初洪波，劉 聰，劉艷華，成光宇*

（1.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

本研究采用CO2超臨界流體萃取技術提取傳統(tǒng)中藥薄荷、陳皮、辛夷和人參花中的揮發(fā)油類成分制成醒腦提神1 號香薰產品[1-4]。

1 材料與儀器

粉碎設備：高速中藥粉碎機（HX-400A，浙江永康溪岸）；超聲設備：超聲波清洗器（KH-250D，江蘇昆山禾創(chuàng)）；萃取設備：（HA-221-50-05-C，南通華安超臨界萃取有限公司）；稱量儀器：電子分析天平（CP225D，德國賽多利斯）；薄層色譜成像系統(tǒng):瑞士CAMAG 公司。試劑、對照品和對照藥材：試劑均為分析純；陳皮對照藥材，批號：120969-201806、辛夷（望春花）對照藥材，批號：121079-201710。供試樣品：醒腦提神1 號（批號：20200601）、樣品2（批號：20200602）、樣品3（批號：20200603）。

2 制備工藝

2.1 醒腦提神香薰1 號的制備工藝 稱取過10 目篩的藥材粉末100 g（重量比為薄荷:陳皮:辛夷:人參花=1:1:1:1），置于萃取釜內進行超臨界萃取。通過單因素考察及正交試驗選擇最佳萃取條件[5-8]。采用走珠瓶的形式，通過提神強弱、提神持久性、香味好感度、透明度進行感官判斷，確定了配方比例。

2.1.1 單因素的考察

2.1.1.1 萃取壓力 萃取溫度50℃，流量為20 L/h，時間為2 h。稱取藥材6 份，每份100 g（重量比為薄荷:陳皮:辛夷:人參花=1:1:1:1），粉碎過10 目篩。第1次為15 MPa，2 至5 次每次增加5 MPa 測定測定揮發(fā)油重量，第6 次為40 MPa，計算每次揮發(fā)油得率。萃取壓力對揮發(fā)油得率影響的結果見圖1。

圖1 萃取壓力對揮發(fā)油得率的影響

選擇30 MPa 為最佳萃取壓力，分析其原因：CO2超臨界流體萃取時，由于壓力的上升使CO2密度增大，萃取效率提高，故在15 MPa 至30 MPa 的區(qū)間，揮發(fā)油得率呈上升趨勢。但當壓力超過30 MPa 以后，CO2流體密度就一步增大，使其擴散減小，進而減少CO2流體與藥材之間的接觸，故在30 MPa至40 MPa的區(qū)間，揮發(fā)油得率呈下降趨勢。

2.1.1.2 萃取溫度（萃取壓力30 MPa，流量為20 L/h，萃取時間為2 h）稱取藥材6 份，每份100 g（薄荷:陳皮:辛夷:人參花重量比為=1:1:1:1），粉碎過10目篩。第1 次為40℃，2 至5 次每次增加5 ℃測定測定揮發(fā)油重量，第6 次為65 ℃，計算每次揮發(fā)油得率。萃取溫度對揮發(fā)油得率影響的結果見圖2。

圖2 萃取溫度對揮發(fā)油得率的影響

選擇55℃為最佳萃取溫度，分析其原因：CO2超臨界流體萃取時，由于溫度的上升使CO2超臨界流體粘度下降，擴散增大，萃取效率提高，故在 40 ℃至55 ℃的區(qū)間，揮發(fā)油得率呈上升趨勢。但當溫度超過55 ℃以后，CO2流體密度進一步降低，導致對揮發(fā)油的溶解度降低，故在55 ℃至65 ℃的區(qū)間，揮發(fā)油得率呈下降趨勢。

2.1.1.3 萃取時間 萃取壓力30 MPa，流量為20 L/h，萃取溫度為50 ℃。稱取藥材6 份，每份100 g（重量比為薄荷:陳皮:辛夷:人參花=1:1:1:1），粉碎過20 目篩。第1 次為1 h，2 至5 次每次增加0.5 h 測定測定揮發(fā)油重量，第6 次為3.5 h，計算每次揮發(fā)油得率。萃取時間對揮發(fā)油得率影響的結果見圖3。

圖3 萃取時間對揮發(fā)油得率的影響

選擇2.5 h 為最佳萃取時間，分析其原因：在流量恒定時，CO2超臨界流體萃取時，隨著萃取時間的延長，產率也相應的增大，故在1 h 至2.5 h 的區(qū)間，揮發(fā)油得率呈上升趨勢。但當時間超過2.5 h 以后，醒腦提神方中的揮發(fā)油基本萃取完全，所以揮發(fā)油得率變化不顯著。

2.1.2 正交試驗 在單因素考察的基礎上，需要進行正交試驗，按L9（34）設計試驗，進一步考察在壓力、溫度、時間的作用下，對揮發(fā)油得率的影響。（表1、表2、表3 分別是因素水平設計和結果）

表1 正交試驗因素水平表

表2 CO2 超臨界流體萃取揮發(fā)油正交試驗直觀分析結果

表3 CO2 超臨界流體萃取油正交試驗方差分析結果

從表2（直觀分析）的結果，確定工藝中的萃取壓力、萃取溫度和萃取時間分別為30 Mpa、60 ℃和2.5 h，即A2B3C2。

從表3（方差分析）的結果可知，影響因素的主次關系依次為萃取壓力（因素A）、萃取溫度（因素B、萃取時間（因素C），萃取時間（因素B）沒有顯著性影響。從節(jié)約能源出發(fā)，確定工藝的萃取壓力、萃取溫度和萃取時間分別為30 Mpa、60 ℃和2 h，即A2B3C1。

綜合表2 和表3 的結果，確定醒腦提神方中揮發(fā)油提取工藝條件的萃取壓力、萃取溫度和萃取時間分別為30 Mpa、60 ℃和2 h。

2.1.3 驗證試驗 取過10目篩的醒腦提神方藥粉100 g，共3 份，按確定的工藝條件，測定揮發(fā)油得率。（結果見表4）。

表4 驗證試驗結果

揮發(fā)油的平均得率為3.87%，RSD 為1.55，證明了工藝條件的合理性和穩(wěn)定性。

3 醒腦提神1 號的制劑成形性研究

3.1 劑型的選定 醒腦提神1 號香薰產品采用走珠瓶的形式，具有結構簡單，攜帶和使用方便，涂抹均勻，并能通過走珠配合穴位按摩，兼具通鼻清涼和提神醒腦的作用。

3.2 原料的配比 為了更好地吸收和增加清涼感，醒腦提神1 號香薰產品還加入了適量的冰片和乙醇。同時純的植物精油不能直接用于皮膚表面，又加入了抗氧化強的葡萄籽油作為基礎油來稀釋超臨界提取的復方精油。從提神強弱、提神持久性、香味好感度、透明度等4 個方面進行復方精油的感官判斷，確定CO2超臨界流體萃取的復方精油配方比例為：0.5%冰片乙醇溶液:超臨界提取揮發(fā)油:葡萄籽油=1:2:20[9-11]。

4 鑒別方法

4.1 陳皮的薄層鑒別 供試品溶液制備 取醒腦提神1 號內容液20 mL，置250 mL 圓底燒瓶中，加水150 mL，連接揮發(fā)油測定器，測定器上端加水（充滿刻度并溢流入燒瓶），加乙酸乙酯2 mL 至測定器，連接回流冷凝管，加熱回流2 h，分取乙酸乙酯層。對照藥材溶液制備：取陳皮對照藥材1 g，加乙醚10 mL，超聲處理10 min，濾過，揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解。陰性對照溶液制備：先根據(jù)處方稱取藥材，制成不含陳皮的陰性對照樣品，然后根據(jù)供試品溶液的制備方法制成。點樣量：吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上。展開劑：正己烷-醋酸乙酯（9:1）為展開劑。顯色方式：置紫外光燈（365 nm）下檢視。層析結果見圖4。

圖4 陳皮薄層鑒別

4.2 辛夷的薄層鑒別 供試品溶液制備 取醒腦提神1號20 mL，置250 mL 圓底燒瓶中，加水150 mL，連接揮發(fā)油測定器，測定器上端加水（充滿刻度并溢流入燒瓶），加乙酸乙酯2 mL 至測定器，連接回流冷凝管，加熱回流2 h，分取乙酸乙酯層。對照藥材溶液制備：取辛夷對照藥材1 g，加乙醚10 mL，超聲處理10 min，濾過，揮干，殘渣加環(huán)己烷1 mL 使溶解。陰性對照溶液制備：先根據(jù)處方稱取藥材，制成不含辛夷的陰性對照樣品，然后根據(jù)供試品溶液的制備方法制成。點樣量：吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254 薄層板上。展開劑：環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（11:2:0.2）。顯色方式：置紫外光燈（254 nm）下檢視。層析結果見圖5。

圖5 辛夷薄層鑒別

5 小結

醒腦提神1 號香薰產品確定了最佳的超臨界萃取工藝，香薰產品包裝采用走珠瓶，其結構簡單，攜帶使用方便，涂抹均勻并能穴位按摩，具有通鼻清涼和提神醒腦的作用。代表性藥材的薄層色譜鑒別專屬性及重現(xiàn)性良好。所制得的醒腦提神1 號香薰產品氣味清新，配比天然，提神醒腦效果好[12-16]。