周煒程，李 銳*，張 亮，黃 菊

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院超聲科，重慶 401120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科 超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010)

近年來開發(fā)了多種特異性治療腫瘤方式[1-2]。在低pH的腫瘤微環(huán)境中，類芬頓反應(yīng)可通過金屬離子與過氧化氫(hydrogen peroxide， H2O2)發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡[3-4]，但腫瘤區(qū)域H2O2濃度過低可使類芬頓反應(yīng)無法達到預(yù)期效果；葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOx)可通過消耗被大量轉(zhuǎn)運的葡萄糖產(chǎn)生H2O2而解決上述問題[5-6]。本研究以聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)， PLGA]包裹四氧化三鐵(Fe3O4)和GOx，借助實體瘤的高通透性、滯留效應(yīng)及外部磁場吸引，使其到達腫瘤區(qū)域并釋放攜帶物，在消耗葡萄糖的同時誘導(dǎo)細胞死亡并增強光聲信號，為實現(xiàn)診療一體化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 PLGA(PLGA-COOH聚合比50∶50，濟南岱罡生物科技有限公司)，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol， PVA， Sigma)，異丙醇(iso-propyl alcohol， IPA， Sigma)，油酸改性Fe3O4納米粒(Ocean Nanotech)，GOx(Sigma)，考馬斯亮藍試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8， CCK-8，Dojindo)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO， Sigma)，3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine， TMB， Sigma)，2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate， DCFH-DA， Sigma)，人卵巢癌SKOV3細胞(中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所)。

Sonics 630-0435聲振儀，DF-101磁力攪拌器(上海增森儀器科技有限公司)，Synergy H1多功能酶標儀，Nikon Ti2倒置熒光顯微鏡，Malvern Zetasizer Nano ZS90光粒徑測量儀，Nikon A1+/A1R+共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy， CLSM)，Hitachi S-3400N電子顯微鏡，Visual Sonics Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)。

1.2 制備納米粒 以雙乳化法制備Fe3O4@PLGA-GOx納米粒。稱取50 mg PLGA，溶于3 ml二氯甲烷，充分溶解后加入100 μl Fe3O4溶液(17.61 mg/ml)及200 μl GOx溶液(50 mg/ml)，以100 W功率超聲混合3 min；加入4% PVA溶液8 ml，繼續(xù)超聲混合2.5 min；加入10 ml IPA溶液后，以磁力攪拌3 h；以雙蒸水多次離心洗滌，得到磁性Fe3O4@PLGA-GOx納米粒(Fe3O4@PLGA-GOx組)，4℃保存。以相同方法制備空白納米粒(PLGA組)、含F(xiàn)e3O4納米粒(Fe3O4@PLGA組)及含GOx納米粒(PLGA-GOx組)。

1.3 基本特性 采用馬爾文激光粒徑儀檢測磁性Fe3O4@PLGA-GOx納米粒粒徑及表面電位，光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡觀察Fe3O4@PLGA-GOx納米粒形態(tài)特征及其在水溶液中的分散情況；以振動樣品磁強計測量Fe3O4@PLGA-GOx磁滯曲線。于Fe3O4@PLGA-GOx溶液旁置磁鐵，判斷納米顆粒磁性。取提純離心后的Fe3O4@PLGA-GOx納米粒上清液，以電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry， ICP-AES)檢測Fe3O4含量，考馬斯亮藍法檢測GOx含量。計算Fe3O4、GOx的包封率及載藥量：包封率(%)=(總藥物含量-游離藥物量)/總藥物含量×100%；載藥量(%)=(總藥物含量-游離藥物量)/納米粒總投入量×100%。

1.4 體外穩(wěn)定性實驗 將Fe3O4@PLGA-GOx納米粒分別置于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)、10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基及模擬體液(simulate body fluid， SBF)中，于1、2、4、8、12、24及48 h后以馬爾文激光粒徑測量儀檢測其平均粒徑，繪制時間-平均粒徑曲線。

1.5 納米粒釋藥實驗 將5 ml Fe3O4@PLGA-GOx納米粒(10 mg/ml)置于截留分子量為200 kDa的透析袋中，以封口夾夾閉兩端，完全浸沒于含50 ml PBS的藍口瓶中，采用恒溫振蕩器持續(xù)振蕩(37℃，150 rpm)，并分別于0.125、0.25、0.5、1、2、3、6、9、12、24、36及48 h后取出1 ml透析液，于-20℃儲存，同時補充1 ml PBS；取樣完成后，以考馬斯亮藍法、ICP-AES法檢測GOx及Fe3O4含量，繪制時間-藥物釋放曲線。

1.6 監(jiān)測聯(lián)合催化活性 將4種納米粒分別溶于DMSO稀釋破乳，取25 μl混合液(0.2 mg/ml)分別加入孔板中，每孔加入25 μl TMB溶液(5 mg/ml)、100 μl醋酸緩沖液(pH 5.5)及50 μl葡萄糖溶液(10 mg/ml)。以酶標儀監(jiān)測生成物640 nm處光密度(optical density， OD)，間隔30 s，共監(jiān)測15 min。

1.7 細胞攝取實驗 體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞，取對數(shù)生長期細胞，以1×105個細胞/孔濃度接種于共聚焦皿中。分別于磁靶向和無磁靶向情況下將紅色熒光探針(1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate， DiI)標記的1 ml Fe3O4@PLGA-GOx納米粒(1 mg/ml)與細胞孵育4 h，待細胞攝取后以PBS沖洗，以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染料將細胞核染色20 min，去除染色液后以CLSM觀察。

1.8 檢測體外活性氧 體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞，取對數(shù)生長期細胞，以1×105個細胞/孔濃度接種于6孔板中。將細胞分為4份，分別加入各組納米粒溶液(0.2 mg/ml)1 ml，培養(yǎng)4 h后以PBS洗滌3次，加入DCFH-DA溶劑后孵育30 min，以熒光顯微鏡觀察活性氧產(chǎn)生情況，以流式細胞術(shù)定量檢測活性氧。

1.9 細胞毒性實驗 將離心洗滌后的各組納米粒以無血清培養(yǎng)基重懸，配成含20、40、60、80及100 μg/ml PLGA的納米粒溶液，分別與人卵巢癌SKOV3細胞共同孵育4 h，每組設(shè)置5個不同濃度復(fù)孔，加入CCK-8溶液染色1 h，采用酶標儀監(jiān)測450 nm處OD值，計算各濃度下細胞存活率：細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]× 100%，As：實驗孔的平均OD值(含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和納米粒溶液)，Ac：對照孔的平均OD值(含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含藥物)，Ab：空白孔的平均OD值(含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細胞、藥物)。此外，單獨計算磁靶向和無磁靶向時Fe3O4@PLGA-GOx組細胞生存率。

1.10 體外光聲顯像 稱取適量瓊脂，加入雙蒸水加熱并攪拌，待溶液內(nèi)氣泡消失后倒入200 μl槍頭盒中固定，冷卻后取出，得到帶孔凝膠模型。將Fe3O4@PLGA-GOx配成不同濃度(1、2、3、4及5 mg/ml)溶液，加入不同凝膠孔中，以等量PLGA-GOx組溶液為對照，采用光聲成像系統(tǒng)采集體外光聲圖，并對濃度-光聲信號進行線性擬合。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示計量資料，以單因素方差分析比較Fe3O4@PLGA-GOx納米粒與PLGA-GOx納米粒對細胞活性的影響差異；采用t檢驗評價外部磁場對Fe3O4@PLGA-GOx納米粒所致細胞活性影響的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本特性 制備的Fe3O4@PLGA-GOx納米粒外觀呈均勻黃褐色乳液，分散性好；光鏡及掃描電鏡下見納米粒大小均一，呈球形(圖1A、1B)，平均粒徑為(290.81±108.52)nm，表面電位(-18.41±5.90)mV；透射電鏡下見Fe3O4@PLGA-GOx納米粒殼有顯著突出的黑色鐵顆粒，偶見較小納米粒及游離鐵顆粒(圖1C)。上清液中Fe3O4的質(zhì)量為0.139 mg，F(xiàn)e3O4@PLGA-GOx上清液中GOx的質(zhì)量為7.353 mg，F(xiàn)e3O4包封率為(91.34±2.35)%，載藥量為(2.81±1.20)%；GOx包封率為(26.53±6.72)%，載藥量為(4.61±4.10)%。以振動樣品磁強計分別測定室溫下Fe3O4及Fe3O4@PLGA-GOx，將Fe3O4包埋于納米顆粒中，導(dǎo)致其飽和磁化強度從37.33 emu/g降至21.40 emu/g，但磁性并未完全消除(圖1D)。外部磁場作用下，F(xiàn)e3O4@PLGA-GOx納米粒沿磁場方向移動、聚集(圖1E)。

圖1 Fe3O4@PLGA-GOx納米粒基本性質(zhì) A.光學(xué)顯微鏡下； B.掃描電鏡下； C.透射電鏡下； D.磁滯曲線； E.施加外磁場后的納米粒溶液

2.2 穩(wěn)定性實驗 將Fe3O4@PLGA-GOx納米粒置于PBS、10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基溶液及SBF中48 h后，其粒徑無明顯變化(圖2)。

圖2 Fe3O4@PLGA-GOx納米粒體外穩(wěn)定性曲線 圖3 納米粒體外釋藥曲線 圖4 納米粒聯(lián)合催化活性 (PLGA與Fe3O4@PLGA曲線重合)

2.3 體外釋藥實驗 Fe3O4@PLGA-GOx納米粒中，GOx在0～6 h突釋，6 h后釋藥速度降低，48 h后藥物積累釋放率68.81%；Fe3O4在0～9 h突釋，12 h后釋藥速度降低，48 h后藥物積累釋放率62.12%(圖3)。

2.4 監(jiān)測聯(lián)合催化活性 PLGA組與Fe3O4@PLGA組在640 nm處OD值曲線為2條重合且基本不變的直線，PLGA-GOx組輕度上升，而Fe3O4@PLGA-GOx組迅速上升，隨時間推移而出現(xiàn)明顯平臺期(圖4)。

2.5 細胞攝取實驗 Fe3O4@PLGA-GOx納米粒的磁性特性使其通過外磁場在腫瘤區(qū)域聚集。施加外磁場后，紅色熒光在細胞核周圍的聚集程度明顯增強(圖5)。

圖5 細胞攝取實驗 A.施加磁靶向； B.無磁靶向 (紅色熒光為Fe3O4@PLGA-GOx納米粒)

2.6 檢測體外活性氧 熒光顯微鏡下，F(xiàn)e3O4@PLGA-GOx組可見較強熒光，且形狀大致與細胞相同；而PLGA-GOx組可見微弱熒光，F(xiàn)e3O4@PLGA組與PLGA組則未見熒光反應(yīng)(圖6)。流式細胞技術(shù)定量分析結(jié)果顯示,Fe3O4@PLGA-GOx組活性氧熒光強度83.66%，PLGA-GOx組為33.53%，F(xiàn)e3O4@PLGA組為10.26%，PLGA組為6.63%。

圖6 納米粒體外活性氧檢測圖 熒光顯微鏡下各組納米粒產(chǎn)生活性氧的明場成像及熒光成像

2.7 細胞毒性試驗 相同藥物質(zhì)量濃度條件下，F(xiàn)e3O4@PLGA-GOx組細胞生存率明顯低于其余3組(P均<0.05)，即其體外腫瘤細胞增殖抑制效率最高；隨藥物質(zhì)量濃度增加，PLGA、Fe3O4@PLGA組細胞生存率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，而Fe3O4@PLGA-GOx、PLGA-GOx組細胞生存率明顯下降，提示藥物質(zhì)量濃度越大，對細胞增殖的抑制作用越強(P均<0.05)，見表1。通過外部磁場吸引，F(xiàn)e3O4@PLGA-GOx組細胞生存率明顯下降(P均<0.05)，見表2。

表1 各組不同濃度納米粒與人卵巢癌細胞SKOV3共同孵育后的細胞生存率(n=5，±s，%)

表1 各組不同濃度納米粒與人卵巢癌細胞SKOV3共同孵育后的細胞生存率(n=5，±s，%)

注：*：與Fe3O4@PLGA-GOx組比較P<0.05

組別納米粒濃度(μg/ml)20406080100F值P值Fe3O4@PLGA GOx組43.60±2.9829.38±2.8620.42±1.2216.45±1.3312.20±1.43138.73<0.01Fe3O4@PLGA組80.30±2.38*80.57±0.96*82.06±1.13*82.69±2.65*81.65±2.78*0.900.49PLGA GOx組70.63±2.85*47.59±2.24*30.38±1.45*26.64±3.16*20.18±2.03*281.88<0.01PLGA組99.74±3.26*99.72±3.41*97.45±4.42*96.15±3.53*93.43±1.54*2.490.08F值262.40626.12941.27810.361703.97--P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01--

表2 磁靶向?qū)Σ煌瑵舛菷e3O4@PLGA-GOx細胞存活率的影響(n=5，±s，%)

表2 磁靶向?qū)Σ煌瑵舛菷e3O4@PLGA-GOx細胞存活率的影響(n=5，±s，%)

磁場納米粒濃度(μg/ml)2040無磁靶向43.60±2.9829.38±2.86磁靶向29.47±5.0519.05±7.15t值4.822.69P值<0.01<0.05

2.8 體外光聲顯像 680～970 nm激光輻照下，F(xiàn)e3O4顆粒及Fe3O4@PLGA-GOx納米粒均表現(xiàn)出較強光聲信號，并在700 nm處最高(圖7A)；持續(xù)以700 nm激光輻照納米粒，隨納米粒濃度由1 mg/ml增至5 mg/ml，F(xiàn)e3O4濃度(x)與光聲信號值(y)呈線性關(guān)系：y=0.442 4x+0.008，R2=0.99(圖7B)。PLGA-GOx納米粒溶液光聲信號較弱，且未見上述改變。

圖7 Fe3O4@PLGA-GOx納米粒光聲顯像圖 A.納米粒在680～950 nm激光范圍內(nèi)產(chǎn)生的光聲信號； B.納米粒產(chǎn)生的光聲信號與Fe3O4濃度的關(guān)系圖

3 討論

多數(shù)腫瘤細胞新陳代謝遠高于正常細胞，依賴于無氧呼吸產(chǎn)生能量的速度[7]；廣泛的無氧呼吸可降低生長環(huán)境的pH、過度活化葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白[5-6]?；诖?，針對GOx開發(fā)出多種治療腫瘤方法，如饑餓療法、缺氧激活療法及氧化療法等[8]，但均會消耗正常組織的葡萄糖而損傷正常細胞。如何在降低GOx濃度的同時保證療效成為難點。

短時間內(nèi)羥基自由基、超氧陰離子或H2O2等活性氧大量聚集可致周圍細胞損傷甚至凋亡[4]。低pH環(huán)境下，金屬離子可與H2O2發(fā)生類芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生大量羥基自由基[9]?？赏ㄟ^提高腫瘤環(huán)境中的H2O2濃度，以類芬頓反應(yīng)殺傷腫瘤細胞。

PLGA具備良好的生物安全性及攜帶能力[10-11]，可安全地將GOx、Fe3O4遞送至腫瘤區(qū)域。GOx可消耗腫瘤的過量葡萄糖，且其分解產(chǎn)物H2O2與Fe3O4發(fā)生類芬頓反應(yīng)可增強針對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，F(xiàn)e3O4所具備的等離子體特性還可用于高分辨率、高敏感度光聲成像[12]，于治療同時進行光聲監(jiān)控，實現(xiàn)診療一體化。

本研究成功制備了具有類芬頓反應(yīng)性能的磁靶向納米粒，電鏡下見球形表面存在黑色顆粒，證實Fe3O4被成功包裹于納米粒殼內(nèi)；GOx被成功裝載于磁性納米粒中，外部磁場吸引下，該納米?？上虼艌龇较蛞苿?。體外試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)e3O4@PLGA-GOx納米粒被人卵巢癌SKOV3細胞吞噬后，在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，氧化-TMB在640 nm處具有較強吸光度。相對于GOx消耗葡萄糖、“餓死”腫瘤細胞的能力，基于類芬頓反應(yīng)理論的聯(lián)合催化反應(yīng)能更有效地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，降低正常組織損傷；且低濃度下磁靶向可更好地聚集納米粒，以殺傷腫瘤細胞。以光聲信號最強的700 nm激光進行體外光聲成像，納米粒光聲信號隨濃度增加而增加，表明該納米粒具備光聲顯影能力。

綜上，本研究成功制備的磁性納米粒Fe3O4@PLGA-GOx能顯著增強體外光聲成像效果，并可于腫瘤特殊微環(huán)境下聯(lián)合催化，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。