末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RACE-PCR)鑒定了第1個(gè)水蛭透明質(zhì)酸酶基因,在畢赤酵母中通過(guò)高密度培養(yǎng)等方法水蛭透明質(zhì)酸酶產(chǎn)量達(dá)到8.42×105U/mL,這種酶的應(yīng)用將促進(jìn)特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的大規(guī)模生產(chǎn)。JIN等[43]將獸疫鏈球菌HAS和枯草芽孢桿菌中透明質(zhì)酸合成前體基因在枯草芽孢桿菌工程菌上表達(dá),再將來(lái)自水蛭透明質(zhì)酸酶編碼基因LHyal整合到枯草芽孢桿菌染色體上,對(duì)LHyalN端修飾以高效表達(dá),分別采用不同強(qiáng)度的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列來(lái)調(diào)控透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量,得到范圍為2.20×103～1.42×106Da的特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸,且在3 L發(fā)酵罐中透明質(zhì)酸產(chǎn)量從5.96 g/L提高至19.38 g/L。VALCARCEL等[44]模擬透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶ABC和磷酸降解透明質(zhì)酸的動(dòng)力學(xué)模型,通過(guò)凝膠滲透色譜監(jiān)測(cè)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量,該模型正確的將數(shù)據(jù)再現(xiàn),并得到了特定分子質(zhì)量大小的透明質(zhì)酸。已有學(xué)者通過(guò)提取天然植物中的物質(zhì)來(lái)抑制透明質(zhì)酸酶活性如赤草蘇皂苷、兒萘素、水楊酸鹽、類黃酮[45]等；將這些天然植物提取物加入到發(fā)酵體系中來(lái)抑制細(xì)菌自身的透明質(zhì)酸酶活性,結(jié)合分子手段同時(shí)提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量將是一種新的同時(shí)提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量與分子質(zhì)量的思路。

基因工程、代謝工程等技術(shù)具有對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量精細(xì)化調(diào)控、降低安全風(fēng)險(xiǎn)以及提高效益等優(yōu)勢(shì)在生產(chǎn)開(kāi)發(fā)特定分子質(zhì)量大小透明質(zhì)酸中應(yīng)用越來(lái)越多；但分子技術(shù)手段的難度較大,操作較為復(fù)雜,使其在未來(lái)透明質(zhì)酸的研究中還需深入研究。

3 展望

近年來(lái),隨著發(fā)酵、分子以及其他科學(xué)技術(shù)技術(shù)的進(jìn)步,國(guó)內(nèi)外對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量的調(diào)控研究越來(lái)越深入。高分子質(zhì)量以及特定分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸在生物醫(yī)藥、食品保健等領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌?chǎng)需求。

透明質(zhì)酸分子質(zhì)量的調(diào)控是未來(lái)透明質(zhì)酸研究的熱點(diǎn),發(fā)酵水平上通過(guò)改變細(xì)胞自身產(chǎn)能途徑和細(xì)胞膜的通透性來(lái)控制透明質(zhì)酸分子質(zhì)量；分子水平上依靠基因技術(shù)以及代謝工程技術(shù)來(lái)提高流向透明質(zhì)酸合成通路的各種前體物質(zhì)的通量或者抑制與其競(jìng)爭(zhēng)的通路更加精細(xì)化的調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量。大量研究表明,在發(fā)酵水平和分子水平上對(duì)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量調(diào)控效果顯著,但是細(xì)胞水平上對(duì)透明質(zhì)酸鏈長(zhǎng)延伸的研究還不成熟,如透明質(zhì)酸在延伸到細(xì)胞外時(shí)細(xì)胞膜對(duì)其影響的具體機(jī)制還不清晰；細(xì)胞外基質(zhì)中是否存在一種未知的調(diào)控因子控制透明質(zhì)酸鏈長(zhǎng)以及HAS在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的活性是否受到一些未知的因素影響還需要深入研究,為進(jìn)一步調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

透明質(zhì)酸的合成較為復(fù)雜,與其合成競(jìng)爭(zhēng)的代謝途徑較多且受到多層次和多水平調(diào)控,因此采用最新分子技術(shù)手段如CRISPER/Cas9結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等來(lái)提高、弱化和協(xié)同透明質(zhì)酸合成途徑中間代謝物質(zhì)將是提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量與開(kāi)發(fā)特定分子質(zhì)量的有效手段；通過(guò)在研究較為成熟的基因工程模式菌株中來(lái)異源表達(dá)透明質(zhì)酸將會(huì)更加簡(jiǎn)單、安全、高效的調(diào)控透明質(zhì)酸分子質(zhì)量。同時(shí),利用多組學(xué)技術(shù)解析透明質(zhì)酸在應(yīng)用中發(fā)揮作用的分子機(jī)制來(lái)生產(chǎn)特定分子質(zhì)量透明質(zhì)酸對(duì)未來(lái)透明質(zhì)酸在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有深遠(yuǎn)影響。