李云琴 原曉龍 陳中華 王毅

摘?要：?為研究環(huán)阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase）基因在滇牡丹生物合成中的作用機(jī)制，該文采用RT-PCR技術(shù)首次從滇牡丹（Paeonia delavayi）中克隆得到一個(gè)具完整開放閱讀框的環(huán)阿屯醇合成酶基因（PdCAS），該基因全長(zhǎng)2 274 bp，共編碼757個(gè)氨基酸，PdCAS蛋白序列與桃（Prunus persica）、日本裸櫻（Prunus yedoensis var. nudiflora）、葡萄（Vitis vinifera）蛋白序列相似性在86%以上。序列比對(duì)分析顯示PdCAS具有氧化鯊烯環(huán)化酶超家族典型的DCTAE結(jié)構(gòu)域和三萜合成酶的標(biāo)志性序列DGSWYGSWGVCFTYG。滇牡丹PdCAS蛋白與薔薇科植物蘋果（Malus domestica XP 008391430.1）、白梨（Pyrus bretschneideri XP 009370034.1）、月季（Rosa chinensis XP 024193310.1）、日本裸櫻（Prunus yedoensis var. nudiflora PQQ11009.1）、桃（Prunus persica XP 007225240.1）的CAS蛋白聚為一類。PdCAS基因在滇牡丹各組織中均有表達(dá)，但是在花瓣中表達(dá)量較高。該研究克隆的PdCAS基因與滇牡丹甾醇類化合物的合成密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 滇牡丹， 環(huán)阿屯醇合成酶， cDNA克隆，?基因功能分析

中圖分類號(hào)：?Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

文章編號(hào)：?1000-3142（2021）04-0567-06

Abstract：?To study the effect of cycloartenol synthase gene （CAS） in the sterol biosynthesis of Paeonia delavayi， using the RT-PCR technology， a complete open reading frame of PdCAS gene was cloned from Paeonia delavayi for the first time. The full-length cDNA of PdCAS gene was 2 274 bp， encoded 757 amino acids. The PdCAS protein sequence of P. delavayi had more than 86% similarty with the Prunus persica， Prunus yedoensis var. nudiflora and Vitis vinifera. Sequence alignment analysis showed that PdCAS had a typical conserved DCTAE motif of oxidosaualene cyclase and the marker sequence DGSWYGSWGVCFTYG of triterpenoid synthase. The phylogenetic analysis revealed that PdCAS clustered together with CAS proteins of Malus domestica （XP 008391430.1）， Pyrus bretschneideri （XP 009370034.1）， Rosa chinensis（XP 024193310.1）， Prunus yedoensis var. nudiflora（PQQ11009.1） and Prunus persica （XP 007225240.1）. PdCAS expressed significantly in different tissues and had the highest transcript profile in flowers. PdCAS was closely related to the synthesis of sterols from Paeonia delavayi.

Key words： Paeonia delavayi， cycloartenol synthase（CAS）， cDNA clone， gene function analysis

環(huán)阿屯醇（cycloartenol） 為植物甾醇類化合物，廣泛分布于植物中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)阿屯醇具有明顯的抗炎（Akihisa et al.，2000）、抗氧化（Islam et al.，2009）、抗腫瘤（Prakash et al.，2004）、調(diào)節(jié)膽固醇（Fukuoka et al.，2014）等藥理活性;它還是重要的藥物中間體和先導(dǎo)化合物，是菜油甾醇（campesterol）等植物甾醇及甾體皂苷等化合物生物及半化學(xué)合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)（張忠廉等，2017）。環(huán)阿屯醇的含量高低決定了植物甾醇類化合物的生物合成效率;此外，環(huán)阿屯醇對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著影響（Gas-Pascual et al，2014）。

環(huán)阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，簡(jiǎn)稱 CAS）屬 于 氧 化 鯊 烯 環(huán) 化 酶（oxido squalene cyclase，OSC）家族，該合成酶基因是合成環(huán)阿屯醇和合成植物甾醇及甾體類物質(zhì)的關(guān)鍵調(diào)控基因（張忠廉等，2017;劉夢(mèng)迪等，2019）。目前，已有 20多種植物的CAS基因被分離和克隆出來(lái)，如刺五加（Eleutherococcus senticosus）（邢朝斌等，2012）、丹 參（Salvia miltiorrhiza）（李珍等，2013）和黃芪（Astragalus membranaceus）（Chen et al.，2015）等，有些還通過異源表達(dá)進(jìn)行了功能驗(yàn)證。但是至今未見到關(guān)于滇牡丹（Paeonia delavayi）環(huán)阿屯醇合成酶基因的相關(guān)研究。

滇牡丹（Paeonia delavayi）是芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）植物。芍藥屬植物根皮是一種傳統(tǒng)中藥材，通常稱其為“牡丹皮”或者“丹皮”，所含主要有效成分為酚類（如丹皮酚）、萜類、苷類（如芍藥苷）、鞣質(zhì)等，具有抗凝血、降壓、抗炎、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能。作為芍藥屬的一個(gè)牡丹類群，滇牡丹也被視為一種民族藥材被廣泛使用，其根皮具有抗菌活性， 可用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎及女性疾病的治療（Wu et al.，2002）。

本研究在滇牡丹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，成功克隆得到滇牡丹環(huán)阿屯醇合成酶（CAS）基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究環(huán)阿屯醇合成酶基因在滇牡丹中的功能奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

滇牡丹（Paeonia delavayi）種植于云南省林業(yè)科學(xué)院苗圃基地。采集滇牡丹的根、莖、葉、種子、花蕊、花芽（花完全被花萼包裹）、花蕾（露出花瓣）及花開（花瓣全部展開）、花謝（花瓣開始枯萎）時(shí)期的花瓣，立即用液氮冷凍保存。

1.2 RNA提取與cDNA合成

先用植物總RNA 提取試劑盒提取滇牡丹根、莖、葉、種子及各發(fā)育期花的總RNA;然后再用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳完成RNA質(zhì)量檢測(cè)，用NanoDropTM 2000檢測(cè)RNA濃度;再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 PdCAS基因的克隆

采用仙客來(lái)（Cyclamen persicum）的CAS基因?yàn)槟０?，BLAST搜索滇牡丹花瓣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到滇牡丹的環(huán)阿屯醇合成酶基因（PdCAS）的cDNA序列，以該序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異引物（PdCAS1F： 5′-ATGTGGAAGCTGAAGATCGC-3′和PdCAS1R： 5′-TCAGGAGACTTGCAATACCC-3′）。用滇牡丹花瓣cDNA為模板，PdCAS1F和PdCAS1R為引物，以EasyPfu DNA聚合酶擴(kuò)增得到PdCAS全基因片段。經(jīng)過電泳檢測(cè)后將目的片段連接到pGMT載體上，經(jīng)PCR檢測(cè)，送往上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.4 PdCAS基因蛋白序列分析

先獲得滇牡丹PdCAS基因cDNA序列，利用NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上的ORF Finder （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 分析獲得其蛋白氨基酸序列，并用ProParam預(yù)測(cè)其蛋白的理化性質(zhì);然后通過NCBI對(duì)環(huán)阿屯醇合成酶PdCAS基因的蛋白氨基酸序列進(jìn)行搜索，選擇與PdCAS蛋白序列同源性較高的植物環(huán)阿屯醇合成酶蛋白序列;再用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 PdCAS基因在不同器官上的表達(dá)分析

用植物總RNA 提取試劑盒提取滇牡丹各器官、各發(fā)育時(shí)期的花和不同顏色花瓣的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM 2000 分別測(cè)定RNA 的質(zhì)量和濃度后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 的第一條鏈。以特異引物TPdCAS F （5′-TTGAGAGAGAAGGCTCTTCG-3′）和TPdCAS R（5′-TCGATGAACATAGCAGCTCT-3′）檢測(cè)滇牡丹PdCAS基因在根、莖、葉、花瓣等不同器官中的表達(dá)情況。經(jīng)過瓊脂凝膠電泳的檢測(cè)后，利用GENE-SNAPS圖像分析軟件分析PdCAS基因積分吸光度，進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1 RNA提取和PdCAS基因克隆

參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取滇牡丹花瓣及其他器官的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈，保存?zhèn)溆谩Ｒ院衅鹗济艽a子的PdCAS1F和終止密碼子的PdCAS1R作為引物，滇牡丹花瓣cDNA為模板，用EasyPfuDNA聚合酶擴(kuò)增獲得cDNA片段，電泳檢測(cè)后，將獲得目的片段連接到克隆載體上，28 ℃條件下培養(yǎng)過夜，并轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，菌落PCR檢測(cè)后送華大基因測(cè)序公司測(cè)序。最終獲得全長(zhǎng)2 274 bp的滇牡丹CAS基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA，并命名為PdCAS，共編碼757個(gè)蛋白氨基酸（圖1）。

2.2 滇牡丹PdCAS基因蛋白序列分析

用在線程序ORF Finder預(yù)測(cè)PdCAS基因的開放閱讀框，ProParam預(yù)測(cè)PdCAS基因的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示：該蛋白由757個(gè)氨基酸組成，其分子量為86 117.2 Da，等電點(diǎn)為6.12。用推斷得到的757個(gè)氨基酸序列與已知的其他植物CAS蛋白序列進(jìn)行相似性對(duì)比發(fā)現(xiàn)，滇牡丹PdCAS蛋白序列與桃（Prunus persica）CAS蛋白序列相似性為86.66%;與日本裸櫻（Prunus yedoensis var. nudiflora）CAS蛋白序列相似性為86.66%;與葡萄（Vitis vinifera）CAS蛋白序列相似性為86.49%。對(duì)滇牡丹PdCAS蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，PdCAS編碼的蛋白具有1個(gè)氧化鯊烯環(huán)化酶超家族典型的DCTAE結(jié)構(gòu)域（Poraiia et a1.，1994），1個(gè)三萜合成酶的標(biāo)志性序列DGSWYGSWGVCFTYG（邢朝斌等，2012）（圖2）。

為研究滇牡丹在分子水平的進(jìn)化地位和與其他植物種的親緣關(guān)系，將推導(dǎo)出來(lái)的PdCAS蛋白序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行比對(duì)，得到其他植物CAS蛋白序列，用MEGA 6.0中自帶的Cluster W進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)后，用Neighbor-joining算法（自檢舉1 000次），繪制出滇牡丹PdCAS與其他植物的CAS蛋白的進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，滇牡丹PdCAS蛋白與薔薇科植物蘋果（Malus domestica XP 008391430.1）、白梨（Pyrus bretschneideri XP 009370034.1）、月季（Rosa chinensis XP 024193310.1）、日本裸櫻（Prunus yedoensis var. nudiflora PQQ11009.1）、桃（Prunus persica XP 007225240.1 ）的CAS蛋白聚為一類（圖3）。

2.3 滇牡丹PdCAS基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

采集滇牡丹的根、莖、葉、種子、各時(shí)期花瓣等器官，用植物總RNA提取試劑盒說明書提取滇牡丹各時(shí)期花瓣以及各器官的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用特異引物PdCAS1F和PdCAS1R檢測(cè)不同時(shí)期的花瓣、花蕊及根、莖、葉、種子中PdCAS基因表達(dá)的具體情況（圖4）。結(jié)果顯示，PdCAS基因在滇牡丹根、莖、葉、種子、花蕊及各時(shí)期花瓣中都有表達(dá)，但是在各時(shí)期花瓣、花蕊中表達(dá)量較高，其中以花謝時(shí)期的花瓣中表達(dá)量最高。

3?討論與結(jié)論

CAS是引導(dǎo)類異戊二烯代謝途徑流向甾醇類化合物的關(guān)鍵基因（Kim et al.，2005），分析其在各器官中的表達(dá)量變化情況，可了解對(duì)甾醇合成的影響。RT-PCR 結(jié)果表明，PdCAS基因在不同時(shí)期的花、種子、葉、莖和根中都有表達(dá)，這與盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）（涂碧夢(mèng)等，2010）和刺五加（Acanthopanax senticosus）（邢朝斌等，2012）中CAS基因的的表達(dá)特點(diǎn)類似，均具有組成型表達(dá)的特點(diǎn)。PdCAS在滇牡丹根、莖、葉、花、種子中都有表達(dá)，還證明了該基因的表達(dá)存在普遍性。滇牡丹 CAS 在各器官表達(dá)量差異相對(duì)較大，花瓣中表達(dá)量較高，而在根莖中表達(dá)量較低;最大值出現(xiàn)在花謝授粉后1 d的花瓣中，最小值出現(xiàn)在莖中。

本研究中，PdCAS基因表達(dá)量在繁殖器官中最高，雖然在根、莖中表達(dá)量很低，但是也有表達(dá)。PdCAS在根中有表達(dá)說明環(huán)阿屯醇的衍生物在根中存在。Wu et al.（2002）認(rèn)為滇牡丹作為一種藥材，主要是利用其根皮，如果環(huán)阿屯醇及衍生物是丹皮的主要活性成分，那么，花、葉、莖，也可以起到根的藥用效果?；ê腿~雖然表達(dá)量高，但是物質(zhì)累積量并不一定比根高，因?yàn)榛〞?huì)凋謝，樹葉會(huì)掉落，而滇牡丹的根作為存儲(chǔ)器官，經(jīng)過長(zhǎng)年的累積，表達(dá)量雖然低，但是活性物質(zhì)的含量未必少于花瓣。

本研究所克隆的滇牡丹 PdCAS 基因蛋白序列與薔薇科植物如桃、蘋果等的CAS 基因蛋白序列相似性≥80%，結(jié)構(gòu)和蛋白序列上的一致性較高說明PdCAS基因比較保守。邢朝斌等（2012）已經(jīng)在不同植物中分離得到了5 類鯊烯環(huán)化酶，即CAS、β-香樹酯醇合成酶（β-amyrin synthase，β-AS）、達(dá)瑪烷二醇合成酶（dammarenediol synthase）、羊毛甾醇合成酶（lanosterol synthase）和羽扇豆醇合成酶（lupeol synthase）。生物體內(nèi)的三萜類物質(zhì)和植物甾醇都源于同一前體物質(zhì)—2，3-氧化鯊烯，且均由異戊二烯途徑合成，2 ， 3-氧化鯊烯在上述5種環(huán)化酶的作用下生成植物甾醇和三萜類骨架。其中 CAS 主要功能是催化環(huán)化合成各種甾醇和類甾醇類化合物（明乾良等，2010），即2， 3-氧化鯊烯在CAS的作用下合成環(huán)阿屯醇， 再經(jīng)過一系列的催化反應(yīng)生成植物甾醇（該途徑被稱為“環(huán)阿屯醇途徑”）（張忠廉等，2017）。本研究中PdCAS的蛋白序列中存在氧化鯊烯環(huán)化酶超家族的特征序列DCTAE， 也說明PdCAS基因?qū)儆邗徬┉h(huán)化酶基因家族。DCTAE可以將鯊烯合酶的 DDTAV 定點(diǎn)突變成 DCTAE，致使鯊烯合酶的底物由鯊烯變成2， 3-氧化鯊烯（Dang&Prestwich， 2000）。因此，PdCAS基因與滇牡丹甾醇類化合物的合成密切相關(guān)。后續(xù)研究將對(duì)PdCAS和與之可能相關(guān)的P450進(jìn)行異源表達(dá)試圖得到新的環(huán)阿屯醇衍生物。

“環(huán)阿屯醇途徑”是甾醇類化合物合成的主要途徑（Gas-Pascual et al.，2014），該途徑及環(huán)阿屯醇對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育影響顯著，但其具體的影響機(jī)制尚未得到深入研究。環(huán)阿屯醇還具多種藥理活性，而具體作用機(jī)制尚未清楚。因此，今后應(yīng)重視對(duì)其藥理活性、生理作用和相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的研究，為更好地研發(fā)和應(yīng)用滇牡丹甾醇類化合物奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯?李?莉）