劉云青 胡丐鋒 徐鴻軒 孟令丙 李金明 劉德平

血清尿酸水平升高可增加局部氧化應(yīng)激、炎癥、胰島素抵抗和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)構(gòu)改變[1]。同時(shí)，流行病學(xué)研究表明，血清尿酸水平升高與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括冠心病、心力衰竭和心房顫動(dòng)等[2-4]。

心肌纖維化是由多種因素引起的膠原纖維過度沉積，膠原濃度和體積分?jǐn)?shù)顯著增加，心肌中膠原類型比例失調(diào)和排列紊亂[5]。成纖維細(xì)胞是分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的主要細(xì)胞，在心臟損傷修復(fù)和心肌纖維化過程中具有顯著作用[6]。常駐成纖維細(xì)胞的活化和增殖是肌成纖維細(xì)胞的重要來源[7-8]。最近研究表明，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是心肌纖維化中肌成纖維細(xì)胞活化的一個(gè)關(guān)鍵分子，進(jìn)而也成為心力衰竭發(fā)生發(fā)展的一個(gè)強(qiáng)有力的驅(qū)動(dòng)因素[9-12]。并且OPN可經(jīng)凝血酶切割，切割后的OPN促纖維化的效果顯著增強(qiáng)[13-14]。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度尿酸刺激原代人心臟成纖維細(xì)胞，觀察OPN的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探索成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡和膠原分泌變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原代人心臟成纖維細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Science Cell公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛公司；尿酸購(gòu)自SIGMA公司；FastKing反轉(zhuǎn)錄試劑盒[FastKing RT Kit(With gDNase)]購(gòu)自天根生化科技有限公司；TB Green?熒光染料試劑盒購(gòu)自TAKARA生物科技有限公司；Trizol細(xì)胞裂解液、RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶有限公司；蛋白酶抑制劑、10%聚丙烯酰胺凝膠預(yù)混液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自新賽美公司；PVDF膜購(gòu)自碧云天公司；OPN、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、Coll-1兔抗人一抗、β-Tubulin鼠抗人一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購(gòu)自Proteintech公司；CellTiter-Glo細(xì)胞活力試劑盒購(gòu)自Promega公司；Trans-well小室購(gòu)自R&D公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自翱擎生物科技公司；碘化丙啶PI染色試劑盒購(gòu)自凱基公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將原代人心臟成纖維細(xì)胞用加入雙抗的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶溶液消化后傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 尿酸刺激 分別配置不同尿酸濃度的培養(yǎng)基：0、5、10和15 mg/dl，將原代人心臟成纖維細(xì)胞置于上述培養(yǎng)基中48 h。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR) Trizol裂解液提取各組細(xì)胞總RNA，使用FastKing反轉(zhuǎn)錄試劑盒在20 μl的隨機(jī)引物反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄RNA(1 μg)，循環(huán)溫度42℃(15 min)、90℃(3 min)。用于實(shí)時(shí)熒光qPCR的引物見表1。用TB Green?熒光染料試劑盒[TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)]配置10 μl PCR反應(yīng)體系，于羅氏LightCycler480中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)循環(huán)95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)下進(jìn)行預(yù)變性，按定量分析模式在95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按融解曲線分析模式在95℃ 5 s，60℃ 60 s，95℃ 1 s 1個(gè)循環(huán)進(jìn)行融解曲線分析，50℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)進(jìn)行降溫，得出各反應(yīng)孔的CT值。采用2-ΔΔCT法計(jì)算OPN、α-SMA、Coll-1相對(duì)內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增倍數(shù)，首先根據(jù)羅氏LightCycler480軟件所測(cè)得CT值，計(jì)算出OPN、α-SMA、Coll-1基因的ΔCT值，后以尿酸0 mg/dl組為基準(zhǔn)，計(jì)算出ΔΔCT值，得出擴(kuò)增倍數(shù)為2-ΔΔCT。

表1 熒光染料法(TB Green?)引物序列

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) RIPA裂解提取各組細(xì)胞總蛋白，制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣樣品。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、洗膜、封閉、轉(zhuǎn)膜、裁膜，進(jìn)而分別用OPN、α-SMA、Coll-1羊抗兔一抗、β-Tubulin羊抗鼠一抗，4℃孵育過夜，孵育二抗2 h，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，顯影后的條帶用Image J軟件對(duì)蛋白條帶做灰度分析。

1.2.5 CellTiter-Glo細(xì)胞生長(zhǎng)活力檢測(cè) 將尿酸處理后的細(xì)胞用胰酶消化后均勻接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃正常培養(yǎng)16 h，取出培養(yǎng)板室溫放置30 min，每孔加入100 μl CellTiter-Glo?試劑，在振動(dòng)器上振蕩2 min使細(xì)胞充分裂解，室溫下孵育10 min以穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光值。

1.2.6 Trans-well小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將Trans-well小室置于24孔板，加100 μl無血清培養(yǎng)基于小室，向小室中加入200 μl濃度為2.5×105/ml的無血清細(xì)胞懸液，向外室中加入750 μl含血清的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16 h，棄去小室內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，用3.7%的甲醛室溫固定細(xì)胞2 min，棄去甲醛后采用PBS清洗兩遍，無水乙醇室溫通透細(xì)胞20 min，去除乙醇用PBS清洗兩遍，加入結(jié)晶紫室溫避光染色15 min，用棉簽蘸干小室底部?jī)?nèi)面，于顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè) 將心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)后傳代至96孔板，培養(yǎng)12 h促使細(xì)胞貼壁，后分別用尿酸5、10和15 mg/dl完全培養(yǎng)基刺激48 h，用新鮮培養(yǎng)基更換尿酸培養(yǎng)基后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.2.8 碘化丙啶PI染色細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將原代心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至第4代，將細(xì)胞傳代至6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，分別加入尿酸0、5、10和15 mg/dl完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。用胰酶消化并收集細(xì)胞，1×BufferA洗滌細(xì)胞一次(離心2 000 rpm，5 min)，加適量的1×BufferA重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為105/ml；取95 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl PI染液，輕輕混勻；滴加于載玻片上，室溫避光放置5 min后，加蓋玻片；熒光顯微鏡綠光濾光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心臟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活力變化

各組細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，尿酸5、10和15 mg/dl組的心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖活力較尿酸0 mg/dl組均有增加(均為P<0.05)，且表達(dá)趨勢(shì)隨尿酸濃度升高呈倒U型曲線關(guān)系，見圖1。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組(n=6)

對(duì)尿酸處理后的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)12 h后發(fā)現(xiàn)，尿酸10和15 mg/dl組細(xì)胞貼壁融合生長(zhǎng)面積明顯比尿酸0和5 mg/dl組快(圖2)。與尿酸10 mg/dl組相比，尿酸15 mg/dl組的細(xì)胞活力有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮可能是尿酸濃度過大的情況下，細(xì)胞耐受能力減弱，進(jìn)而活力降低。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組；各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后拍攝，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合程度，肉眼觀察具有差異

2.2 心臟成纖維細(xì)胞增殖毒性改變

各組細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，經(jīng)CCK-8試劑孵育2.5 h后，尿酸5和10 mg/dl組吸光值較尿酸0 mg/dl組顯著增加(均為P<0.05)，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，各組間增殖趨勢(shì)與細(xì)胞活力測(cè)試結(jié)果相符。然而與尿酸10 mg/dl組相比，尿酸15 mg/dl組的細(xì)胞增殖能力下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮可能是尿酸濃度過大的情況下，細(xì)胞耐受能力減弱，進(jìn)而增殖能力降低。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組(n=10)

2.3 心臟成纖維細(xì)胞遷移能力變化

Trans-well小室檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，與尿酸0 mg/dl組相比，尿酸5、10和15 mg/dl組的細(xì)胞遷移能力均增強(qiáng)，以尿酸10 mg/dl組增強(qiáng)最明顯。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組；圖中染成紫色的細(xì)胞為穿過小孔的細(xì)胞，紫色細(xì)胞越多表明細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)

2.4 心臟成纖維細(xì)胞中OPN、α-SMA和Coll-1 mRNA的表達(dá)變化

實(shí)時(shí)熒光qPCR結(jié)果顯示，OPN、α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著尿酸刺激濃度的升高而增加，在尿酸濃度為10 mg/dl時(shí)達(dá)到最大值，在尿酸15 mg/dl組有所下降(P<0.05)；與尿酸0 mg/dl組相比，Coll-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在尿酸 10 mg/dl組顯著升高(P<0.001)，見圖5。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組；A：Coll-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(n=14)；B：OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量(n=15)；C：α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量(n=14)

2.5 心臟成纖維細(xì)胞中OPN、α-SMA和Coll-1 蛋白的表達(dá)變化

Western Blot結(jié)果顯示，與尿酸0 mg/dl組相比，經(jīng)尿酸刺激48 h后的其他3組細(xì)胞中OPN蛋白的表達(dá)均顯著增加(均為P<0.001)，以尿酸10 mg/dl組最明顯。α-SMA作為成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志，其在尿酸10 mg/dl組中的表達(dá)明顯增加(P<0.001)；Coll-1作為纖維化程度的標(biāo)志，其在尿酸10 mg/dl組中表達(dá)也明顯上調(diào)(P<0.001)。然而，尿酸5、15 mg/dl組的α-SMA和Coll-1蛋白表達(dá)倍數(shù)與尿酸0 mg/dl組無明顯差異，可能由于尿酸15 mg/dl影響了成纖維細(xì)胞的活性，使α-SMA和Coll-1基因生成受到抑制(圖6)。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組；A：目的蛋白Coll-1、OPN、α-SMA及內(nèi)參蛋白β-Tubulin電泳圖；B：Coll-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=11)；C：OPN蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=14)；D：α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=12)

2.6 心臟成纖維細(xì)胞凋亡的改變

碘化丙啶凋亡檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，經(jīng)尿酸刺激72 h后，與尿酸0 mg/dl組相比，尿酸5、10和15 mg/dl組的凋亡細(xì)胞數(shù)量均相對(duì)減少，以尿酸10 mg/dl組凋亡細(xì)胞最少。成纖維細(xì)胞凋亡減少，存活時(shí)間增加，分泌膠原的時(shí)間和量均增加。

UA-0、UA-5、UA-10和UA-15：尿酸0、5、10和15 mg/dl組；圖中紅色熒光細(xì)胞為PI染色陽性細(xì)胞，標(biāo)志細(xì)胞凋亡

3 討論

心肌纖維化是多種心血管疾病的共同最終病理狀態(tài)[5]。OPN在健康心肌中表達(dá)較少，其表達(dá)是由各種損失刺激觸發(fā)的，并與顯著的間質(zhì)和血管周圍纖維形成有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[11-12]。

尿酸是通過飲食和內(nèi)源性來源積累的嘌呤代謝而產(chǎn)生的最終產(chǎn)物[15]。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，可溶性尿酸在心血管疾病的血管結(jié)構(gòu)改變中起直接作用[16-17]。高尿酸血癥的物理化學(xué)定義可用特異性尿酸酶法測(cè)定，尿酸鹽在血漿中的溶解度超過一定水平容易導(dǎo)致晶體形成[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，OPN、α-SMA、Coll-1的表達(dá)均在尿酸10 mg/dl時(shí)最高，而當(dāng)尿酸刺激濃度為15 mg/dl時(shí)上述基因的表達(dá)均有所下降。在多項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所采用的尿酸刺激濃度有所不同，最高濃度為20 mg/dl，但多以10 mg/dl為上限[19-23]。Kr?a M的研究也得出與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，即尿酸刺激對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的影響呈劑量依賴性，但當(dāng)尿酸濃度到達(dá)一定程度時(shí)刺激效果有所下降[19，24]。在一項(xiàng)尿酸刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力、各種炎癥因子的表達(dá)隨著尿酸刺激濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為9 mg/dl時(shí)表達(dá)最高，當(dāng)濃度為12 mg/dl時(shí)表達(dá)有所下降[22]。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)尿酸刺激效果與尿酸濃度呈倒U型曲線并非偶然。一些研究表明，尿酸晶體能激活炎癥反應(yīng)、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25-26]。我們推測(cè)在本研究中出現(xiàn)類似結(jié)果的原因：當(dāng)尿酸溶解到一定程度后飽和，尿酸晶體析出，晶體對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，造成后期尿酸刺激的效果并未隨著濃度的增加而一直增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)還表明，經(jīng)過尿酸的刺激，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力、活化及分泌膠原的能力均有所提高，OPN的表達(dá)也明顯增加。有研究表明，OPN在促進(jìn)成纖維細(xì)胞存活、活化、增殖、凋亡方面有重要作用[10]。OPN能促使心肌成纖維細(xì)胞衰老標(biāo)志物的基因表達(dá)顯著降低，而成纖維細(xì)胞活性和增殖能力明顯增強(qiáng)[10]。OPN還能激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1導(dǎo)致微小RNA-21轉(zhuǎn)錄激活并以PTEN/SMAD7為靶點(diǎn)，從而增加成纖維細(xì)胞的存活[27]。在心肌梗死所致的心肌纖維化中，OPN在促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積及巨噬細(xì)胞增殖之間的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)中也發(fā)揮重要作用[28]。因此我們推測(cè)，尿酸能刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生OPN，OPN進(jìn)一步促使成纖維細(xì)胞活化、增殖從而導(dǎo)致膠原蛋白分泌增加，加速心肌纖維化進(jìn)程。然而，本實(shí)驗(yàn)也存在一定的不足，即未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OPN在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，因此在未來的研究中可利用OPN敲除或過表達(dá)小鼠驗(yàn)證其功能。

綜上所述，尿酸能夠刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)OPN、促使細(xì)胞活化、增加膠原蛋白分泌、延緩細(xì)胞凋亡；并且刺激效果并非與尿酸濃度呈單純的正相關(guān)，而作用效果隨尿酸濃度呈倒U型曲線，在尿酸濃度為10 mg/dl時(shí)效果顯著。

利益沖突：無