王海濤，李亭亭，黃勛，馬潤林,4，劉秋月

遺傳修飾技術(shù)在綿羊分子設(shè)計育種中的應(yīng)用

王海濤1,2，李亭亭3，黃勛1,2，馬潤林1,2,4，劉秋月1

1. 中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院，北京 100101 2. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，分子發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100101 3. 浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 3113004. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

利用遺傳修飾技術(shù)可以使動物在遺傳水平發(fā)生改變，實現(xiàn)在個體內(nèi)表達外源基因或?qū)ζ鋬?nèi)源基因的功能造成影響。在動物育種中，可以利用遺傳修飾技術(shù)在分子水平進行設(shè)計并實現(xiàn)品種的快速改良。從傳統(tǒng)的遺傳修飾技術(shù)、病毒載體、精子載體等介導(dǎo)的遺傳修飾技術(shù)到新型人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，尤其是CRISPR/Cas9為代表的人工核酸酶的運用使得基因編輯動物的制備變得更加高效快捷，并迅速在多個物種中得到應(yīng)用。這些方法也已經(jīng)拓展到了綿羊()遺傳育種領(lǐng)域。利用遺傳修飾技術(shù)在綿羊中進行分子育種比傳統(tǒng)的育種方式具有更大的優(yōu)勢，可以使用多種策略直接對性狀進行快速改良，并且可以加快育種進程。本文詳細介紹了遺傳修飾技術(shù)在綿羊中的研究歷程，探討了通過遺傳修飾技術(shù)進行綿羊分子設(shè)計育種的可能性，并提出以上技術(shù)和方法在綿羊育種中面臨的問題和挑戰(zhàn)。

綿羊；遺傳修飾；基因編輯；動物育種

綿羊()是畜牧業(yè)中重要的農(nóng)業(yè)動物之一，約在1萬年前即被人類所馴化[1]，主要為人類提供皮毛、肉類和奶制品等。為了獲得具有優(yōu)良性狀的綿羊品種，人們通過各種方式進行品種的選育，期望獲得具有較高肉奶產(chǎn)量、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)皮毛或具有較高抗病能力的綿羊品種。傳統(tǒng)的育種方式是通過表型選擇將優(yōu)良性狀個體進行保留。整個過程需要對其親本進行選種，包括選定親本品系、確定雜交組合、雜交代數(shù)等。為了固定表型，需要采用適當?shù)慕?，但近交會引起動物的表型退化、品質(zhì)衰退等。雜交產(chǎn)生的后代也會出現(xiàn)性狀分離的現(xiàn)象，育種過程非常緩慢且復(fù)雜。

自基因的概念提出以來，分子生物學(xué)和基因工程理論和技術(shù)獲得了較大的發(fā)展，明確了遺傳變異可以引起性狀的改變。因此，可以通過對基因進行修飾或編輯實現(xiàn)新品種培育。通過物理或化學(xué)誘變可以在動物中實現(xiàn)誘變育種[2]，但誘變產(chǎn)生的基因突變往往是隨機性的，并且會產(chǎn)生無育種價值的性狀或不利于育種的性狀。遺傳修飾育種直接針對調(diào)控性狀的基因，通過轉(zhuǎn)基因或基因編輯等方式對基因進行分子設(shè)計，在保留品種固有優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，引入新性狀，改善劣勢性狀，而且可以突破品種的局限，將其他物種的性狀引入，從而克服物種間的生殖隔離，把不同物種的優(yōu)質(zhì)性狀集合和重組，實現(xiàn)定向選擇育種。分子設(shè)計育種相比傳統(tǒng)育種在可預(yù)見性和選擇上有了極大的提高。

通過遺傳修飾在動物中進行分子設(shè)計育種，理論上僅需要一個世代就能獲得穩(wěn)定遺傳的品系，可以大大縮短育種時間，降低育種成本。通過直接對基因進行操作，在獲得的基因修飾個體中就能獲得穩(wěn)定的基因型?；蛐揎棽僮鞯倪^程對個體的要求較低，需要品種內(nèi)具有典型性狀的個體提供體細胞、胚胎或卵細胞即可?；蛐揎梻€體的制備需要代孕母畜，但代孕受體的選擇標準也較為寬松，不需要本品種內(nèi)的最優(yōu)個體，可以用物種內(nèi)其他品種中具有優(yōu)良繁殖能力的個體，拓寬了選擇范圍，同時保有一定數(shù)量的受體即可。通過規(guī)模化的基因修飾，可以在短時間內(nèi)獲得一定數(shù)量的基因修飾動物群體。通過將獲得的純合子進行交配，對群體進行擴繁，可以在幾代之內(nèi)就建立相當規(guī)模的穩(wěn)定遺傳品系，相較于雜交育種縮短了時間，提高了效率。

1 遺傳修飾技術(shù)在綿羊中的應(yīng)用

在綿羊等大動物中，遺傳育種對性狀的改良主要包括改善原有性狀以及引入新性狀?？梢赞D(zhuǎn)入外源基因序列以獲得原物種不具備的表型或功能。遺傳修飾的方式最初為外源基因的隨機插入或同源重組介導(dǎo)的插入或刪除，同時需要借助受精卵顯微注射或體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)的方式獲得遺傳修飾綿羊。在自然情況下同源重組發(fā)生的概率極低，只有10–6[3]，遺傳修飾細胞的篩選難度較大，適合在干細胞中進行篩選，而綿羊的干細胞體系目前并不成熟。因此，提高同源重組效率成為分子設(shè)計育種中的關(guān)鍵。

在以人工核酸酶為代表的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)后，以CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)系統(tǒng)為代表的基因編輯逐漸成為遺傳修飾的常用方法。人工核酸酶系統(tǒng)通過提高DNA雙鏈斷裂效率來提高同源重組的效率，其原理為：當基因組中出現(xiàn)雙鏈缺口時，啟動基因組損傷修復(fù)機制，包括非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)修復(fù)，或者存在同源供體的情況下，啟動同源重組修復(fù)(homology- directed repair, HDR)，將外源基因引入至重組區(qū)域[4]。因此，提高基因組中雙鏈斷裂的效率，就能提高同源重組的能力，從而提高基因打靶效率，可以使隨機的重組效率由原來的10–7～10–6提高至10–2～10–1。借助新型基因編輯工具，不僅能實現(xiàn)外源基因在受體中穩(wěn)定高效的表達，還可以實現(xiàn)基因組中序列的缺失、堿基替換和插入等，造成移碼突變、氨基酸轉(zhuǎn)換等。基因編輯工具的出現(xiàn)極大地豐富了遺傳修飾的方法和策略。遺傳修飾技術(shù)發(fā)展及在綿羊中的應(yīng)用進程如圖1所示。

制備遺傳修飾大動物涉及多種原理和技術(shù)的應(yīng)用以及繁雜的操作流程(圖2)。原理方面涉及隨機插入、同源重組、DNA堿基修復(fù)、轉(zhuǎn)座子、RNAi轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等分子生物學(xué)基礎(chǔ)概念。將這些概念轉(zhuǎn)化為實際可操作的技術(shù)，首先需要根據(jù)實驗?zāi)康臉?gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒載體，其次要實現(xiàn)載體向細胞、胚胎甚至個體的轉(zhuǎn)移。操作技術(shù)包括：脂質(zhì)體/病毒/精子等方法進行載體遞送，mRNA或蛋白質(zhì)的直接顯微注射，體細胞核移植技術(shù)等獲得基因被修飾的個體。總體可分為以下3部分：(1)獲得目的基因序列并通過限制性內(nèi)切酶的酶切連接，制備攜帶外源基因或具有敲除、點突變或干擾等功能的載體。例如具有同源重組功能的載體，以及表達外源基因、轉(zhuǎn)座子酶、siRNA、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases, TALEN)或CRISPR/Cas9等元件的載體，或者體外獲得具有基因修飾功能的mRNA或蛋白質(zhì)。(2)通過細胞轉(zhuǎn)染、病毒遞送或顯微注射等方式將載體、mRNA或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入體細胞或早期胚胎中，對供體細胞或受精卵基因組進行遺傳修飾。(3)發(fā)生基因修飾的供體細胞或受精卵再通過體細胞核移植技術(shù)或胚胎移植技術(shù)移入受體動物子宮內(nèi)，從而獲得包括綿羊在內(nèi)的多種遺傳修飾動物。

圖1 遺傳修飾技術(shù)及其在綿羊中應(yīng)用的里程碑事件

圖2 制備遺傳修飾綿羊流程圖

制備遺傳修飾綿羊之前，需要確定候選基因，通過載體構(gòu)建獲得具有各種候選基因修飾功能的載體。通過載體轉(zhuǎn)染或各種遞送方式，在供體細胞或受精卵中載體表達并對基因組進行修飾或編輯。獲得的遺傳修飾胚胎移植入受體母羊中發(fā)育并獲得遺傳修飾綿羊。

1.1 傳統(tǒng)的遺傳修飾方法

在高效基因編輯技術(shù)建立以前，在綿羊中主要通過基因組本身的同源重組或外源片段隨機插入對基因進行修飾，并結(jié)合顯微注射或體細胞核移植技術(shù)獲得遺傳修飾個體。使用這種遺傳修飾方式，在基因組中發(fā)生基因編輯或重組的效率較低，插入位點具有隨機性，并且容易產(chǎn)生嵌合體等特點。通過顯微注射和體細胞核移植技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因綿羊研究結(jié)果見表1。與最早獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠()類似，第一只轉(zhuǎn)基因綿羊也是通過顯微注射獲得。1985年，研究者將人生長激素基因(human growth hormone,)通過顯微注射注入綿羊胚胎，通過胚胎移植入代孕受體中獲得第一只轉(zhuǎn)基因綿羊[6]。在后續(xù)較長時間內(nèi)，人們通過顯微注射制備了多種轉(zhuǎn)基因綿羊，如轉(zhuǎn)羊生長激素基因的綿羊[18,19]以及轉(zhuǎn)Visna病毒糖蛋白綿羊等[20]。

克隆羊多莉的誕生標志著哺乳動物體細胞克隆技術(shù)的建立[9]。利用體細胞篩選獲得穩(wěn)定整合外源基因的單克隆細胞作為細胞核供體，經(jīng)過核移植和胚胎移植技術(shù)產(chǎn)下預(yù)期性狀的克隆后代，同時不存在顯微注射產(chǎn)生嵌合的問題。研究人員最早通過此方法獲得了能夠在羊乳中表達人凝血因子的轉(zhuǎn)基因綿羊[10]。2001年英國的羅斯林研究所通過同源重組結(jié)合體細胞克隆技術(shù)獲得了(ovine prion protein)和(α(1,3)galactosyl transferase)定點敲除的綿羊[30]。該技術(shù)獲得的細胞供體是通過同源重組獲得的基因敲除單克隆細胞，因此再通過體細胞核移植獲得的克隆后代均為陽性個體。McCreath等[31]也通過同源重組及體細胞核移植技術(shù)獲得了(ovine α1(I) procollagen)定點插入(α1-antitrypsin)的基因修飾綿羊。

表1 通過顯微注射和體細胞核移植技術(shù)獲得的遺傳修飾綿羊

顯微操作技術(shù)理論上可以在任何能獲得卵細胞的動物中進行操作，甚至可以在胚盤下腔注射以獲得遺傳修飾禽類，而體細胞核移植只能對兩棲類、魚類和哺乳類卵細胞進行操作。通過顯微注射技術(shù)制備遺傳修飾動物時，在原核形成到第一次卵裂之間進行顯微操作，才能盡可能的避免產(chǎn)生嵌合體。早期獲得遺傳修飾動物的效率較低，使得顯微注射獲得的個體大多數(shù)為野生型或嵌合體。而體細胞核移植技術(shù)可以將大量的篩選工作在細胞水平進行，避免在出生的后代中產(chǎn)生大量陰性個體或嵌合體。

1.2 精子載體、慢病毒載體、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的遺傳修飾

顯微注射或體細胞核移植技術(shù)是將遺傳修飾載體導(dǎo)入早期胚胎或細胞的傳統(tǒng)方式，此后又發(fā)展出利用精子或病毒等生物載體的導(dǎo)入方式。精子載體法的原理為，通過將精子與DNA共孵育后，將攜帶DNA的精子受精，從而獲得基因修飾的受精卵；或者在綿羊睪丸中直接注射外源載體，載體進入精子后再進行交配獲得基因修飾后代。多個團隊分別通過這種方法制備了(solute carrier family 7 member 11)[34]、(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)[35]和(lipoprotein lipase)[36]的轉(zhuǎn)基因綿羊，并獲得了具有表型的F1后代。但這種方法的重復(fù)性較差且效率較低。

慢病毒載體介導(dǎo)的基因修飾依賴于病毒感染細胞的能力，通過將慢病毒注射到綿羊卵子或胚胎，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。通過慢病毒載體感染，已獲得了轉(zhuǎn)(green fluorescent protein)轉(zhuǎn)基因羊[37～39]以及具有更高產(chǎn)毛性能的轉(zhuǎn)(fibroblast growth factor 5)綿羊[40]。結(jié)合顯微注射和慢病毒載體的方法，也獲得了轉(zhuǎn)入外源基因表達量較高的后代[41,42]。病毒載體遞送質(zhì)粒相對于顯微注射法和體細胞核移植方法相對簡單，甚至在小鼠中可以直接通過鼻腔或氣管滴入的方法遞送到肺部進行基因編輯[43]，但這一方法在大動物中還未見報道。此外，使用病毒載體法獲得遺傳修飾動物在安全性方面也會受到限制。

在基因組中存在具有特殊功能的序列，也可被用于實現(xiàn)綿羊中基因遺傳修飾。例如構(gòu)建表達轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒載體并結(jié)合其他遞送方法，即利用轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性將序列插入基因組中特定區(qū)域，在綿羊中已有報道(表2)。Bevacqua等[44]通過Tn5或SB (sleeping beauty)轉(zhuǎn)座子載體結(jié)合顯微注射成功獲得了遺傳修飾綿羊個體；Hu等[45]則通過SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的RNAi獲得了(myostatin)敲低的綿羊個體。

一般情況下，精子載體和慢病毒載體介導(dǎo)的遺傳修飾技術(shù)不需要依賴精密的儀器設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)操作，相比顯微操作和體細胞和移植技術(shù)成本較低。利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的遺傳修飾，是在高效精確的人工核酸酶技術(shù)規(guī)模運用之前的有效修飾方法。人工核酸酶技術(shù)出現(xiàn)后，憑借在修飾效率上的巨大優(yōu)勢，成為了在農(nóng)業(yè)動物中的遺傳修飾的主要方法。然而，技術(shù)的創(chuàng)新無法突破動物生殖方式的局限，畜禽動物本身的生殖方式?jīng)Q定了對其進行遺傳修飾操作時，可選擇的載體遞送方式以及修飾難度存在差異。例如，哺乳動物可獲得卵母細胞并在體外進行受精，從而將受精卵與顯微注射、轉(zhuǎn)染等操作體系配合。而禽類的生殖方式?jīng)Q定了受精卵在離開母體之前，已經(jīng)經(jīng)過卵裂等發(fā)育階段成為多細胞的胚胎，此外，禽類的蛋殼也加大了對其卵或胚胎進行遺傳修飾操作的難度。

表2 綿羊中使用病毒載體、精子載體或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的遺傳修飾研究

1.3 人工核酸酶介導(dǎo)的基因精準編輯

如前面所述，通過顯微注射和體細胞核移植技術(shù)，可以實現(xiàn)外源基因的表達或內(nèi)源基因的打靶，但外源基因的插入是隨機的，打靶的效率也很低。隨著人工核酸酶被證實可以運用于遺傳修飾后，動物的基因修飾已經(jīng)從最初單一的、隨機性的轉(zhuǎn)基因向基因組的精準敲入、敲除和點突變快速發(fā)展，甚至可以實現(xiàn)時間和組織特異性的基因編輯。目前通過顯微注射和SCNT結(jié)合常用的人工核酸酶技術(shù)獲得基因編輯綿羊的方法如圖3所示，所報道獲得的基因編輯綿羊如表3所示。

1.3.1 ZFN介導(dǎo)的基因編輯

Lee等[8]于1989年首次報道了鋅指結(jié)構(gòu)，后來逐漸發(fā)展為可用于基因編輯的鋅指核酸酶技術(shù)。ZFN系統(tǒng)通過序列識別結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用。其中，鋅指蛋白由Cys2-His2蛋白單元組成，可以與基因序列上的3個堿基識別[65]。根據(jù)靶基因序列，將多個蛋白單元串聯(lián)組裝而成的鋅指蛋白即可對其識別，串聯(lián)結(jié)構(gòu)越長，就越有識別的特異性[66]。起切割作用的為I酶，在鋅指蛋白的引導(dǎo)下切割基因序列[67]。而I通常形成二聚體，因此可以對序列造成雙鏈斷裂，進而啟動基因修復(fù)機制[68]。帶有ZFN表達元件的質(zhì)粒載體正是通過這種機制對細胞基因組進行編輯。ZFN首次在非洲爪蟾()中被應(yīng)用[12]，此后在果蠅()[69]等動物中均被成功使用。

圖3 人工核酸酶技術(shù)制備基因編輯綿羊的方法示意圖

ZFN、TALEN或Cas9載體主要通過顯微注射或體細胞核移植遞送入體細胞或受精卵中，在細胞中介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break, DSB)，經(jīng)過細胞內(nèi)同源重組修復(fù)(HDR)或非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)可以對內(nèi)源基因進行編輯或引入外源基因，獲得的基因編輯細胞經(jīng)過體細胞核移植(SCNT)獲得后代，基因編輯胚胎則通過胚胎移植入受體中獲得后代。

表3 人工核酸酶技術(shù)介導(dǎo)的基因編輯在綿羊遺傳修飾中的應(yīng)用

Salabi等[14]在綿羊肌肉衛(wèi)星細胞中通過ZFN對進行了編輯并篩選獲得了陽性克隆，繼而驗證在衛(wèi)星細胞中的功能。Zhang等[47]在綿羊成纖維細胞中成功敲除了基因，并通過ZFN mRNA的顯微注射獲得了基因編輯胚胎。但目前未見有通過ZFN獲得基因編輯綿羊的報道。ZFN的使用比被動的同源重組在效率上有了較大的提高，但由于其設(shè)計復(fù)雜、特異性較差、有細胞毒性以及容易脫靶等原因，逐漸被后來的其他人工核酸酶所取代。

1.3.2 TALEN介導(dǎo)的基因編輯

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶是在植物病原體黃單胞菌()中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物的基礎(chǔ)上建立的[11]，其結(jié)構(gòu)和原理與ZFN相似，包括具有識別功能的TALE蛋白和切割功能的I酶。TALE具有結(jié)合DNA的功能，其中含有的重復(fù)串聯(lián)區(qū)域包含34個氨基酸，第12和13位點的氨基酸對于識別特定的堿基起關(guān)鍵作用[70]。在TALE導(dǎo)向下，I對基因組的特定區(qū)域進行切割。TALEN以二聚體的形式發(fā)揮雙鏈切割作用，因此通常制作1對TALEN載體。自TALEN運用到果蠅中以來[13]，在綿羊中的應(yīng)用主要靶向綿羊基因。通過TALEN mRNA注射受精卵[15]，或體細胞核移植均獲得了編輯綿羊，且在表型上與野生型呈現(xiàn)差異[48,49]。相比ZFN，TALEN在特異性方面有所提高，但TALE分子較大、制備依然復(fù)雜，需要的成本和時間過長。

1.3.3 CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯

CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其簡單的設(shè)計、更高的效率，為基因編輯帶來了革命性的突破。CRISPR全稱為成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。Cas為CRISPR相關(guān)基因編碼的特異切割DNA分子的核酸酶，于1987年在細菌和古細菌中被發(fā)現(xiàn)，具有發(fā)揮細菌免疫功能的作用[7]。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I、II和III，其中Cas9屬于II型系統(tǒng)，僅需要一種蛋白參與即可完成序列切割[71]。II型系統(tǒng)包含4種分子，其中crRNA和tracrRNA組成的雙鏈復(fù)合體引導(dǎo)Cas9蛋白在序列上特定位置切割。在實際應(yīng)用中，通過4個堿基將crRNA和tracrRNA連接，形成向?qū)NA (single-guide RNA, sgRNA)表達框。一個Cas9載體包含了sgRNA表達框和Cas9蛋白。由于生物體內(nèi)含有RNase，只需要將20 bp的sg序列連入載體中，就能獲得可以在細胞內(nèi)切割DNA序列的全部元件，sg序列則為切割提供引導(dǎo)。sg序列雖然依賴于相鄰的PAM序列(5?-NGG-3?序列)，但在基因組中，NGG序列普遍存在，平均每128 bp序列中就可以找到一個位點[71]。CRISPR/Cas系統(tǒng)在2013年被證實可用于哺乳動物的基因編輯，此后使用CRISPR/Cas9進行動物基因編輯的研究出現(xiàn)井噴式的成果。利用顯微注射技術(shù)，可以實現(xiàn)Cas9 mRNA及其sgRNA同時被注入受精卵中，獲得基因編輯的綿羊。Crispo等[17]和Han等[50]利用該方法分別獲得了編輯的綿羊，其與野生型綿羊相比表現(xiàn)出明顯的體重差異。Wang等[51]則獲得了多個基因(和)同時編輯的綿羊，顯示出Cas9系統(tǒng)的強大編輯能力。此外，通過Cas9系統(tǒng)結(jié)合顯微注射獲得了[52]及[53]基因編輯綿羊。另外，還實現(xiàn)了綿羊Rosa26位點的外源基因定點插入[54]。CRISPR系統(tǒng)也可以與SCNT技術(shù)結(jié)合制備基因編輯綿羊，如對基因編輯的綿羊[55]以及編輯的綿羊[56]。

1.3.4 單堿基編輯系統(tǒng)(base editing)

2016年，Komor等[72]開發(fā)了基于Cas9系統(tǒng)的單堿基編輯系統(tǒng)，該技術(shù)被評為雜志年度十大科學(xué)技術(shù)突破之一，在基因治療、遺傳育種等領(lǐng)域具有應(yīng)用的潛力。通過將失活或只有單鏈切割活性的dCas9 (deactivated Cas, dCas)及nCas9 (nickase Cas, nCas)與嘧啶或嘌呤脫氨酶結(jié)合，單堿基編輯器可以精準的將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T)，或?qū)⑾汆堰?A)轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤(G)，分別稱之為胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editors, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABE)[73]。單堿基編輯器不需要依賴基因組雙鏈斷裂的產(chǎn)生，也無需供體DNA參與編輯，因此簡化了基因編輯步驟。在綿羊中，Zhou等[57]通過CBE系統(tǒng)實現(xiàn)了基因的C>T轉(zhuǎn)換，獲得了具有更快生長速度的基因編輯灘羊，為培育快長型綿羊品系奠定了基礎(chǔ)。單堿基編輯系統(tǒng)將動物的遺傳修飾從最初的整個基因的插入或大片段的敲除縮小到單個堿基的操作水平，對動物中由單堿基突變導(dǎo)致性狀變異的位點進行基因編輯。但單堿基編輯系統(tǒng)目前僅可以實現(xiàn)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)而無法實現(xiàn)堿基的顛換(transversion)，只能對符合堿基轉(zhuǎn)換類型的特定突變進行編輯，限制其對任意性狀的操作。此外，Jin等[74]及Zuo等[75]分別在不同物種中發(fā)現(xiàn)單堿基編輯系統(tǒng)存在嚴重的脫靶效應(yīng)，應(yīng)用時可能存在較大風險。其中，Zuo等[75]還建立了名為GOTI (genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection)的脫靶檢測技術(shù)，能夠顯著提高單堿基編輯時脫靶檢測的敏感性，可以在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)以往檢測手段不易發(fā)現(xiàn)的脫靶位點。該方法為減少單堿基編輯技術(shù)應(yīng)用的風險提供保障，利于該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

目前，除Cas9及單堿基編輯系統(tǒng)外，還有多種CRISPR相關(guān)的基因編輯工具被開發(fā)出來。例如，具有更高編輯效率的Cas12系統(tǒng)，具有靶向RNA編輯功能的Cas13系統(tǒng)，能夠編輯單鏈DNA的Cas14系統(tǒng)[76]以及更小分子量的CasⅩ[77]等。除Cas9之外，目前尚未見到其他CRISPR/Cas系統(tǒng)在綿羊中應(yīng)用的報道，但這些研究為綿羊的分子育種提供了較新的思路和方法。

2 利用遺傳修飾在綿羊中進行分子設(shè)計育種的主要方向

在馴化初期，人類飼養(yǎng)綿羊作為主要肉類來源，因此馴化方向大多為肉用品種。此后，為了獲得羊毛等副產(chǎn)品，人們又馴化出產(chǎn)毛量、毛色各異的地方綿羊品種。經(jīng)過長期的人工馴化，現(xiàn)在的綿羊品種與其祖先在體型外貌、行為、生殖能力等方面顯示了巨大差異，并在品種間出現(xiàn)顯著變異。人工選擇會在基因組上留下與動物性狀相關(guān)的選擇信號或分子標記。通過遺傳修飾在綿羊中進行分子育種，不僅使育種時間大為縮短，也可以將多種優(yōu)良性狀聚合，一次實現(xiàn)多個性狀的改良。在綿羊中，通過遺傳修飾進行分子設(shè)計育種主要體現(xiàn)在增強抗病抗逆能力，包括抗病毒、細菌及寄生蟲能力和抗寒、抗高溫高濕能力；改良生產(chǎn)性狀，包括肉產(chǎn)量、肉品質(zhì)、奶品質(zhì)；改善羊毛產(chǎn)量和品質(zhì)，包括毛長度、產(chǎn)量和強度；提高繁殖力，包括排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)等方面；制備動物模型，包括人類疾病模型或制備藥品等。利用遺傳修飾在綿羊中進行分子設(shè)計育種的應(yīng)用方向如圖4所示。

2.1 通過分子設(shè)計育種改善羊毛性狀

從克隆羊多莉出生到現(xiàn)在的20多年間，國內(nèi)外針對上述性狀開展了多項遺傳改良方面的研究。在提高羊毛性狀方面，Damak等[26,78]獲得的轉(zhuǎn)基因綿羊F1代的羊毛產(chǎn)量提高了6.2%，但F2代的羊毛產(chǎn)量提高效果卻不顯著。Bawden等[28]將毛角蛋白II基因在皮質(zhì)中特異性表達，獲得的轉(zhuǎn)基因羊毛結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，外觀富有光澤且卷曲度下降。多項獲得基因編輯綿羊的研究都證實轉(zhuǎn)基因個體羊毛產(chǎn)量比野生型綿羊有顯著提高[38,45]。Zhang等[58]通過顯微注射和Cas9技術(shù)敲除了基因獲得毛色發(fā)生變化的基因編輯綿羊。He等[34]通過睪丸注射進行基因編輯也獲得了毛色變化的綿羊。

2.2 通過分子設(shè)計育種改變?nèi)猱a(chǎn)量及品質(zhì)

在改善綿羊產(chǎn)肉量及肉品質(zhì)方面是研究者投入精力最多的領(lǐng)域。Amdas等[19]獲得的轉(zhuǎn)生長激素基因綿羊可過量表達生長激素，使生長速度增加同時減少脂肪含量。牛生長激素[21]以及人生長激素[6]都曾被轉(zhuǎn)入綿羊中以提高綿羊生長速度。在提高產(chǎn)肉量方面，基因是大部分研究者選擇的靶基因。敲除的綿羊大部分能獲得生長速度較快、體重顯著增加以及肌纖維增大的表型。Proudfoot等[16]、Crispo等[17]、Hu等[45]、Zhao等[48]、Li等[49]、Han等[50]以及Zhang等[56]通過TALEN或Cas9等方法結(jié)合顯微注射或體細胞核移植獲得了敲除綿羊，且取得預(yù)期表型。通過Cas9介導(dǎo)的基因單堿基編輯綿羊同樣表現(xiàn)出顯著提升的生長速度[57]。綿羊肉品質(zhì)的改良主要集中在減少肌間脂肪含量和改善脂肪成分方向，主要通過導(dǎo)入外源基因和對脂肪代謝相關(guān)通路中成員進行編輯來實現(xiàn)。目前，已獲得了[35]、[36]和[33,79]的轉(zhuǎn)基因綿羊。

圖4 利用遺傳修飾在綿羊中進行分子設(shè)計育種的應(yīng)用方向

通過對性狀相關(guān)的基因進行修飾，在綿羊中可以實現(xiàn)多個方向的應(yīng)用，例如生產(chǎn)性狀，包括肉產(chǎn)量、肉質(zhì)、生長速度等；毛纖維性狀，包括羊毛產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)、毛色等；繁殖性狀，包括產(chǎn)羔數(shù)等；高抗病能力；制備人類疾病模型；通過乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等。

2.3 通過分子設(shè)計育種進行綿羊抗病及疾病模型研究

抗病育種研究主要包括針對病原體進行干擾、針對內(nèi)源病原體受體進行敲除、轉(zhuǎn)入具有病毒抗原的基因以及誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體4個方面。Denning等[30]通過基因敲除獲得了4只單等位基因敲除綿羊。Clements等[20]制備了轉(zhuǎn)入羊髓鞘脫落病毒核衣殼蛋白基因的綿羊，在該綿羊血液中檢測到了vvENV糖蛋白的抗體。Deng等[80]通過睡美人轉(zhuǎn)座子將口蹄疫病毒VP1蛋白轉(zhuǎn)入綿羊中，轉(zhuǎn)基因綿羊在體外攻毒實驗中表現(xiàn)出抗病能力。此外，基因也被轉(zhuǎn)入綿羊中獲得具有抗病能力的轉(zhuǎn)基因綿羊[32]。

在生物醫(yī)藥或人類疾病模型制備方面，主要包括綿羊乳腺生物反應(yīng)器制備藥物或建立人類疾病模型綿羊。從20世紀90年代起，出現(xiàn)了多個轉(zhuǎn)人凝血因子綿羊的報道，并可以在綿羊乳腺中獲得人凝血因子，用于治療血友病等血液疾病。2000年，McCreath等[31]將人α-1-抗胰蛋白基因定點整合在綿羊的基因中，獲得了首例基因打靶綿羊。人突變體轉(zhuǎn)基因綿羊的建立為人亨廷頓舞蹈癥的研究提供了疾病模型[27,46]。在動物疾病模型領(lǐng)域，Denning等[30]獲得的敲除綿羊為異種器官移植的研究奠定了基礎(chǔ)。Williams等[52]將基因進行編輯，獲得了模擬人HPP (Hypophosphatasia)綜合征的綿羊模型。Vilarino等[53]獲得了基因敲除綿羊，同樣出現(xiàn)胰腺缺失的表型。Fan等[56]獲得的基因編輯綿羊，表現(xiàn)出與人囊性纖維化相似的表型。Menchaca等[61]將突變型通過Cas9介導(dǎo)的單鏈同源重組轉(zhuǎn)入綿羊中，獲得了耳聾模型的綿羊。Ma等[64]將褪黑激素(melatonin)基因轉(zhuǎn)入綿羊中，獲得了在乳腺中表達褪黑激素的轉(zhuǎn)基因綿羊。

2.4 通過分子設(shè)計育種改善綿羊繁殖性能

綿羊的繁殖性狀是羊?qū)嶋H生產(chǎn)中最受關(guān)注的性狀。影響綿羊產(chǎn)羔的主效基因為，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPR1B在A746G位置發(fā)生了氨基酸突變，該突變能顯著提高綿羊的產(chǎn)羔能力[59]。目前已有Cas9介導(dǎo)的基因編輯綿羊[59,60]，但其后代的產(chǎn)羔表型還未見報道。

除上述獲得的已知功能的基因修飾綿羊，還有部分綿羊中定位清晰但功能不完全明確的主效基因，也可做為后續(xù)基因編輯的研究對象，如與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的(bone morphogenetic protein 15)、(growth differentiation factor 9)等[81]；與綿羊椎骨數(shù)相關(guān)的(vertebrae development homolog)基因[82]；與改善肉質(zhì)相關(guān)的(melanocortin-4 receptor)基因[83]和(fatty acid-binding protein 4)[84]等。目前已經(jīng)在綿羊中開展遺傳修飾研究的基因及其相關(guān)功能見表4。這些研究為綿羊分子設(shè)計育種提供了可行的思路。

近年來，我國肉羊規(guī)模化養(yǎng)殖比例一直在提升，隨著養(yǎng)殖方式的轉(zhuǎn)變，生長快、繁殖能力強且飼料轉(zhuǎn)化率高的舍飼肉羊品種將會愈發(fā)受市場認可。但生長、繁殖以及代謝這些性狀均為多基因控制復(fù)雜性狀，如何在傳統(tǒng)育種理論基礎(chǔ)上更好引入分子育種概念是需要探索的。一方面針對這些重要經(jīng)濟性狀的部分功能明確的主效基因，可直接利用以上的遺傳修飾方法快速獲得性能突出的基因編輯動物做為育種新材料；另一方面對于目前尚不確定的功能位點，可以通過這些遺傳修飾手段直接在目標動物中驗證功能位點的有效性，進一步促進育種過程中分子標記輔助選擇的準確度。

與豬()相比，綿羊中進行遺傳修飾的研究無論在數(shù)量和質(zhì)量上都比較低。其原因首先在于兩個物種的養(yǎng)殖數(shù)量和研究重要性方面差距較大；其次從技術(shù)層面，豬為多胎動物且養(yǎng)殖規(guī)模較大，卵母細胞相對容易獲得，體外培養(yǎng)體系更成熟，且細胞對體外環(huán)境的耐受性更好；另外豬的遺傳修飾模型除了涉及畜牧業(yè)，還常作為疾病模型或器官移植來源延伸到醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，因此更多的團隊以豬為研究對象。相比較而言，綿羊繁殖能力低于豬，較難獲得大量的卵母細胞。目前在綿羊中進行遺傳修飾操作的目的主要為品種遺傳改良，在疾病模型等領(lǐng)域研究較少。但是，綿羊也是醫(yī)學(xué)中神經(jīng)生物學(xué)以及脊柱發(fā)育研究等方面的良好研究對象，未來的綿羊分子設(shè)計育種研究也可以更多的應(yīng)用于建立醫(yī)用模型。

表4 重要性狀基因在基因修飾綿羊中的研究

3 遺傳修飾技術(shù)在綿羊中應(yīng)用的問題及展望

分子設(shè)計育種代表著未來種業(yè)的發(fā)展方向，近年來在遺傳修飾技術(shù)方面發(fā)展迅速，但總體看來家畜分子育種尤其是綿羊分子育種的研究還處于初級階段，距離商業(yè)化以及實際生產(chǎn)還有較長路要走。其中的問題主要包括功能基因研究不夠明確，生產(chǎn)效率低且成本高，生產(chǎn)周期長以及較難通過生物安全評價等。

3.1 功能基因選擇和表達調(diào)控研究不夠明確

分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究經(jīng)過幾十年的迅猛發(fā)展，已經(jīng)取得了矚目的成就，但是對于畜禽大動物尤其是綿羊而言，由于基因組的解析、基因功能的挖掘以及基因表達調(diào)控模式探究等方面的研究遠遠落后于人類以及模式動物，只有極少數(shù)性狀被定位到了致因突變并闡明了遺傳機理。而且綿羊和其他家畜的重要經(jīng)濟性狀大多為數(shù)量性狀，這類性狀存在多基因協(xié)同或拮抗表達或者存在印記效應(yīng)等，導(dǎo)致遺傳操作的難度較大。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法的隨機插入可能造成表達不穩(wěn)定，影響其他基因的表達；生長相關(guān)基因敲除或突變，會造成動物癱瘓或器官發(fā)育異常；繁殖相關(guān)基因突變，會造成母畜不育或難產(chǎn)等。這些問題僅通過革新基因編輯技術(shù)并不能從根本上解決。在畜禽大動物上，可以通過可靠的遺傳資源群體、準確的表型數(shù)據(jù)測定并結(jié)合現(xiàn)有的大數(shù)據(jù)進行遺傳定位分析，同時利用分子生物學(xué)手段解析致因基因及突變的調(diào)控機理，最終利用合理的基因編輯手段獲得分子設(shè)計個體。但這個過程周期長且耗費大，需要團隊合作。目前，已發(fā)現(xiàn)的可能影響綿羊表型的基因及其相應(yīng)的功能突變見表5。

3.2 制備遺傳修飾動物的生產(chǎn)效率低且成本較高

在綿羊、山羊()和豬等大動物中，無論是通過顯微操作技術(shù)還是體細胞核移植技術(shù)制備遺傳修飾動物，都存在效率偏低的問題。通過顯微注射方法獲得基因編輯個體時，會存在產(chǎn)生的基因編輯個體嵌合現(xiàn)象，即產(chǎn)生的基因編輯后代個體中包含不同的基因型。其原因在于受精卵注射核酸后，沒有立即對胚胎進行編輯，而在胚胎卵裂后才對不同細胞各自進行編輯而產(chǎn)生不同的基因型，因此，應(yīng)盡快在受精后立即進行顯微注射，以提高胚胎發(fā)育早期發(fā)生基因編輯的概率，從而降低產(chǎn)生嵌合后代的概率。此外，對注射核酸的總量及濃度也需要優(yōu)化調(diào)整。在綿羊、山羊和豬中通過顯微注射獲得遺傳修飾動物的效率均可達到10%以上甚至更高，而體細胞核移植技術(shù)克隆效率低，且去核過程會對細胞質(zhì)造成較大損傷。通過克隆胚胎獲得基因編輯綿羊、山羊和豬的效率往往不超過5%，實驗獲得綿羊、山羊和豬個體的效率統(tǒng)計見表6。

為了提高遺傳修飾動物的效率，找到引發(fā)效率低下的原因是關(guān)鍵。不同動物物種之間，影響遺傳修飾的因素以及陽性個體獲得效率存在顯著差異。研究顯示，體細胞核移植制備克隆動物的主要障礙包括移植后胚胎存活率低且容易流產(chǎn)，其主要原因為體細胞重編程過程中的多種表觀修飾障礙。在豬中，(retrotransposon-like-1)的甲基化異常是以豬誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent, iPS)為供體時克隆成功與否的重要影響因素，的敲除和代償實驗證明克隆動物的關(guān)鍵因素在于的表達是否正常[104]。制備克隆猴()的難點也在于胚胎發(fā)育過程中的甲基化修飾，例如存在H3K9三甲基化，當添加了H3K9me3去甲基化酶KDM4D和組蛋白去乙?；窰DAC抑制劑TSA后，獲得了世界首例體細胞克隆猴[105]，表明在克隆猴過程中在培養(yǎng)體系中添加表觀遺傳修飾的抑制劑可以提高克隆效率。在克隆猴制備過程中供體細胞的選擇也比較關(guān)鍵，使用卵丘細胞做供體的克隆猴出生后不久便死亡，而使用胎兒成纖維細胞做供體時獲得了存活的克隆猴。此外，外源因子對重構(gòu)胚的發(fā)育也有影響。褪黑激素是一種抗氧化劑，具有清除活性氧的作用，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，可減少DNA損傷，在體細胞核移植的胚胎發(fā)育液中添加褪黑激素等可以提高豬重構(gòu)胚的發(fā)育潛能，進而提高克隆效率[106]。在綿羊中，也有通過在供體細胞培養(yǎng)過程中添加表觀修飾抑制劑KDM4D提高克隆胚胎體外發(fā)育能力的報道[107]，表明表觀修飾對動物克隆胚胎發(fā)育的影響存在普遍性，通過改善這些影響，可以提高獲得克隆動物的效率。要根本解決克隆效率低的問題，對大動物胚胎發(fā)育過程調(diào)控方式以及關(guān)鍵效應(yīng)通路等的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要。

在實驗操作方面，現(xiàn)有的受精卵電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以將sgRNA及Cas9的mRNA共轉(zhuǎn)入受精卵中，并通過Cas9作用對受精卵進行編輯，這是獲得基因編輯動物的簡化方法[108]。顯微操作和體細胞核移植過程需要的顯微操作設(shè)備，成本較高，同時需要專門的技術(shù)人員操作，增加了培訓(xùn)和時間成本。對于提供受體動物的實驗場，需要專門預(yù)留一定數(shù)量的優(yōu)質(zhì)后備母羊，在飼養(yǎng)成本上有所增加。

3.3 基因編輯新品種的生物安全評價和應(yīng)用

通過分子設(shè)計育種獲得的家畜要實現(xiàn)商業(yè)化所面臨的最大問題為生物安全評價。以CRISPR/Cas系統(tǒng)代表的人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為遺傳修飾的主流方法。我國對基因修飾動植物(包括轉(zhuǎn)基因和基因編輯)的生物安全評價非常嚴格，目前在我國批準上市的只有抗番木瓜環(huán)斑花葉病毒(papaya ringspot virus)的轉(zhuǎn)基因木瓜()和抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉花()。轉(zhuǎn)基因生物安全主要針對遺傳修飾動植物是否會破壞生態(tài)平衡，是否會影響人們的健康等方面進行評價。目前還沒有確切的證據(jù)證實基因修飾動植物在生物安全方面有安全隱患。例如轉(zhuǎn)基因牛產(chǎn)生的重組乳鐵蛋白飼喂小鼠實驗中，長期的飼喂未使小鼠出現(xiàn)顯著的臨床癥狀和行為異常[109]。遺傳修飾生物的排泄物是否會對環(huán)境產(chǎn)生威脅也未有定論。即便如此，仍然需要制定完善的評價體系，針對食物毒性、過敏性、抗生素及營養(yǎng)成分代謝等方面進行安全評估。雖然基因編輯技術(shù)等遺傳修飾方法在育種應(yīng)用中受到了爭議，但不可忽視其巨大的應(yīng)用前景。在有嚴格的生物安全評價為保障基礎(chǔ)上，分子設(shè)計育種代表著未來家畜育種的發(fā)展方向，能夠促進畜牧業(yè)發(fā)展。

目前，由于生物安全評價的限制，通過遺傳修飾育種獲得的動物品種目前很難開展大規(guī)模的育種研究，更不可能實現(xiàn)商業(yè)化。美國食品藥品監(jiān)督局分別在2009年、2014年和2015年批準了基因修飾山羊、兔()和雞生產(chǎn)的藥物上市，而真正得以進入食品領(lǐng)域的遺傳修飾動物僅為2015年批準的轉(zhuǎn)生長激素三文魚()和2020年批準的敲除的基因編輯豬。目前批準上市的品種僅僅是眾多研究成果的冰山一角，期望未來有越來越多的分子育種動物產(chǎn)品走進人們的視野。

在綿羊和其他農(nóng)業(yè)動物中，仍然存在大量的遺傳變異位點未被解析。在未來的研究中，需要對適合育種的重要經(jīng)濟性狀位點進行持續(xù)挖掘并結(jié)合不斷改進的分子設(shè)計育種工具，創(chuàng)制和培育出能夠滿足人們健康生活質(zhì)量需求的動物新品種。

[1] Chessa B, Pereira F, Arnaud F, Amorim A, Goyache F, Mainland I, Kao RR, Pemberton JM, Beraldi D, Stear MJ, Alberti A, Pittau M, Iannuzzi L, Banabazi MH, Kazwala RR, Zhang YP, Arranz JJ, Ali BA, Wang ZL, Uzun M, Dione MM, Olsaker I, Holm LE, Saarma U, Ahmad S, Marzanov N, Eythorsdottir E, Holland MJ, Ajmone-Marsan P, Bruford MW, Kantanen J, Spencer TE, Palmarini M. Revealing the history of sheep domestication using retrovirus integrations.,2009, 324(5926): 532–536.

[2] Zhao JG, Lai LX, Ji WZ, Zhou Q. Genome editing in large animals: current status and future prospects., 2019, 6(3): 402–420.

[3] Iiizumi S, Kurosawa A, So S, Ishii Y, Chikaraishi Y, Ishii A, Koyama H, Adachi N. Impact of non-homologous end-joining deficiency on random and targeted DNA integration: implications for gene targeting., 2008, 36(19): 6333–6342.

[4] Choulika A, Perrin A, Dujon B, Nicolas JF. Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae., 1995, 15(4): 1968–1973.

[5] Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA., 1980, 77(12): 7380–7384.

[6] Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE, Wall RJ, Bolt DJ, Ebert KM, Palmiter RD, Brinster RL. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection.1985, 315(6021): 680–683.

[7] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in, and identification of the gene product., 1987, 169(12): 5429–5433.

[8] Lee MS, Gippert GP, Soman KV, Case DA, Wright PE. Three-dimensional solution structure of a single zinc finger DNA-binding domain., 1989, 245(4918): 635–637.

[9] Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line., 1996, 380(6569): 64–66.

[10] Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, Colman A, Campbell KH. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts., 1997, 278(5346): 2130–2133.

[11] Moscou MJ, Bogdanove AJ. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors., 2009, 326(5959): 1501.

[12] Rémy S, Tesson L, Ménoret S, Usal C, Scharenberg AM, Anegon I. Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals., 2010, 19(3): 363–371.

[13] Sander JD, Cade L, Khayter C, Reyon D, Peterson RT, Joung JK, Yeh JRJ. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs., 2011, 29(8): 697–698.

[14] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin SL, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu XB, Jiang WY, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems., 2013, 339(6121): 819–823.

[15] Salabi F, Nazari M, Chen Q, Nimal J, Tong JM, Cao WG. Myostatin knockout using zinc-finger nucleases promotes proliferation of ovine primary satellite cells in vitro., 2014, 192 Pt A: 268–280.

[16] Proudfoot C, Carlson DF, Huddart R, Long CR, Pryor JH, King TJ, Lillico SG, Mileham AJ, McLaren DG, Whitelaw CBA, Fahrenkrug SC. Genome edited sheep and cattle., 2015, 24(1): 147–153.

[17] Crispo M, Mulet AP, Tesson L, Barrera N, Cuadro F, dos Santos-Neto PC, Nguyen TH, Crénéguy A, Brusselle L, Anegón I, Menchaca A. Efficient generation of myostatin knock-out sheep using CRISPR/Cas9 technology and microinjection into zygotes., 2015, 10(8): e0136690.

[18] Murray JD, Nancarrow CD, Marshall JT, Hazelton IG, Ward KA. Production of transgenic merino sheep by microinjection of ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion genes., 1989, 1(2): 147–155.

[19] Adams NR, Briegel JR, Ward KA. The impact of a transgene for ovine growth hormone on the performance of two breeds of sheep, 2002, 80(9): 2325–2333.

[20] Clements JE, Wall RJ, Narayan O, Hauer D, Schoborg R, Sheffer D, Powell A, Carruth LM, Zink MC, Rexroad CE. Development of transgenic sheep that express the visna virus envelope gene., 1994, 200(2): 370–380.

[21] Rexroad CE, Hammer RE, Bolt DJ, Mayo KE, Frohman LA, Palmiter RD, Brinster RL. Production of transgenic sheep with growth-regulating genes., 1989, 1(3): 164–169.

[22] Rexroad CE, Mayo K, Bolt DJ, Elsasser TH, Miller KF, Behringer RR, Palmiter RD, Brinster RL. Transferrin- and albumin-directed expression of growth-related peptides in transgenic sheep., 1991, 69(7): 2995–3004.

[23] Wright G, Carver A, Cottom D, Reeves D, Scott A, Simons P, Wilmut I, Garner I, Colman A. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep., 1991, 9(9): 830–834.

[24] Clark AJ, Bessos H, Bishop JO, Brown P, Harris S, Lathe R, McClenaghan M, Prowse C, Simons JP, Whitelaw CBA, Wilmut I. Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep., 1989, 7: 487–492.

[25] Niemann H, Halter R, Carnwath JW, Herrmann D, Lemme E, Paul D. Expression of human blood clotting factor VIII in the mammary gland of transgenic sheep., 1999, 8(3): 237–247.

[26] Damak S, Jay NP, Barrell GK, Bullock DW. Targeting gene expression to the wool follicle in transgenic sheep., 1996, 14(2): 181–184.

[27] Jacobsen JC, Bawden CS, Rudiger SR, McLaughlan CJ, Reid SJ, Waldvogel HJ, MacDonald ME, Gusella JF, Walker SK, Kelly JM, Webb GC, Faull RLM, Rees MI, Snell RG. An ovine transgenic Huntington's disease model., 2010, 19(10): 1873–1882.

[28] Bawden CS, Powell BC, Walker SK, Rogers GE. Expression of a wool intermediate filament keratin transgene in sheep fibre alters structure., 1998, 7(4): 273–287.

[29] Deng SL, Yu K, Wu Q, Li Y, Zhang XS, Zhang BL, Liu GS, Liu YX, Lian ZX. Toll-like receptor 4 reduces oxidative injuryglutathione activity in sheep., 2016, 2016: 9151290.

[30] Denning C, Burl S, Ainslie A, Bracken J, Dinnyes A, Fletcher J, King T, Ritchie M, Ritchie WA, Rollo M, de Sousa P, Travers A, Wilmut I, Clark AJ. Deletion of the alpha(1,3)galactosyl transferase (GGTA1) gene and the prion protein (PrP) gene in sheep., 2001, 19(6): 559–562.

[31] McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells., 2000, 405(6790): 1066–1069.

[32] Deng SL, Li GG, Zhang JL, Zhang XS, Cui MS, Guo Y, Liu GS, Li GP, Feng JZ, Lian ZX. Transgenic cloned sheep overexpressing ovine toll-like receptor 4., 2013, 80(1): 50–57.

[33] Duan B, Cheng L, Gao Y, Yin FX, Su GH, Shen QY, Liu K, Hu X, Liu X, Li GP. Silencing of fat-1 transgene expression in sheep may result from hypermethylation of its driven cytomegalovirus (CMV) promoter., 2012, 78(4): 793–802.

[34] He X, Li HT, Zhou ZY, Zhao ZS, Li W. Production of brown/yellow patches in the SLC7A11 transgenic sheep via testicular injection of transgene., 2012, 39(6): 281–285.

[35] Qin YR, Chen H, Zhang YN, Zhu CY, Gao B, Yin YH, Li W, Shi QQ, Zheng MM, Xu Q, Song JZ, Li BC. Cloning of the Xuhuai goat PPARγ gene and the preparation of transgenic sheep.,2013, 51(7–8): 543–553.

[36] Qin YR, Zhang YN, Yin YH, Xu F, Gao B, Shi QQ, Zhu CY, Li W, Li BC. Cloning of Xuhuai goat lipoprotein lipase gene and the preparation of transgenic sheep., 2012, 39(8): 8439–8446.

[37] Ritchie WA, King T, Neil C, Carlisle AJ, Lillico S, McLachlan G, Whitelaw CBA. Transgenic sheep designed for transplantation studies., 2009, 76(1): 61–64.

[38] Crispo M, Vilari?o M, dos Santos-Neto PC, Nú?ez- Olivera R, Cuadro F, Barrera N, Mulet AP, Nguyen TH, Anegón I, Menchaca A. Embryo development, fetal growth and postnatal phenotype of eGFP lambs generated by lentiviral transgenesis., 2015, 24(1): 31–41.

[39] Liu CX, Wang LQ, Li WR, Zhang XM, Tian YZ, Zhang N, He SG, Chen T, Huang JC, Liu MJ. Highly efficient generation of transgenic sheep by lentivirus accompanying the alteration of methylation status., 2013, 8(1): e54614.

[40] Li WR, He SG, Liu CX, Zhang XM, Wang LQ, Lin JP, Chen L, Han B, Huang JC, Liu MJ. Ectopic expression of FGF5s induces wool growth in Chinese merino sheep., 2017, 627: 477–483.

[41] Ritchie WA, King T, Neil C, Carlisle AJ, Lillico S, McLachlan G, Whitelaw CBA. Transgenic sheep designed for transplantation studies., 2009, 76(1): 61–64.

[42] Tian YZ, Li WR, Wang LQ, Liu CX, Lin JP, Zhang XM, Zhang N, He SG, Huang JC, Jia B, Liu MJ. Expression of 2A peptide mediated tri-fluorescent protein genes were regulated by epigenetics in transgenic sheep., 2013, 434(3): 681–687.

[43] Platt RJ, Chen SD, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas O, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Langer R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng GP, Sharp PA, Zhang F. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling., 2014, 159(2): 440–455.

[44] Bevacqua RJ, Fernandez-Martin R, Canel NG, Gibbons A, Texeira D, Lange F, Vans Landschoot G, Savy V, Briski O, Hiriart MI, Grueso E, Ivics Z, Taboga O, Kues WA, Ferraris S, Salamone DF. Assessing Tn5 and Sleeping Beauty for transpositional transgenesis by cytoplasmic injection into bovine and ovine zygotes., 2017, 12(3): e0174025.

[45] Hu SW, Ni W, Sai WJF, Zhang H, Cao XD, Qiao J, Sheng JL, Guo F, Chen CF. Sleeping Beauty-mediated knockdown of sheep myostatin by RNA interference., 2011, 33(10): 1949–1953.

[46] Rodriguez-Sosa JR, Silvertown JD, Foster RA, Medin JA, Hahnel A. Transduction and transplantation of spermatogonia into the testis of ram lambs through the extra-testicular rete., 2009, 44(4): 612–620.

[47] Zhang XM, Wang LQ, Wu YS, Li WR, An J, Zhang FC, Liu MJ. Knockout of myostatin by zinc-finger nuclease in sheep fibroblasts and embryos., 2016, 29(10): 1500–1507.

[48] Zhao XX, Ni W, Chen CF, Sai WJF, Qiao J, Sheng JL, Zhang H, Li GZ, Wang DW, Hu SW. Targeted editing of myostatin gene in sheep by transcription activator-like effector nucleases., 2016, 29(3): 413–418.

[49] Li HH, Wang G, Hao ZQ, Zhang GZ, Qing YB, Liu SH, Qing LL, Pan WR, Chen L, Liu GC, Zhao RP, Jia BY, Zeng LY, Guo JX, Zhao LX, Zhao H, Lv CX, Xu KX, Cheng WM, Li HS, Zhao HY, Wang W, Wei HJ. Generation of biallelic knock-out sheep via gene-editing and somatic cell nuclear transfer., 2016, 6: 33675.

[50] Han HB, Ma YH, Wang T, Lian T, Tian XZ, Hu R, Deng SL, Li KP, Wang F, Li N, Liu GS, Zhao YF, Lian ZX. One-step generation of myostatin gene knockout sheep via the CRISPR/Cas9 system.2014, 1(1): 2–5.

[51] Wang XL, Niu YY, Zhou JK, Yu HH, Kou QF, Lei AM, Zhao XE, Yan HL, Cai B, Shen QY, Zhou SW, Zhu HJ, Zhou GX, Niu WZ, Hua JL, Jiang Y, Huang XX, Ma BH, Chen YL. Multiplex gene editing via CRISPR/Cas9 exhibits desirable muscle hypertrophy without detectable off-target effects in sheep., 2016, 6: 32271.

[52] Williams DK, Pinzón C, Huggins S, Pryor JH, Falck A, Herman F, Oldeschulte J, Chavez MB, Foster BL, White SH, Westhusin ME, Suva LJ, Long CR, Gaddy D. Genetic engineering a large animal model of human hypophosphatasia in sheep., 2018, 8(1): 16945.

[53] Vilarino M, Rashid ST, Suchy FP, McNabb BR, van der Meulen T, Fine EJ, Ahsan SD, Mursaliyev N, Sebastiano V, Diab SS, Huising MO, Nakauchi H, Ross PJ. CRISPR/Cas9 microinjection in oocytes disables pancreas development in sheep., 2017, 7(1): 17472.

[54] Wu MM, Wei CH, Lian ZX, Liu RZ, Zhu CY, Wang HH, Cao JX, Shen YL, Zhao FP, Zhang L, Mu Z, Wang YY, Wang XG, Du LX, Wang CD. Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system., 2016, 6: 24360.

[55] Fan ZQ, Perisse IV, Cotton CU, Regouski M, Meng QG, Domb C, Van Wettere AJ, Wang ZD, Harris A, White KL, Polejaeva IA. A sheep model of cystic fibrosis generated by CRISPR/Cas9 disruption of the CFTR gene., 2018, 3(19): e123529.

[56] Zhang YN, Wang YJ, Bi YL, Tang BB, Wang M, Zhang C, Zhang WH, Jin J, Li TT, Zhao RF, Yu XJ, Zuo QS, Li BC. CRISPR/Cas9-mediated sheep MSTN gene knockout and promote sSMSCs differentiation., 2018.

[57] Zhou SW, Cai B, He C, Wang Y, Ding Q, Liu J, Liu Y, Ding YG, Zhao XE, Li GW, Li C, Yu HH, Kou QF, Niu WZ, Petersen B, Sonstegard T, Ma BH, Chen YL, Wang XL. Programmable base editing of the sheep genome revealed no genome-wide off-target mutations., 2019, 10: 215.

[58] Zhang XM, Li WR, Liu CX, Peng XR, Lin JP, He SG, Li XJ, Han B, Zhang N, Wu YS, Chen L, Wang LQ, Ma YL, Huang JC, Liu MJ. Alteration of sheep coat color pattern by disruption of ASIP gene via CRISPR Cas9., 2017, 7(1): 8149.

[59] Zhou SW, Yu HH, Zhao XE, Cai B, Ding Q, Huang Y, Li YX, Li Y, Niu YY, Lei AM, Kou QF, Huang XX, Petersen B, Ma BH, Chen YL, Wang XL. Generation of gene-edited sheep with a defined Booroola fecundity gene (FecBB) mutation in bone morphogenetic protein receptor type 1B (BMPR1B) via clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR- associated (Cas) 9., 2018, 30(12): 1616–1621.

[60] Zhang XM, Li WR, Wu YS, Peng XR, Lou B, Wang LQ, Liu MJ. Disruption of the sheep BMPR-IB gene by CRISPR/Cas9 in-produced embryos., 2017, 91: 163–172.e2.

[61] Menchaca A, Dos Santos-Neto PC, Souza-Neves M, Cuadro F, Mulet AP, Tesson L, Chenouard V, Guiffès A, Heslan JM, Gantier M, Anegón I, Crispo M. Otoferlin gene editing in sheepCRISPR-assisted ssODN- mediated homology directed repair., 2020, 10(1): 5995.

[62] Hu R, Fan ZY, Wang BY, Deng SL, Zhang XS, Zhang JL, Han HB, Lian ZX. Rapid communication: generation of FGF5 knockout sheepthe CRISPR/Cas9 system., 2017, 95(5): 2019–2024.

[63] Li WR, He SG, Liu CX, Zhang XM, Wang LQ, Lin JP, Chen L, Han B, Huang JC, Liu MJ. Ectopic expression of FGF5s induces wool growth in Chinese merino sheep.2017, 627: 477–483.

[64] Ma T, Tao JL, Yang MH, He CJ, Tian XZ, Zhang XS, Zhang JL, Deng SL, Feng JZ, Zhang ZZ, Wang J, Ji PY, Song YK, He PL, Han HB, Fu JC, Lian ZX, Liu GS. An AANAT/ASMT transgenic animal model constructed with CRISPR/Cas9 system serving as the mammary gland bioreactor to produce melatonin-enriched milk in sheep., 2017, 63(1).

[65] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions toI cleavage domain., 1996, 93(3): 1156–1160.

[66] Wolfe SA, Nekludova L, Pabo CO. DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins., 2000, 29: 183–212.

[67] Smith J, Berg JM, Chandrasegaran S. A detailed study of the substrate specificity of a chimeric restriction enzyme., 1999, 27(2): 674–681.

[68] Valerie K, Povirk LF. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair., 2003, 22(37): 5792–5812.

[69] Bibikova M, Golic M, Golic KG, Carroll D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis inusing zinc-finger nucleases., 2002, 161(3): 1169–1175.

[70] Miller J, McLachlan AD, Klug A. Repetitive zinc- binding domains in the protein transcription factor IIIA from., 1985, 4(6): 1609– 1614.

[71] Hwang WY, Fu YF, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JRJ, Joung JK. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system., 2013, 31(3): 227–229.

[72] Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage., 2016, 533(7603): 420–424.

[73] Rees HA, Liu DR. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells., 2018, 19(12): 770–788.

[74] Jin S, Zong Y, Gao Q, Zhu ZX, Wang YP, Qin P, Liang CZ, Wang DW, Qiu JL, Zhang F, Gao CX. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.2019, 364(6437): 292–295.

[75] Zuo EW, Sun YD, Wei W, Yuan TL, Ying WQ, Sun H, Yuan LY, Steinmetz LM, Li YX, Yang H. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos., 2019, 364(6437): 289–292.

[76] Batool A, Malik F, Andrabi KI. Expansion of the CRISPR/Cas genome-sculpting toolbox: innovations, applications and challenges., 2021, 25(1): 41–57.

[77] Liu JJ, Orlova N, Oakes BL, Ma EB, Spinner HB, Baney KLM, Chuck J, Tan D, Knott GJ, Harrington LB, Al-Shayeb B, Wagner A, Br?tzmann J, Staahl BT, Taylor KL, Desmarais J, Nogales E, Doudna JA. CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors., 2019, 566(7743): 218–223.

[78] Su HY, Jay NP, Gourley TS, Kay GW, Damak S. Wool production in transgenic sheep: results from first- generation adults and second-generation lambs., 1998, 9(2): 135–147.

[79] Zhang P, Liu P, Dou HW, Chen L, Chen LX, Lin L, Tan PP, Vajta G, Gao JF, Du YT, Ma RZ. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 Fatty acids., 2013, 8(2): e55941.

[80] Deng SL, Li GD, Yu K, Tian XZ, Wang F, Li WT, Jiang WQ, Ji PY, Han HB, Fu JC, Zhang XS, Zhang JL, Liu YX, Lian ZX, Liu GS. RNAi combining Sleeping Beauty transposon system inhibits ex vivo expression of foot-and-mouth disease virus VP1 in transgenic sheep cells., 2017, 7(1): 10065.

[81] Hanrahan JP, Gregan SM, Mulsant P, Mullen M, Davis GH, Powell R, Galloway SM. Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovis aries)., 2004, 70(4): 900–909.

[82] Zhang ZF, Sun YW, Du W, He SG, Liu MJ, Tian CY. Effects of vertebral number variations on carcass traits and genotyping of Vertnin candidate gene in Kazakh sheep., 2017, 30(9): 1234–1238.

[83] Valette M, Poitou C, Le Beyec J, Bouillot JL, Clement K, Czernichow S. Melanocortin-4 receptor mutations and polymorphisms do not affect weight loss after bariatric surgery., 2012, 7(11): e48221.

[84] Chmurzyńska A. The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): function, structure and polymorphism., 2006, 47(1): 39–48.

[85] Wang X, Niu Y, Zhou J, Zhu H, Ma B, Yu H, Yan H, Hua J, Huang X, Qu L, Chen Y. CRISPR/Cas9-mediated MSTN disruption and heritable mutagenesis in goats causes increased body mass., 2018, 49(1): 43–51.

[86] Guo RH, Wan YJ, Xu D, Cui LB, Deng MT, Zhang GM, Jia RX, Zhou WJ, Wang Z, Deng KP, Huang MR, Wang F, Zhang YL. Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISPR/Cas9 system., 2016, 6: 29855.

[87] Li GW, Zhou SW, Li C, Cai B, Yu HH, Ma BH, Huang Y, Ding YG, Liu Y, Ding Q, He C, Zhou JK, Wang Y, Zhou GX, Li Y, Yan Y, Hua JL, Petersen B, Jiang Y, Sonstegard T, Huang XX, Chen YL, Wang XL. Base pair editing in goat: nonsense codon introgression into FGF5 results in longer hair., 2019, 286(23): 4675–4692.

[88] Zhou WJ, Wan YJ, Guo RH, Deng MT, Deng KP, Wang Z, Zhang YL, Wang F. Generation of beta-lactoglobulin knock-out goats using CRISPR/Cas9., 2017, 12(10): e0186056.

[89] Niu YY, Zhao XE, Zhou JK, Li Y, Huang Y, Cai B, Liu YT, Ding Q, Zhou SW, Zhao J, Zhou GX, Ma BH, Huang XX, Wang XL, Chen YL. Efficient generation of goats with defined point mutation (I397V) in GDF9 through CRISPR/Cas9., 2018, 30(2): 307–312.

[90] Yu BL, Lu R, Yuan YG, Zhang T, Song SZ, Qi ZQ, Shao B, Zhu MM, Mi F, Cheng Y. Efficient TALEN-mediated myostatin gene editing in goats., 2016, 16(1): 26.

[91] Ni W, Qiao J, Hu SW, Zhao XX, Regouski M, Yang M, Polejaeva IA, Chen CF. Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system., 2014, 9(9): e106718.

[92] Hao F, Yan W, Li XC, Wang H, Wang YM, Hu X, Liu X, Liang H, Liu DJ. Generation of cashmere goats carrying an EDAR gene mutant using CRISPR-Cas9-mediated genome editing., 2018, 14(4): 427–436.

[93] Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares DL, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells., 2000, 407(6800): 86–90.

[94] Davis BT, Wang XJ, Rohret JA, Struzynski JT, Merricks EP, Bellinger DA, Rohret FA, Nichols TC, Rogers CS. Targeted disruption of LDLR causes hypercholestero-lemia and atherosclerosis in Yucatan miniature pigs.2014, 9(4): e93457.

[95] Yang DS, Yang HQ, Li W, Zhao BT, Ouyang Z, Liu ZM, Zhao Y, Fan NN, Song J, Tian JT, Li F, Zhang JF, Chang L, Pei DQ, Chen YE, Lai LX. Generation of PPARγ mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning., 2011, 21(6): 979–982.

[96] Feng C, Li XR, Cui HT, Long C, Liu X, Tian XH, Pan DK, Luo YZ. Highly efficient generation of GGTA1 knockout pigs using a combination of TALEN mRNA and magnetic beads with somatic cell nuclear transfer., 2016, 15(7): 1540–1549.

[97] Zou YL, Li ZY, Zou YJ, Hao HY, Li N, Li QY. An FBXO40 knockout generated by CRISPR/Cas9 causes muscle hypertrophy in pigs without detectable pathological effects., 2018, 498(4): 940–945.

[98] Wang HT, Shen LC, Chen JY, Liu XJ, Tan T, Hu YQ, Bai XF, Li YX, Tian KG, Li N, Hu XX. Deletion of CD163 exon 7 confers resistance to highly pathogenic porcine reproductive and respiratory viruses on pigs., 2019, 15(9): 1993–2005.

[99] Yu HH, Zhao H, Qing YB, Pan WR, Jia BY, Zhao HY, Huang XX, Wei HJ. Porcine zygote injection with Cas9/sgRNA results in DMD-modified pig with muscle dystrophy., 2016, 17(10): 1668.

[100] Whitworth KM, Benne JA, Spate LD, Murphy SL, Samuel MS, Murphy CN, Richt JA, Walters E, Prather RS, Wells KD. Zygote injection of CRISPR/Cas9 RNA successfully modifies the target gene without delaying blastocyst development or altering the sex ratio in pigs., 2017, 26(1): 97–107.

[101] Zhou XY, Wang LL, Du YN, Xie F, Li L, Liu Y, Liu CH, Wang SQ, Zhang SB, Huang XX, Wang Y, Wei H. Efficient generation of gene-modified pigs harboring precise orthologous human mutation via CRISPR/Cas9- induced homology-directed repair in zygotes., 2016, 37(1): 110–118.

[102] Park KE, Kaucher AV, Powell A, Waqas MS, Sandmaier SES, Oatley MJ, Park CH, Tibary A, Donovan DM, Blomberg LA, Lillico SG, Whitelaw CBA, Mileham A, Telugu BP, Oatley JM. Generation of germline ablated male pigs by CRISPR/Cas9 editing of the NANOS2 gene., 2017, 7: 40176.

[103] Appel MJ, van Veen HA, Vietsch H, Salaheddine M, Nuijens JH, Ziere B, de Loos F. Sub-chronic (13-week) oral toxicity study in rats with recombinant human lactoferrin produced in the milk of transgenic cows., 2006, 44(7): 964–973.

[104] Yu DW, Wang J, Zou HY, Feng T, Chen L, Li J, Qi XL, Li ZF, Duan XY, Xu CL, Zhang L, Long X, Lan J, Chen C, Wang C, Xu XY, Ren JL, Zhao YQ, Hu XX, Lian ZX, Men HS, Pan DD, Li N, Capecchi MR, Du XG, Zhao YF, Wu S. Silencing of retrotransposon-derived imprinted gene RTL1 is the main cause for postimplantational failures in mammalian cloning., 2018, 115(47): E11071–11080.

[105] Liu Z, Cai YJ, Wang Y, Nie YH, Zhang CC, Xu YT, Zhang XT, Lu Y, Wang ZY, Poo MM, Sun Q. Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer., 2018, 172(4): 881–887.e7.

[106] Liang S, Jin YX, Yuan B, Zhang JB, Kim NH. Melatonin enhances the developmental competence of porcine somatic cell nuclear transfer embryos by preventing DNA damage induced by oxidative stress., 2017, 7(1): 11114.

[107] Hashimoto M, Takemoto T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing., 2015, 5: 11315.

[108] Zhang YM, Wang QQ, Liu KL, Gao EE, Guan H, Hou J. Treatment of donor cells with recombinant KDM4D protein improves preimplantation development of clonedovine embryos., 2018, 70(5): 1469–1477.

[109] Appel MJ, van Veen HA, Vietsch H, Salaheddine M, Nuijens JH, Ziere B, de Loos F. Sub-chronic (13-week) oral toxicity study in rats with recombinant human lactoferrin produced in the milk of transgenic cows., 2006, 44(7): 964–973.

Application of genetic modification technologies in molecular design breeding of sheep

Haitao Wang1,2, Tingting Li3, Xun Huang1,2, Runlin Ma1,2,4, Qiuyue Liu1

Genetic modification technologies can be used for modifying animal genome to express exogenous genes or affect the function of endogenous genes. In animal breeding, genetic modification technologies allow the rapid generation of germplasms with beneficial traits. It includes traditional genetic modification, virus or sperm carrier-mediated genetic modification and nuclease-mediated genome editing, especially the CRISPR/Cas9, one of the artificial nuclease genome editing technologies, have been applied in genome editing in many domestic animals including sheep (). Compared with conventional strategies used for animal breeding, there is great value for sheep breeding improvement by using genome editing technology, which is more effective and timesaving. In this review, we summarize the approaches of genetic modification in sheep and discuss the possibility of molecular design and breeding of sheep by genome editing technologies. We also identify the potential bottlenecks and challenges of these technologies in sheep breeding.

sheep; genetic modification; genome editing; animal breeding

2021-03-08;

2021-04-14

中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(A類)(編號：XDA24030205)資助[Supported by the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No. XDA24030205)]

王海濤，博士，博士后，研究方向：農(nóng)業(yè)動物基因編輯。E-mail: wanght@genetics.ac.cn

馬潤林，博士，研究員，研究方向：免疫功能基因組學(xué)與免疫遺傳學(xué)。E-mail: rlma@ucas.ac.cn

劉秋月，博士，副研究員，研究方向：肉羊遺傳育種。E-mail: qyliu@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.21-087

2021/5/6 10:33:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210430.1638.002.html

(責任編委: 姜雨)