張 宇， 劉來(lái)俊， 焦勇杰， 李超婧， 王富軍， 王 璐

(東華大學(xué) a.紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； b.產(chǎn)業(yè)用紡織品教育部工程研究中心； c.紡織學(xué)院， 上海 201620)

臨床上在治療因創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除造成的骨缺損、骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎等骨科疾病時(shí)，通常采用自體骨、異體骨以及合成移植物進(jìn)行骨組織重建[1]。自體移植盡管是移植手段中的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但健康移植物數(shù)量有限，且供體部位易發(fā)生損傷；異體移植則存在感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)；合成移植物能夠很好地彌補(bǔ)前兩者的應(yīng)用缺陷，因此受到了廣泛的關(guān)注[2-3]。隨著組織工程的提出，骨修復(fù)研究取得了重大進(jìn)展[4]。骨和軟骨組織工程旨在通過(guò)生物材料、細(xì)胞和生長(zhǎng)因子協(xié)同組合誘導(dǎo)新的功能性骨再生[5]，其中的關(guān)鍵組件是為新生組織提供結(jié)構(gòu)支持的支架。

骨組織和軟骨組織分別是骨和軟骨的結(jié)構(gòu)主體，屬于固態(tài)結(jié)締組織，但兩者在硬度上存在顯著差異。骨基質(zhì)包括無(wú)機(jī)成分(約65%，主要以羥基磷灰石結(jié)晶形式存在)和有機(jī)成分(約35%，主要為I型膠原纖維)[6]；軟骨基質(zhì)則由以蛋白聚糖和水為主的無(wú)定形基質(zhì)以及包埋在其中的膠原纖維構(gòu)成[7]。組織工程纖維基支架通常指結(jié)構(gòu)中包含微、納米纖維的支架，與非纖維支架相比，其具有較高的比表面積、一定的力學(xué)強(qiáng)度和可控的結(jié)構(gòu)，因此可以很好地模擬骨和軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖[8-10]。支架的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能直接影響其植入后的修復(fù)效果，因此對(duì)支架成型方法的研究顯得至關(guān)重要[11]，不僅需要調(diào)控纖維基支架的宏觀(guān)結(jié)構(gòu)以適應(yīng)缺損部位，還需要對(duì)其微觀(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的吸附能力和細(xì)胞活性，從而改善成骨化、血管化以及軟骨再生效果，推動(dòng)其在臨床治療上的應(yīng)用擴(kuò)展。

1 纖維基支架的成型方法及應(yīng)用

支架作為細(xì)胞增殖和ECM沉積的臨時(shí)基質(zhì)，高度參與組織的再生和功能重建過(guò)程，其剛度決定組織的最終形態(tài)，即骨組織或軟骨組織[12]。理想的組織工程支架需要考慮材料的宏/微觀(guān)結(jié)構(gòu)、表面性質(zhì)、孔隙率和孔徑、界面相互作用、生物相容性、生物降解性和力學(xué)性能等要素[13]，然后根據(jù)支架的綜合性能需求選擇合適的成型方法。目前纖維基支架的制備方法包括靜電紡絲法、熱致相分離法、自組裝肽法和溶劑熱法等，表1總結(jié)了骨和軟骨組織工程中上述制備方法適用的材料及其優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 纖維基支架常用的成型方法

1.1 靜電紡絲法

靜電紡絲法的原理是利用聚合物熔體或溶液在高壓電場(chǎng)作用下噴射、牽伸形成納米纖維，基于該方法制備的納米纖維支架已在組織工程各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[41]。靜電紡支架具有與天然ECM相似的結(jié)構(gòu)、較高的孔隙率和極大的比表面積，并且支架的厚度、力學(xué)性能、生物學(xué)性能可控，原料來(lái)源廣泛[42]。通過(guò)改變納米纖維的材料[43]、表面形貌[41]、核殼結(jié)構(gòu)[44]、取向排列[45]等可以對(duì)支架性能進(jìn)行調(diào)控[46-48]，從而改善支架的骨修復(fù)效果。然而，靜電紡支架通常難以控制孔隙率和孔隙的形狀，而較小的孔徑不利于細(xì)胞的長(zhǎng)入，并且二維的纖維膜難以與三維的骨缺損部位相匹配，力學(xué)性能較差[29]。Cai等[49]利用EYA(electrospinning-based yarn assembly)技術(shù)制備出靜電紡PLLA/PCL取向納米纖維3D大孔支架，結(jié)果表明，該支架具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和相互連接的微孔，可為細(xì)胞的向內(nèi)生長(zhǎng)和骨組織形成提供模板。Lee等[20]利用乳酸輔助制備靜電紡PLLA/β-三磷酸鈣(tricalcium phosphate，TCP)纖維支架，結(jié)果表明：?jiǎn)误w乳酸包含帶負(fù)電的羧基導(dǎo)致紡絲噴嘴強(qiáng)烈排斥，從而產(chǎn)生蓬松且高度多孔的納米纖維網(wǎng)；與2D支架的無(wú)穿透性纖維膜相比，接種在蓬松纖網(wǎng)上的細(xì)胞在整個(gè)支架深度中均有所浸潤(rùn)，細(xì)胞活性明顯更高。利用靜電紡絲法制備3D支架的研究除了對(duì)紡絲設(shè)備進(jìn)行改造外，應(yīng)用更多的是將靜電紡絲與其他方法結(jié)合，從而構(gòu)建理想的三維多孔結(jié)構(gòu)。

1.2 熱致相分離法

Ma等[33]以四氫呋喃為溶劑通過(guò)熱致相分離(thermally-induced phase separation， TIPS)法率先制備出仿天然ECM的PLLA納米纖維支架，這種方法通常涉及聚合物溶解、相分離和凝膠化、溶劑萃取、冷凍、真空冷干等5個(gè)步驟。TIPS的原理如圖1所示，在較高溫度下將聚合物均勻溶解到溶劑中，然后降溫冷卻，冷卻過(guò)程中均相溶液分離為富聚合物相和貧聚合物相，隨后通過(guò)冷凍干燥或冷凍萃取程序除去溶劑得到納米纖維支架[50]。纖維網(wǎng)絡(luò)的形成主要取決于聚合物溶液的溶劑和凝膠溫度，以這種方式制得的纖維直徑從50 nm到500 nm不等，孔隙率高達(dá)98%[35]。Wang等[34]采用TIPS技術(shù)制備了具有大孔和納米纖維結(jié)構(gòu)的PLLA/PLGA/PCL支架，并將骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2負(fù)載的PLGA微球摻入支架中，結(jié)果表明，含BMP-2的復(fù)合支架可在體內(nèi)顯著促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)，從而改善膠原蛋白的形成，刺激成骨細(xì)胞的成熟并加快缺損

(a) TIPS各相的示意圖

(b) TIPS納米纖維SEM圖[51]

部位骨的形成。由傳統(tǒng)TIPS技術(shù)制得的支架通常孔徑較小，這不利于其在骨組織工程中的應(yīng)用[30]。Chen等[52]使用濁點(diǎn)熱致相分離法利用PLLA/1，4-二氧雜環(huán)己烷/H2O三元體系制備出具有孔徑為300 μm以上大孔的PLLA支架，經(jīng)丙酮處理并浸入殼聚糖溶液進(jìn)行改性，在增加孔徑的同時(shí)保持支架的納米纖維結(jié)構(gòu)。雖然TIPS制備方法簡(jiǎn)單，但是通常制得的支架力學(xué)性能較差，可結(jié)合其他處理技術(shù)通過(guò)控制支架的微觀(guān)和宏觀(guān)結(jié)構(gòu)加以改善[29]。

1.3 自組裝肽法

自組裝肽(self-assembling peptide， SAP)是化學(xué)合成材料之一，表2列舉了幾種骨和軟骨組織工程支架的自組裝肽。自組裝過(guò)程主要依賴(lài)非共價(jià)的相互作用(如氫鍵、范德華力、π —π鍵的相互作用等)形成有序的納米結(jié)構(gòu)(如納米管、納米球、納米纖維等)[53]，如圖2所示。β-折疊結(jié)構(gòu)的SAP納米纖維有利于模擬天然ECM、構(gòu)建三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠支架[37]?；谧越M裝肽RAD16-I的水凝膠已廣泛用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的體外組織修復(fù)，但其較低的pH值(3～4)對(duì)細(xì)胞和宿主組織而言存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。自組裝肽SPG-178在中性pH下即可形成穩(wěn)定的水凝膠(SPG-178-Gel)，可避免細(xì)胞壞死，且無(wú)需預(yù)中和[54]。Tsukamoto等[54]使用SPG-178-Gel和α修飾的Eagle’s培養(yǎng)基的混合物填充大鼠顱骨缺損部位，顯著誘導(dǎo)了牙髓干細(xì)胞的增殖和成骨分化。

表2 骨和軟骨組織工程自組裝肽

(a) 肽自組裝示意圖 (b) SAP納米纖維SEM圖

Takeuchi等[55]研究SAP納米纖維水凝膠對(duì)大鼠牙周缺損愈合的影響，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的RADA16表現(xiàn)出直徑為5～200 nm的納米纖維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞募集和血管生成促進(jìn)牙周缺損的愈合。這種SAP已被命名為PuraMatrix進(jìn)行商業(yè)出售[37]。

SAP納米纖維支架具有良好的生物相容性、細(xì)胞黏附性和生物活性[59]，可通過(guò)功能基序列修飾或分子信號(hào)受控釋放來(lái)模擬天然ECM，并且細(xì)胞易于在自組裝過(guò)程中包裹在基質(zhì)內(nèi)，可避免細(xì)胞滲透，再則材料膠凝速率和降解速率可控[60]。Mujeeb等[61]設(shè)計(jì)一種FEFEFKFK短肽(F=苯丙氨酸，E=谷氨酸，K=賴(lài)氨酸)，在溶液中自組裝形成β-折疊的納米纖維，并在臨界凝膠濃度以上纏結(jié)形成自支撐水凝膠，結(jié)果表明：這種新型肽支架具有穩(wěn)定的凝膠特性，能夠封裝軟骨細(xì)胞；在不使用生長(zhǎng)因子的情況下，可于體外保持長(zhǎng)達(dá)35 d的細(xì)胞活性；3D培養(yǎng)可觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)的保留以及富含II型膠原的ECM沉積。Eren等[62]設(shè)計(jì)一種由疏水尾基和親水頭基組成的兩親性肽(peptide amphiphile，PA)分子，通過(guò)CaCl2電荷中和觸發(fā)PAs自組裝從而得到礦化的納米纖維多肽凝膠，促進(jìn)了羥基磷灰石晶體的形成，且相比非礦化時(shí)剛度顯著增強(qiáng)，表明支架礦化有利于增強(qiáng)SAP納米纖維系統(tǒng)的成骨分化功能。然而，SAP纖維直徑通常較小，例如離子型互補(bǔ)肽形成的支架的納米纖維直徑為10～20 nm，孔徑為5～200 nm[60]，這限制了骨組織的向內(nèi)生長(zhǎng)以及新生血管的形成[29]。此外，支架的抗剪切力、抗壓力、韌性等力學(xué)性能相對(duì)不足[63]，用這種生物材料支架來(lái)修復(fù)承重軟骨的缺陷具有一定難度，可通過(guò)與高分子聚合物、無(wú)機(jī)陶瓷等材料復(fù)合以及結(jié)合生物分子實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的多樣性[64]，從而在提高植入物生物活性的同時(shí)改善骨和軟骨缺損部位的力學(xué)性能[65-66]。

1.4 溶劑熱法

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是骨組織的主要無(wú)機(jī)成分，其化學(xué)組成為Ca10(OH)2(PO4)6[67]。人工合成的HA納米顆粒對(duì)硬組織有較強(qiáng)的親和力，且生物相容性和骨傳導(dǎo)性較好[68]，但其封閉的結(jié)構(gòu)和較低的孔隙連通率致使骨誘導(dǎo)緩慢[69-70]，低斷裂韌性和抗彎強(qiáng)度使其僅限于非承重支架的應(yīng)用[71]。而HA納米線(xiàn)不僅可以改善這一缺陷，還可以模擬天然骨ECM的結(jié)構(gòu)和成分[39]。溶劑熱法合成HA納米線(xiàn)最早用于制造無(wú)機(jī)紙張，隨后在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛探索[40， 67]。該方法是在單羥基醇中以油酸鈣為前體制備直徑在納米級(jí)、長(zhǎng)度在微米級(jí)的超長(zhǎng)無(wú)機(jī)納米纖維，反應(yīng)原理[72]如式(1)～(4)所示。

(1)

(2)

(3)

(4)

捷太格特(JTEKT)是2006年由光洋精工(Koyo)和豐田工機(jī)(TOYODA)合并成立的一家跨國(guó)企業(yè)。作為“汽車(chē)零部件”、“軸承”、“機(jī)床”的全球綜合系統(tǒng)供應(yīng)商，捷太格特通過(guò)為客戶(hù)提供世界頂級(jí)的No.1產(chǎn)品和Only One技術(shù)，為社會(huì)的發(fā)展持續(xù)做出貢獻(xiàn)。捷太格特在華共設(shè)立了 25 家企業(yè)，在華員工人 數(shù)近 5 000 人。

(a) HANW@MS核殼多孔結(jié)構(gòu)的形成示意圖

(b) HANWs

(c) HANW@SiO2

(d) HANW@MS

(e) CS支架

(f) HANWs/CS支架

(g)HANW@MS/CS支架

由圖3可知，該復(fù)合支架表現(xiàn)出鎂和硅元素的可持續(xù)釋放，并促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells， rBMSCs)的黏附和生長(zhǎng)，與純CS和HANWs/CS支架相比，顯著誘導(dǎo)rBMSCs的成骨分化相關(guān)基因和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)基因的表達(dá)。盡管溶劑熱法制備HA納米線(xiàn)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但合成過(guò)程難以精確控制，使得纖維的直徑無(wú)法像靜電紡納米纖維一樣均勻一致，因此穩(wěn)定合成高柔性且均勻超長(zhǎng)的HA納米線(xiàn)仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。

1.5 其他方法

對(duì)于3D組織工程再生而言，較小的孔徑和致密的結(jié)構(gòu)將極大地限制細(xì)胞的浸潤(rùn)，單一成型方法往往難以滿(mǎn)足支架的復(fù)雜需求。因此，對(duì)支架的研究趨向于將上述制備方法與其他技術(shù)相結(jié)合，從而改進(jìn)支架的結(jié)構(gòu)與性能，以形成類(lèi)似天然ECM復(fù)雜性和層次性的組織。表3列舉了多種方法聯(lián)合制備骨和軟骨組織工程支架的實(shí)例。

表3 聯(lián)合法制備骨和軟骨組織工程支架

2 纖維基支架修復(fù)效果面臨的挑戰(zhàn)

圖4為典型長(zhǎng)骨和關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)示意圖。骨和軟骨因結(jié)構(gòu)和生理功能不同，對(duì)組織工程支架的需求也不同。適當(dāng)?shù)难苄纬蓪?duì)于骨骼再生和重塑必不可少，股骨頭缺血性壞死和骨質(zhì)疏松等骨骼疾病都與血管供應(yīng)受損直接相關(guān)[88]。因此，臨床中對(duì)臨界尺寸骨缺損進(jìn)行修復(fù)時(shí)，組織工程植入物內(nèi)的血液供應(yīng)尤其重要。骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床上常見(jiàn)的軟骨類(lèi)疾病[89]，與硬骨相比，關(guān)節(jié)軟骨盡管無(wú)血管形成，且組織相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于ECM中軟骨細(xì)胞的非增殖特性和天然軟骨杰出的力學(xué)性能(高壓縮模量和彈性)[90]，功能性軟骨組織的重建再生仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。

圖4 長(zhǎng)骨及關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Schematic diagram of histologic structure of long bone and articular cartilage

骨愈合過(guò)程包括炎癥、修復(fù)和重塑等3個(gè)重疊過(guò)程[91]，克服植入物引起的炎癥是組織工程支架臨床應(yīng)用的另一障礙。組織工程植入物的炎癥反應(yīng)主要由巨噬細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，研究表明，纖維直徑以及支架的表面形貌會(huì)影響巨噬細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌，納米纖維的表面可以更好地降低炎癥反應(yīng)[92]。然而在骨組織工程領(lǐng)域，關(guān)于三維多孔的纖維支架結(jié)構(gòu)對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的研究較少，本節(jié)主要介紹硬骨血管化和軟骨再生中支架設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。

2.1 血管化

骨是高度血管化的結(jié)締組織，血管網(wǎng)絡(luò)在為細(xì)胞提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及清除代謝廢物等方面起著至關(guān)重要的作用[93]。骨移植物通常依賴(lài)于體內(nèi)植入后的血管化，然而許多支架不具有誘導(dǎo)血管生成的能力，體積較大的多孔支架還可能面臨血管難以滲透到中央?yún)^(qū)域的問(wèn)題[94]。不充分的血管網(wǎng)絡(luò)會(huì)阻礙氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，甚至導(dǎo)致細(xì)胞分化失控、凋亡或新生組織的壞死，不利于缺損部位的骨

支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是形成血管網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵要素。骨骼再生和血管形成的最佳孔徑范圍為200～500 μm[11]，孔徑、孔隙率以及互連性的提高將會(huì)增加血管密度和浸潤(rùn)深度[97]。與單一尺度的孔徑相比，兼具大孔、介孔和微孔的多級(jí)孔徑結(jié)構(gòu)更有利于促進(jìn)血管生成[98-99]。數(shù)百微米的大孔可提升支架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并支持MSCs成骨分化、ECM沉積和組織形成，幾十微米或更小的介孔將促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散和血管化的形成，而微米或以下尺寸的小孔則會(huì)影響基因表達(dá)等細(xì)胞行為[22]。Santos等[100]研究表明，PCL微/納米纖維復(fù)合支架體系引發(fā)并指導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)的三維分布，與沒(méi)有納米纖維的支架相比，使用納米纖維作為橋梁時(shí)，微米纖維之間的人微血管和大血管ECs表現(xiàn)出更加伸長(zhǎng)的表型。盡管較大的孔徑、高度連通的孔隙以及微/納米尺度的纖維形貌等支架結(jié)構(gòu)有利于骨質(zhì)和血管再生，但這些物理屬性也在一定程度上犧牲了支架的結(jié)構(gòu)完整性和力學(xué)性能，因此，在設(shè)計(jì)允許宿主細(xì)胞入侵并在植入后有效形成血管的骨組織工程支架時(shí)，需要在整個(gè)環(huán)節(jié)中分析微結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能的最佳組合[101]。

血管再生理想的支架應(yīng)不僅能提供適當(dāng)?shù)奈锢砦h(huán)境來(lái)模仿目標(biāo)組織的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，還可以提供生長(zhǎng)因子或其他生物活性分子來(lái)指導(dǎo)細(xì)胞行為。表4列舉了骨缺損治療中常用的血管生長(zhǎng)因子。采用不同降解行為的聚合物或摻入微球?qū)⑸L(zhǎng)因子固定在支架中，可以實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子局部和持續(xù)遞送的目的[97]。此外，利用同軸靜電紡絲技術(shù)制備的核殼結(jié)構(gòu)納米纖維為控制生長(zhǎng)因子局部緩釋提供了另一方案[44]。骨再生是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程，僅從支架材料中釋放單一生長(zhǎng)因子可能不足以刺激骨骼和血管再生[102]。Kuttappan等[103]比較生長(zhǎng)因子單一釋放系統(tǒng)(BMP-2/VEGF/FGF-2)和雙重系統(tǒng)(VEGF+BMP-2/FGF-2+BMP-2)負(fù)載的納米纖維支架促進(jìn)血管和骨再生的能力，結(jié)果表明，雙重系統(tǒng)形成的綜合效果更明顯。Wang等[104]通過(guò)多源多功率靜電紡絲構(gòu)建摻入VEGF、BMP-2和磷酸鈣納米粒子的3組分支架，通過(guò)不同降解速率的纖維成分實(shí)現(xiàn)VEGF快速釋放和BMP-2緩慢穩(wěn)定釋放，不僅可以從結(jié)構(gòu)上模仿天然骨組織，還可以模擬自然骨修復(fù)過(guò)程中不同生長(zhǎng)因子的出現(xiàn)順序。

表4 骨組織工程常用的血管生長(zhǎng)因子

共培養(yǎng)技術(shù)已廣泛用于血管化骨組織工程。成骨細(xì)胞與ECs共培養(yǎng)可刺激成骨細(xì)胞分化并形成微毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)[111]。研究[112]表明，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)與MSCs以1∶1的比例共培養(yǎng)可獲得成骨分化和血管生成的最佳組合。支架微結(jié)構(gòu)、剛度等均可影響細(xì)胞間的通信，Piard等[113]對(duì)3D打印微米纖維之間的距離進(jìn)行調(diào)節(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVECs和MSCs間距小于200 μm時(shí)呈現(xiàn)出更多的血管和骨再生數(shù)量。除上述方法外，載有細(xì)胞的體外預(yù)血管化支架也可在一定程度上改善早期血管化不足的問(wèn)題[114]。細(xì)胞來(lái)源包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells， ADSCs)和來(lái)源于骨膜的祖細(xì)胞等[1]。Debski等[115]通過(guò)熔融沉積建模制備了三維圓柱形PCL支架，將從大鼠脂肪沉積物中分離出的ADSCs接種在支架中，并將腹壁下的血管放置于流通式椎弓根系統(tǒng)(一種新型預(yù)血管化方法)支架內(nèi)部，結(jié)果表明，支架接種ADSCs以及這種預(yù)血管化方法對(duì)于血管化具有協(xié)同作用，血管密度相比對(duì)照組增加了10倍，顯著促進(jìn)體內(nèi)植入后的血管生成。

對(duì)于臨界尺寸骨缺損的治療，移植初期功能性血管網(wǎng)絡(luò)的生成顯得至關(guān)重要。炎癥、血管化和骨再生在骨愈合過(guò)程中重疊存在[116]，在早期愈合階段，全身性炎癥和局部生理性炎癥相互作用，并且局部炎癥受到愈合區(qū)中生物力學(xué)環(huán)境的影響[91]，因此還需對(duì)炎癥反應(yīng)和骨再生的生理過(guò)程進(jìn)行充分且深入研究，以結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建符合預(yù)期要求的生物支架。

2.2 軟骨再生

軟骨由于無(wú)血管、軟骨細(xì)胞不足以及缺乏營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，需要通過(guò)手術(shù)方法獲得令人滿(mǎn)意的再生效果[117]。盡管目前臨床上傾向于使用非支架技術(shù)治療軟骨缺損，但基于支架的方法仍具有一定的發(fā)展?jié)摿?，例如：便于填充軟骨缺損；較少的供體部位并發(fā)癥；增加移植物的穩(wěn)定性，縮短術(shù)后恢復(fù)時(shí)間；由于軟骨細(xì)胞是在3D環(huán)境中培養(yǎng)，因此不易去分化，產(chǎn)生的類(lèi)透明質(zhì)軟骨更多；植入前的體外培養(yǎng)可能有助于維持支架的修復(fù)[118]。

目前，軟骨組織工程支架常用的結(jié)構(gòu)有3種：水凝膠、海綿和纖維網(wǎng)絡(luò)[119]。納米纖維支架可在成分和結(jié)構(gòu)上模仿天然軟骨ECM的物理和生物學(xué)特征，因此對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)具有重要意義[120]。Ren等[121]利用聚多巴胺將硫酸軟骨素涂覆在電紡取向PLLA多孔纖維表面，顯著增加軟骨細(xì)胞的增殖附著量以及rBMSCs的軟骨基因表達(dá)。3D基質(zhì)可為體外細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的支架，指導(dǎo)干細(xì)胞分化。HYAFF-11是一種透明質(zhì)酸三維非織造支架[122]，具有良好的生物相容性[123]，支持軟骨細(xì)胞的增長(zhǎng)[124]。HYAFF-11支架和自體軟骨細(xì)胞組成的Hyalograft-C在臨床上已經(jīng)用于研究全層軟骨缺損的修復(fù)，其在治療關(guān)節(jié)軟骨病變上被證明安全有效[125]。由水凝膠基質(zhì)和可生物降解的聚合物纖維網(wǎng)絡(luò)組成的復(fù)合材料在軟骨組織工程中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，其中，水凝膠基質(zhì)為細(xì)胞發(fā)揮功能提供合適的微環(huán)境，高模量纖維主要負(fù)責(zé)提供結(jié)構(gòu)完整性和強(qiáng)度[126]。Bas等[127]以星形聚乙二醇/肝素水凝膠為軟骨基質(zhì)，以熔融靜電紡絲打印技術(shù)制備的PCL纖維網(wǎng)絡(luò)為水凝膠的增強(qiáng)結(jié)構(gòu)，制備的復(fù)合支架表現(xiàn)出與天然組織相似的力學(xué)各向異性、非線(xiàn)性和黏彈性，并為體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和軟骨組織再生提供了合適的微環(huán)境。

關(guān)節(jié)軟骨由于在細(xì)胞分布和膠原纖維結(jié)構(gòu)上具有區(qū)域差異，因此，其獨(dú)特性除體現(xiàn)在優(yōu)異的黏彈性上，還體現(xiàn)在生物學(xué)和力學(xué)特性的梯度分布上[90]。隨著軟骨支架的發(fā)展，支架由單相發(fā)展至雙相和梯度結(jié)構(gòu)[128-129]，從而可更好地模擬骨、軟骨過(guò)渡區(qū)域。研究[130]表明，雙相合成支架治療軟骨損傷后的活性水平和軟骨敏感磁共振成像表現(xiàn)優(yōu)于傳統(tǒng)微骨折技術(shù)。Liu等[131]開(kāi)發(fā)了一種特異性釋放干細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的仿生雙相骨軟骨支架(BBOS)，由軟骨再生層和成骨再生層組成，可促進(jìn)干細(xì)胞在特定層分化，體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)其具有足夠的固定強(qiáng)度，植入2個(gè)月期間保持雙相的穩(wěn)定結(jié)合。Khoo等[132]采用順序靜電紡絲技術(shù)制備出具有纖維密度梯度的三層明膠納米纖維支架，支架的力學(xué)性能隨纖維直徑、纖維密度和支架孔徑等微觀(guān)結(jié)構(gòu)的差異而變化，相比均勻材料，表現(xiàn)出更好的斷裂行為，同時(shí)可以防止組織界面上的力學(xué)性能不匹配和不連續(xù)，然而明膠支架的交聯(lián)和水化程度將影響支架最終的力學(xué)性能。Wang等[25]采用溶膠-凝膠靜電紡絲制備出具有優(yōu)異柔韌性的SiO2納米纖維，與殼聚糖復(fù)合從而得到3D多孔的形狀記憶支架(SiO2NF/CS)，通過(guò)控制SiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步獲得剛度梯度支架。支架在水環(huán)境中表現(xiàn)出超彈性，多次循環(huán)載荷后仍具有較高的形狀恢復(fù)率和抗疲勞性，剛度梯度使得MSCs在空間上分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。

目前纖維基軟骨支架在臨床上應(yīng)用較少，其設(shè)計(jì)趨勢(shì)在于模擬關(guān)節(jié)軟骨生理結(jié)構(gòu)及其優(yōu)異的力學(xué)性能，從而開(kāi)發(fā)具有區(qū)域特異性的多相支架。為提高纖維支架促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨再生的效率，可以將蛋白質(zhì)或短肽等仿生信號(hào)固定在生物材料表面，從而更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞黏附并促進(jìn)軟骨分化[133]。此外，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎引起的骨缺損治療，炎癥環(huán)境會(huì)加快支架的降解速度[134]，因此，以生物材料為基礎(chǔ)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、提高材料的穩(wěn)定性，可為促進(jìn)軟骨再生提供一個(gè)新的研究思路。

3 結(jié) 語(yǔ)

骨和軟骨組織工程中用于組織再生的關(guān)鍵是模擬ECM的支架，理想的支架應(yīng)具備與修復(fù)部位相似的力學(xué)性能、良好的生物相容性和與組織再生相匹配的降解速率等特性，以滿(mǎn)足宿主組織對(duì)細(xì)胞黏附、增殖、分化和ECM形成的要求。在眾多支架中，纖維基支架因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征引起了廣泛關(guān)注，其常用制備方法有靜電紡絲法、熱致相分離法、自組裝肽法和溶劑熱合成法。隨著生物醫(yī)學(xué)工程的目標(biāo)越來(lái)越復(fù)雜，單一制備方法在力學(xué)性能、孔徑尺寸、孔隙率及孔隙連通率等方面仍存在問(wèn)題，因此結(jié)合多種成型方法的優(yōu)勢(shì)制備具有多級(jí)孔徑結(jié)構(gòu)的仿生復(fù)合纖維支架具有重要意義。

在臨界尺寸骨缺損治療中，生物材料的設(shè)計(jì)越來(lái)越關(guān)注骨組織和血管網(wǎng)絡(luò)同步發(fā)展，早期血管化是臨床上面臨的一大挑戰(zhàn)。兼具大孔、微孔和介孔的多尺度結(jié)構(gòu)纖維支架更有利于促進(jìn)血管生成，然而僅改變支架結(jié)構(gòu)不能徹底解決這一問(wèn)題，因此需要調(diào)節(jié)支架結(jié)構(gòu)、負(fù)載血管生長(zhǎng)因子、使用共培養(yǎng)系統(tǒng)和外預(yù)血管化等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)血管和骨骼的同步再生。在關(guān)節(jié)軟骨缺損治療中，纖維支架植入物同樣具有很大的發(fā)展?jié)摿??？刂评w維方向和密度梯度可以為材料帶來(lái)理想的生理結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。相比單相支架，多相或梯度的納米纖維支架還可以更好地模擬關(guān)節(jié)軟骨過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)，使組織能夠承受關(guān)節(jié)負(fù)荷并形成穩(wěn)定的骨骼系統(tǒng)。

盡管基于纖維的三維多孔支架在骨和軟骨組織工程應(yīng)用中展現(xiàn)出了巨大的潛力，但仍有許多問(wèn)題尚待解決。骨和軟骨缺損的愈合是由多種類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)控制的復(fù)雜過(guò)程，仿生天然組織的復(fù)雜組成和空間分布，在材料、組成、排列、孔徑等方面進(jìn)行功能分級(jí)設(shè)計(jì)，有利于提高細(xì)胞的長(zhǎng)入以及組織的再生。纖維基支架的體外應(yīng)用已得到了廣泛的研究，但對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用而言，還需要對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步優(yōu)化。此外，炎癥在骨和軟骨缺損的修復(fù)過(guò)程中具有不可忽視的作用，然而目前關(guān)于支架結(jié)構(gòu)對(duì)炎癥反應(yīng)影響的相關(guān)研究報(bào)道較少且不成體系，因此對(duì)纖維基支架的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等方面進(jìn)行研究將進(jìn)一步深化其在骨和軟骨組織再生中的應(yīng)用。