張馨予 潘開(kāi)素 羅宏 鄭冬燕 鄭艷青 曹存巍 梁綱

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021； 2.廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530022)

馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei,TM)是溫度依賴性的雙相真菌，在東南亞如泰國(guó)、越南以及我國(guó)的廣西、廣東等地區(qū)流行，可引起免疫缺陷患者，特別是艾滋病患者的系統(tǒng)播散性感染[1]。至今為止單一抗真菌藥物治療馬爾尼菲籃狀菌病(TSM)的療效不佳，而兩性霉素B仍是治療的首選藥物，但兩性霉素B在臨床應(yīng)用過(guò)程中極易出現(xiàn)肝腎毒性、頑固性低鉀、骨髓抑制等不良反應(yīng)，導(dǎo)致部分患者因不能耐受而放棄治療[2]。因此，尋找用藥劑量小、不良反應(yīng)少、療效佳、費(fèi)用低的治療方案迫在眉睫[3-4]。隨著對(duì)傳統(tǒng)中藥的深入研究，既往發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)TM酵母相有較強(qiáng)的抑制活性，氟康唑天然耐藥株以及兩性霉素B耐藥株也對(duì)蛇床子素敏感[5]。傳統(tǒng)中藥小檗堿是從黃連、黃柏等植物中提取的生物堿，具有顯著的抗菌療效，用來(lái)治療細(xì)菌性胃腸炎、痢疾等疾病已有很長(zhǎng)的歷史[5-6]。近年來(lái)，小檗堿的其他藥理作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，有研究表明在白念珠菌和隱球菌的治療中，小檗堿無(wú)論是單獨(dú)使用還是與其他抗真菌藥物合用，都有顯著的療效[7-8]。然而，目前尚無(wú)小檗堿單獨(dú)使用或聯(lián)合其他抗真菌藥物治療TSM的研究報(bào)道。在本研究中，我們使用小檗堿聯(lián)合氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈對(duì)21株TM酵母相進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)研究，觀察其作用效果，為小檗堿應(yīng)用于馬爾尼菲籃狀菌病的治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科存儲(chǔ)的21株TM。其中10株分離自臨床患者，編號(hào)為CI-1～10；10株分離自竹鼠，編號(hào)為BrI-1～10。TM標(biāo)準(zhǔn)株為FRR2161(wild type，WT)，由墨爾本大學(xué)Alex Andronopolus教授惠贈(zèng)。藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控株為近平滑念珠菌ATCC 22019，由北京大學(xué)真菌研究中心惠贈(zèng)。

1.2 菌懸液的制備

實(shí)驗(yàn)前所有受試菌均接種在腦心磷脂葡萄糖培養(yǎng)基(BHI)上37℃培養(yǎng)，每7 d傳代 1次，共傳3代，直至95%以上的細(xì)胞為酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞收集方法如前期文獻(xiàn)所述[3]，用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至(1～5)×106cell/mL，再用RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋1 000倍,得到(1～5)×103cell/mL的4倍終濃度的接種菌懸液。

1.3 抗真菌藥物

本研究中使用的藥物包括：氟康唑(FLC)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VOC)，兩性霉素B(AmB)、卡泊芬凈(CAS)和小檗堿(BBR)，均購(gòu)自美國(guó)sigma公司，純粉末制劑。AmB、ITC、VOC和BBR在100%二甲基亞砜(DMSO)中溶解并配成12 800 μg/mL的儲(chǔ)存液。CAS和FLC使用滅菌水溶解配制成16 000 μg/mL的儲(chǔ)存液。實(shí)驗(yàn)前用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將藥物稀釋成4倍終濃度工作液。

1.4 抗真菌藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)頒布的酵母菌抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案M27-A3并稍作修改。藥敏板藥物濃度：FLC為1～128 μg/mL，ITC 和VOC為0.00078～1 μg/mL，AmB為0.0625～8 μg/mL，CAS為0.5～64 μg/mL，BBR為4～512 μg/mL。96孔板的第1～8列為聯(lián)合藥物(每種藥物加入50 μL)，例如小檗堿/氟康唑組合時(shí)，從左到右第一個(gè)孔為最高濃度1 024 μg/mL的BBR 50 μL，第二孔512 μg/mL的50 μL，濃度依次倍比降低，直到第8孔為8 μg/mL的50 μL；同理，從第1排A孔加入FLC 256 μg/mL的50 μL，濃度倍比降低直至F孔為2 μg/mL的50 μL。第9、10列為單藥(每種藥物加入100 μL)，第11列為陰性對(duì)照(加入200 μL RPMI 1640液體)，第12列加入200 μL菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照。37℃下培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，每株實(shí)驗(yàn)菌株均在不同時(shí)間重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取中位數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)均使用近平滑念珠菌ATCC 22019進(jìn)行質(zhì)控。用視覺(jué)法判定終點(diǎn)，與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比≥50%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為FLC、VOC、ITC及CAS的MIC值；BBR和AmB的MIC定義為 100%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度。分?jǐn)?shù)抑制濃度指數(shù)(FICI)用于藥物相互作用的分類，F(xiàn)ICI=MIC(A聯(lián)合)/(A單藥)+ MIC(B聯(lián)合)/(B單藥)。FICI≤0.5表示協(xié)同作用，F(xiàn)ICI>4為拮抗作用，0.5

1.5 時(shí)間-殺傷曲線

參照文獻(xiàn)，用RPMI 1640培養(yǎng)基制備標(biāo)準(zhǔn)株FRR 2161菌懸液濃度105CFU/mL[9]。實(shí)驗(yàn)分為生長(zhǎng)對(duì)照組、小檗堿單用組、氟康唑單用組以及小檗堿與氟康唑聯(lián)用組。同樣伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素 B、卡泊芬凈分別單獨(dú)應(yīng)用或者與小檗堿聯(lián)用，各組總體積均為4 mL。每組加入1 mL菌液和1 mL的藥液，生長(zhǎng)對(duì)照組僅加入1 mL菌液，不足4 mL體系的用RPMI1640 補(bǔ)足，使其終濃度分別對(duì)應(yīng)藥物MIC值的1/4，即BBR 8 μg/ mL、 FLC 0.5 μg/ mL、 ITC和VOC 0.015 μg/ mL、AmB 0.25 μg/ mL、 CAS 4 μg/ mL，總?cè)莘e中DMSO體積<1%。

將菌懸液與藥混勻后，置于37℃搖床孵育，在0 h、12 h、24 h、36 h和48 h時(shí)間點(diǎn)，從每種溶液中取出100 μL混合液，并在無(wú)菌水中稀釋10倍。取100 μL在沙堡弱葡萄糖瓊脂平板上接種，37℃孵育48 h后測(cè)定菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值。24 h后，當(dāng)聯(lián)合用藥組每毫升TM的CFU的對(duì)數(shù)值與任意單用藥物組相比下降大于等于2個(gè)單位，即≥2.0log10CFU/mL，則認(rèn)為兩藥有協(xié)同作用或拮抗作用。若改變<2.0 log10CFU/mL則為無(wú)關(guān)作用[8]。

2 結(jié) 果

對(duì)21株TM的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2、3。藥物單獨(dú)使用時(shí)，BBR對(duì)TM的MIC值在32～64 μg/mL之間，其他藥物單獨(dú)用藥對(duì)TM的MIC值與既往的研究結(jié)果相似[3,4,10]。當(dāng)BBR與其他5種藥物聯(lián)合用藥時(shí)均可以觀察到協(xié)同作用。最強(qiáng)的協(xié)同作用在BBR/VOC、BBR/AmB這兩種組合(兩種組合對(duì)21株菌作用后，均有15株菌表現(xiàn)為協(xié)同作用，協(xié)同作用率為71.43%)，其次是BBR/ITC (66.67%)、BBR/FLC (52.38%)和BBR/CAS(52.38%)。藥物聯(lián)合作用后，MIC值均顯著降低，即FLC由64 μg/mL下降至4 μg/mL(64→4 μg/mL)，同理VOC(0.125→0.015 μg/mL)，ITC (0.125→0.015 μg/mL)，AmB (2→0.25 μg/mL)，CAS (32→2 μg/mL)。另外，在任何聯(lián)合用藥中均未發(fā)現(xiàn)有拮抗現(xiàn)象，F(xiàn)ICI的幾何均數(shù)均較低，最高僅為0.53(BBR/FLC組合)。

時(shí)間-殺菌實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了5種聯(lián)合用藥之間的協(xié)同作用：BBR與FLC聯(lián)用，24 h后每毫升TM的CFU的對(duì)數(shù)值與任意單用藥物組相比下降2.3log10CFU/mL；小檗堿與ITC、VOC、AmB聯(lián)用24 h后均下降了2.0log10CFU/mL(見(jiàn)圖1)。

圖1 小檗堿聯(lián)合氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈對(duì)FRR2161的時(shí)間-殺傷曲線

表1藥物單獨(dú)作用于21株馬爾尼菲籃狀菌酵母相的體外藥敏試驗(yàn) (μg/mL)

Tab.1Susceptibilities of tested drugs alone against 21 isolates of yeast form ofT.marneffei(μg/mL)

GM：幾何均數(shù)。

表2 小檗堿分別與不同藥物聯(lián)合使用對(duì)馬爾尼菲籃狀菌酵母相的體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 小檗堿與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈聯(lián)合對(duì)馬爾尼菲籃狀菌酵母相的體外藥敏試驗(yàn)

(續(xù)表)

3 討 論

已有研究報(bào)道，對(duì)臨床耐藥白念珠菌，小檗堿與氟康唑聯(lián)用后，念珠菌氟康唑耐藥株對(duì)氟康唑的敏感性比單用氟康唑時(shí)明顯增強(qiáng)[11-12]。在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣得到了協(xié)同作用的效果[13]。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，小檗堿和常用抗真菌藥物聯(lián)用，超過(guò)半數(shù)的實(shí)驗(yàn)菌株表現(xiàn)出協(xié)同作用，特別是BBR/AmB、BBR/VOC聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)出了最高的協(xié)同作用率。BBR與抗真菌藥物合用，可降低抗真菌藥物對(duì)TM酵母相的MIC值，而且與BBR聯(lián)用或許能在臨床應(yīng)用中減少抗真菌藥物的劑量又不影響臨床療效。我們的研究提示BBR體外對(duì)馬爾尼菲籃狀菌具有一定的抑制作用，當(dāng)與其他抗真菌藥物聯(lián)合使用時(shí)作用更顯著。BBR在腸道內(nèi)被吸收的特性已被運(yùn)用于胃腸炎、痢疾的治療[14]，值得注意的是馬爾尼菲籃狀菌病的患者當(dāng)消化道被累及時(shí)，約12.5%的患者會(huì)出現(xiàn)腹瀉等消化道癥狀[15-16]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示當(dāng)馬爾尼菲籃狀菌病累及胃腸道時(shí)，BBR聯(lián)合傳統(tǒng)抗真菌藥治療可能有更好的療效，該結(jié)果將為今后中西醫(yī)結(jié)合治療馬爾尼菲籃狀菌病提供理論依據(jù)。