魏 紅,沙玉柱,史 浩,呂衛(wèi)兵,羅玉柱,王繼卿,李少斌,胡 江,劉 秀

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，蘭州 730070)

藏綿羊是青藏高原最古老的綿羊品種，與蒙古羊、哈薩克羊并稱為中國三大粗毛羊品種，繁育在海拔3 000 m以上的青藏高原地區(qū)。藏綿羊?qū)η嗖馗咴母吆脱醐h(huán)境具有良好的適應(yīng)性，不但能夠在嚴酷的自然環(huán)境中健康生長和繁育，還能夠給當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤狻⒚?、燃料等生產(chǎn)和生活必須品，是當(dāng)?shù)啬撩窠?jīng)濟收入的主要來源，也是青藏高原重要的家畜品種和種質(zhì)資源。全年放牧是藏綿羊千百年來形成的傳統(tǒng)，盡管“暖牧冷飼”的飼養(yǎng)模式逐漸被牧民接受，但大多數(shù)地區(qū)還是以全年放牧為主，采食天然牧草是放牧藏綿羊獲取食物的主要來源，在漫長的冷季(10月-翌年4月)，藏綿羊只能通過啃食枯草來獲取營養(yǎng)物質(zhì)以滿足自身營養(yǎng)需要。面對青藏高原暖、冷季飼草供給存在的嚴重不均衡，藏綿羊如何應(yīng)對暖、冷季營養(yǎng)供給的巨大變化及冷季營養(yǎng)脅迫，解析這一科學(xué)問題是藏綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。

碳水化合物(Carbohydrate，CHOs)可被唾液和胰腺分泌的淀粉酶以及存在于腸上皮刷狀緣膜中的寡糖、二糖和三糖酶分解[4]，生成的單糖(葡萄糖、半乳糖和果糖)被腸道吸收，為機體提供能量。腸上皮組織的葡萄糖吸收方式有兩種，分別是鈉依賴葡萄糖共轉(zhuǎn)運體(SGLT1-Sodium glucose cotransporter)進行的主動轉(zhuǎn)運和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glucose transporters，GLUTs)進行的易化擴散。其中，鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白(SGLTs-Sodium glucose cotransporters)是小腸上皮細胞上攝取和轉(zhuǎn)運葡萄糖的主要載體，除小腸上皮細胞吸收葡萄糖外，瘤胃上皮細胞也能吸收部分葡萄糖[5]。表明瘤胃內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不僅被微生物降解為VFAs吸收，還有部分葡萄糖通過SGLT1基因被瘤胃上皮吸收，但暖、冷季藏綿羊瘤胃、小腸、大腸組織SGLT1基因的表達情況未見報道。

綜上所述，基于VFAs與SGLT1基因?qū)Ψ雌c動物進行能量輸送和調(diào)控中所發(fā)揮的重要作用，本研究以瘤胃上皮SGLT1基因表達與VFAs間的相關(guān)性研究為切入點，以期得到它們之間的相互聯(lián)系。從而為藏綿羊應(yīng)對暖、冷季營養(yǎng)供給嚴重不均衡以及冷季營養(yǎng)脅迫提供基礎(chǔ)，也為藏綿羊種質(zhì)資源保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

在甘肅省甘南藏族自治州合作市佐蓋曼瑪鄉(xiāng)(海拔3 300 m)同一牧戶羊群選取1周歲(±1月齡)、身體健康、體質(zhì)量相近(≤2 kg)、自然放牧狀態(tài)、沒有進行任何補飼的藏綿羊母羊12只。分別于7月中旬(2019年7月15日，代表暖季)和12月中旬(2019年12月15日，代表冷季)各采集6只藏綿羊瘤胃液以及組織樣。

瘤胃液采集：試驗羊只歸牧后，在次日早晨測量體質(zhì)量，利用羊用胃管式瘤胃采樣器采集瘤胃液，每只羊采集2管，并將樣品立刻放入準(zhǔn)備好的液氮罐中進行冷凍保存，帶回實驗室中進行 -80 ℃保存。

組織樣采集：每個時期分別屠宰6只藏綿羊進行腸道內(nèi)容物及組織樣品的采集。采用頸靜脈放血屠宰，立即取瘤胃、小腸(十二指腸)、大腸(盲腸)組織樣，將其分離出來，再用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水和PBS緩沖液將瘤胃、大腸、小腸的各個部位沖洗干凈，用吸水紙把樣品吸干，然后再分別取瘤胃、大腸、小腸部位樣各2 cm左右，放到 1.5 mL離心管中，然后將樣品立刻放入到準(zhǔn)備好的液氮罐中進行冷凍保存，帶回實驗室中進行 -80 ℃保存，以供后續(xù)分析。

1.2 VFAs測定

采用日本島津(GC-2010 plus)氣相色譜儀測定藏綿羊瘤胃VFAs，內(nèi)標(biāo)為2-乙基丁酸(2EB)，色譜柱為AT-FFAP(50 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細管柱。色譜柱升溫程序：溫度60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至115 ℃，不保留，再以15 ℃/min升至180 ℃，檢測器溫度260 ℃，進樣口溫度250 ℃。

1.3 總RNA提取和胃腸道組織cDNA合成

利用Trizol一步抽提法提取藏綿羊瘤胃、小腸、大腸組織總RNA，測定總RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，全部樣品的吸收比(A260/A280)在1.8～2.1。使用含有 gDNA Wiper酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 設(shè)計與合成引物

從NCBI中搜索出綿羊SGLT1基因的 mRNA序列(GenBank No：NM_000343.4)，利用Premier 5.0設(shè)計SGLT1基因擴增引物，引物信息(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 SGLT1基因Real-time PCR擴增

以β-Actin為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex,ABI,美國)進行SGLT1基因及內(nèi)參基因熒光定量，反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；每次循環(huán)的最后一步收集SYBR green熒光信號，溶解曲線(95 ℃ 15s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15s)。反應(yīng)體系：20 μL體系，含有2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix， cDNA模板和上下游引物。以β-Actin為內(nèi)參基因進行校正。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。VFAs含量進行獨立樣本t檢驗，SGLT1基因表達量，以β-Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT的方法計算相對表達量。瘤胃VFAs與SGLT1基因組織表達進行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs測定結(jié)果

藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs測定結(jié)果顯示(表2)，藏綿羊瘤胃在冷季的總VFA含量顯著高于暖季(P<0.05)，除丁酸外，其他VFA含量在暖、冷季均差異顯著(P<0.05)。冷季的乙酸、丙酸含量均顯著高于暖季(P<0.05)，異丁酸、異戊酸、戊酸的含量為暖季顯著高于冷季(P<0.05)，丁酸在暖、冷季差異不顯著(P>0.05)。另外，冷季乙酸/丙酸(A/P)值顯著高于暖季(P<0.05)。

表2 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs含量測定結(jié)果Table 2 Determination of VFAs concentration in rumen of Tibetan sheep in warm and cold seasons

2.2 藏綿羊暖、冷季胃腸道 SGLT1基因表達特征

通過對藏綿羊暖、冷季胃腸道組織(瘤胃、小腸、大腸)SGLT1基因進行實時熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)(圖1)，藏綿羊暖、冷季胃腸道組織的SGLT1基因表達存在顯著性差異(P<0.05)。其中，暖季的瘤胃、小腸、大腸組織的SGLT1基因表達量顯著高于冷季(P<0.05)，同一季節(jié)不同腸道組織的SGLT1基因表達也存在一定差異，表現(xiàn)為：小腸組織>瘤胃組織>大腸組織。藏綿羊小腸組織的SGLT1基因表達量顯著高于瘤胃和大腸組織(P<0.05)，在暖、冷季無差異。其中，暖季比冷季小腸組織的表達量高出1.8倍。

2.3 藏綿羊瘤胃VFAs與 SGLT1基因之間相關(guān)性分析

藏綿羊瘤胃VFAs和SGLT1基因之間存在一定的相關(guān)性(表3)，其中，乙酸、丙酸與SGLT1基因呈顯著性負相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)均大于0.9；異丁酸、異戊酸、戊酸與SGLT1基因呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)均在0.98以上。另外，6種VFA之間也存在一定的相關(guān)性，除丁酸外，其他VFA之間的相關(guān)性均差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs含量分布特征

VFAs既是碳水化合物在瘤胃中的終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物生長所需的重要碳架和能量來源，能夠維持正常的瘤胃內(nèi)環(huán)境[6]。瘤胃VFAs含量和組成受日糧、飼料加工處理、瘤胃微生物、瘤胃PH等因素的影響[7]。在本研究中，藏綿羊在冷季的VFAs含量顯著高于暖季(P<0.05)，其中，冷季的乙酸和丙酸的含量顯著高于暖季 (P<0.05)，可能是由于暖季飼草料豐富、營養(yǎng)價值高，為瘤胃微生物生長提供了充足養(yǎng)分，為產(chǎn)甲烷菌生長增殖提供了充足氮源。瘤胃內(nèi)纖維分解菌生長增殖快，纖維分解效果大大提高，為產(chǎn)甲烷菌的生長增殖提供了充足的氫源，產(chǎn)甲烷菌與產(chǎn)乙酸菌競爭氫生成甲烷或乙酸[8]。反芻動物主要的排氫途徑是在瘤胃內(nèi)生成甲烷。因此，暖季瘤胃內(nèi)甲烷含量高，導(dǎo)致乙酸含量降低。Fonty等[9]研究發(fā)現(xiàn)，有產(chǎn)甲烷菌的羔羊氫利用能力高達90%以上，無產(chǎn)甲烷菌時羔羊的氫利用能力降低，僅為28%～46%。在正常生長的羔羊瘤胃發(fā)酵過程中，乙酸的產(chǎn)生僅占一小部分，但在無產(chǎn)甲烷菌時則占瘤胃發(fā)酵的21%～25%[10]。由于冷季飼草養(yǎng)分質(zhì)量低，產(chǎn)甲烷菌不能獲得足夠的養(yǎng)分，限制產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖，因而冷季產(chǎn)甲烷菌數(shù)量明顯低于其他季節(jié)[11]，以致冷季的乙酸含量高于暖季。另外，異丁酸、異戊酸、戊酸的含量為暖季顯著高于冷季(P<0.05)，主要是因為VFAs中異丁酸和異戊酸是由蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的[12]。藏綿羊在暖季可以采食能量和蛋白質(zhì)含量較高的牧草，瘤胃中可利用碳水化合物充足，氨利用率高，蛋白質(zhì)合成強度大，從而導(dǎo)致異丁酸、異戊酸等暖季含量大于冷季。研究發(fā)現(xiàn)，不管是冷季還是暖季，乙酸的含量都較高，約占VFA總產(chǎn)量的70%～75%[13]，主要是因為乙酸是反芻動物新陳代謝的主要能量來源。同時，乙酸通過葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑代謝和葡萄糖存在依賴關(guān)系[14]。丙酸是唯一生成葡萄糖的VFA，是肝臟組織中糖異生的重要葡萄糖前體，在經(jīng)瘤網(wǎng)胃壁吸收過程中為肌肉組織提供能量[15]。冷季的A/P值顯著高于暖季(P<0.05)，且A/P值均在 1～3，從能量利用的角度看，A/P比值越低，對飼料能量利用效率越高，放牧藏綿羊冷季的A/P值高于暖季，說明放牧藏綿羊?qū)ζ淠敛莸睦眯瘦^高。綜上所述，藏綿羊為應(yīng)對冷季營養(yǎng)物質(zhì)嚴重匱乏，進化出了較強的能量適應(yīng)機制。

3.2 藏綿羊暖、冷季胃腸道 SGLT1基因表達 特征

致使暖季SGLT1基因表達量遠高于冷季的原因較多[16-17]，如季節(jié)、日糧、饑餓狀況、Na+攝入水平、激素水平、炎癥、應(yīng)激、腸黏膜上皮細胞沿腸絨毛軸的分化及其細胞周期等[18]。本研究中，小腸組織中的SGLT1基因表達量均顯著高于瘤胃和大腸組織(P<0.05)，小腸上皮細胞上攝取和轉(zhuǎn)運葡萄糖的主要載體是SGLTs，介導(dǎo)腎臟和腸道中葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運，所以小腸的SGLT1基因表達量較高。藏綿羊暖季瘤胃、小腸、大腸組織的SGLT1基因表達量顯著高于冷季(P< 0.05)，這可能與全年放牧有關(guān)，由于冷季飼草匱乏，個體之間存在更激烈的覓食競爭，導(dǎo)致個體在獲取飼料資源方面存在更大的差異。隨著暖季食物可得性的增加，個體采食競爭減小、飼草料豐富且營養(yǎng)價值較高[19]，以及暖季牧草中的含糖量顯著高于冷季[20-21]。景小平等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胃腸道里面的葡萄糖含量慢慢增加時，SGLT1基因也在增加，進而可以讓胃腸道對葡萄糖的吸收效率得到較大的提高，且葡萄糖含量越高，SGLT1基因的活性和效率越高，所以，暖季胃腸道SGLT1基因表達量高于冷季。另外，盧垚等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，在漫長的冷季，由于寒冷的氣候，藏綿羊發(fā)生炎癥的幾率增大，受到的應(yīng)激變大，所以冷季SGLT1基因表達量較低。王修啟等[23]、倫志國[24]研究表明，由于過瘤胃葡萄糖的作用，導(dǎo)致瘤胃中的葡萄糖以某種方式保護起來，使其在反芻家畜瘤胃內(nèi)不易被降解，而直接進入瘤胃后消化系統(tǒng)(主要是小腸)進行消化、吸收和利用，所以導(dǎo)致小腸的SGLT1基因表達量最高。但本研究主要針對暖、冷季的瘤胃SGLT1基因的表達特征進行分析，雖說瘤胃中大部分葡萄糖直接進入后消化系統(tǒng)進行消化吸收或者直接被發(fā)酵為VFAs，但是，在暖季牧草量充足的情況下，瘤胃組織直接將多余的葡萄糖通過SGLT1蛋白轉(zhuǎn)運進入血液，節(jié)約了發(fā)酵所需的能量[25]。此外，暖季瘤胃SGLT1基因表達量顯著高于大腸組織(P<0.05)。瘤胃中的SGLT1基因吸收葡萄糖，降低反芻動物前胃葡萄糖濃度，可改善或預(yù)防反芻動物乳酸酸中毒。有研究認為[26]，反芻動物對碳水化合物的消化吸收主要是由其在瘤胃中轉(zhuǎn)化為VFAs的轉(zhuǎn)化效率來決定的，趙小剛等[27]研究證實，瘤胃上皮SGLT1基因的轉(zhuǎn)錄和功能性表達水平對反芻動物利用葡萄糖也具有很大的影響。因此，對研究胃腸道葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控具有重要意義。

3.3 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs與 SGLT1基因之間的相關(guān)性

進一步評估VFAs與SGLT1基因表達之間的相關(guān)性，可以發(fā)現(xiàn)乙酸、丙酸與SGLT1基因呈顯著性負相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)均大于 0.9，異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸與瘤胃上皮的SGLT1基因之間呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)。如前所述，在反芻動物中，日糧的碳水化合物發(fā)酵成VFAs主要由瘤胃微生物發(fā)酵，通過瘤胃上皮吸收，在肝臟中被用于糖異生來為動物提供能量，部分瘤胃沒有發(fā)酵消化的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物、葡萄糖及與微生物相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以經(jīng)SGLT1基因介導(dǎo)直接被瘤胃上皮吸收進入血液中，在血液中供機體使用，剩余的蛋白質(zhì)被小腸再次吸收，在小腸消化酶的作用下，進一步變?yōu)樾‰?、氨基酸和單糖轉(zhuǎn)運載體[28]。因此，到達小腸的單糖量減少，隨著到達小腸的單糖含量降低，小腸的SGLT1基因含量和mRNA水平均顯著降低，表明VFAs與SGLT1基因之間存在著一定的關(guān)聯(lián)。有研究表明[5]，營養(yǎng)物質(zhì)不僅僅以VFAs的形式被瘤胃上皮吸收，還有部分葡萄糖直接被瘤胃上皮SGLT1基因介導(dǎo)吸收進入血液；此外，反芻動物體內(nèi)葡萄糖相對于VFAs的能量值遠高于單胃動物，這是因為反芻動物幾乎完全依賴葡萄糖糖異生來滿足其對葡萄糖的需求[29]。通過SGLT1基因直接攝取葡萄糖可以減少動物糖異生的代謝消耗[30]。在漫長的冷季，飼草料嚴重匱乏，藏綿羊通過高產(chǎn)量的VFAs以維持自身新陳代謝和提供能量。并且在SGLT1基因的作用下，有效調(diào)節(jié)了胃腸道內(nèi)葡萄糖含量的波動。因此，探討藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs與SGLT1基因的相互調(diào)控作用，從而為藏綿羊應(yīng)對暖、冷季營養(yǎng)供給嚴重不均衡以及冷季營養(yǎng)脅迫提供基礎(chǔ)，也為藏綿羊種質(zhì)資源保護提供 參考。

4 結(jié) 論

放牧藏綿羊瘤胃中的VFAs含量在冷季顯著高于暖季(P<0.05)。除丁酸外，其他VFA在暖、冷季均存在顯著性差異(P<0.05)。對放牧藏綿羊瘤胃、大腸、小腸SGLT1基因的表達量測定發(fā)現(xiàn)，藏綿羊暖季的瘤胃、大腸和小腸SGLT1基因的表達量顯著高于冷季(P<0.05)，在暖、冷相同的季節(jié)中小腸組織的SGLT1的基因表達量最高。對藏綿羊瘤胃VFAs與SGLT1基因表達間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酸與SGLT1基因表達呈顯著性負相關(guān)(P<0.05)，異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸與瘤胃上皮的SGLT1基因之間呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)。