劉文東，李金玲，趙致，曹國璠，王華磊，羅春麗

（1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點（工程）實驗室，貴州 貴陽 550025）

傳統(tǒng)中藥材白術(shù)系菊科蒼術(shù)屬白術(shù)（Atractylodes macrocephalae Koidz.）的干燥根莖[1]，為多年生草本植物?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中將白術(shù)列為上品，具有健脾益氣、燥濕利水和止汗安胎的功效。近代研究揭示其有效成分為揮發(fā)油類、內(nèi)酯類、多糖類和苷類等，且主要藥理作用為抗癌、修復(fù)胃黏膜、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝、改善記憶力、調(diào)節(jié)脂代謝、降血糖和抑菌等[2]。因為人工采挖過度導(dǎo)致白術(shù)野生資源急劇下降[3]，人工栽培是白術(shù)生產(chǎn)的主要方式，但白術(shù)種子不耐貯藏且萌發(fā)過程極易感病，所以解決白術(shù)種子貯藏和萌發(fā)是亟需解決的問題。彭芳麗[4]、胡曉甜[5]和陳怡[6]等研究了不同貯藏條件對白術(shù)種子質(zhì)量的影響，但對白術(shù)種子萌發(fā)過程相關(guān)生理指標(biāo)變化的系統(tǒng)研究尚有欠缺，所以亟需探明白術(shù)種子萌發(fā)過程中生理指標(biāo)動向及環(huán)境條件變動對白術(shù)種子萌發(fā)的影響。本文通過跟蹤研究白術(shù)種子整個萌發(fā)過程中白術(shù)種子的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白和可溶性糖的變化情況，揭示其萌發(fā)過程中的相關(guān)生理指標(biāo)變化規(guī)律，并設(shè)置不同濃度的NaCl溶液處理探究白術(shù)種子生理指標(biāo)對鹽脅迫的響應(yīng)。通過生理指標(biāo)變化狀態(tài)揭示白術(shù)種子萌發(fā)過程中的抗逆生理，不僅得出白術(shù)種子自然萌發(fā)過程中的生理變化且探明了鹽脅迫對白術(shù)種子萌發(fā)的影響，為白術(shù)的育苗提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試白術(shù)種子于2018年采自貴州省銅仁市玉屏縣朱家場鎮(zhèn)鐵柱山中藥材園區(qū)白術(shù)種植基地，經(jīng)貴州大學(xué)季祥彪老師鑒定為菊科蒼術(shù)屬白術(shù)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗方法：隨機挑選飽滿、無病害的白術(shù)種子，用多菌靈500倍液消毒20 min后用蒸餾水反復(fù)清洗3次，將種子分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的NaCl溶液浸種，另外一份用蒸餾水浸泡作為對照，浸泡時間都為24 h，將浸泡處理的種子采用雙層濾紙培養(yǎng)法在25℃、無光照條件下培養(yǎng)，適時澆水保持濕潤。

1.3 生理指標(biāo)測定方法

經(jīng)前期試驗得出此種白術(shù)種子經(jīng)上述處理后9 d左右即萌發(fā)完全，共取9 d的樣品，將浸泡24 h后的種子作為第1天取樣，放入培養(yǎng)箱后每天取一次樣，每個處理每次隨機取樣15粒，所取樣品用液氮速凍后放入-25℃下保存，待取樣完成后一起測定。所有樣品采用試劑盒方法（南京建成生物工程研究所）測定種子萌發(fā)過程中SOD、POD和CAT的活性，可溶性蛋白、可溶性糖和MDA參照張志良[7]的考馬斯亮藍染料結(jié)合法、蒽酮比色法和硫代巴比妥酸比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)結(jié)果進行圖表繪制，SAS 9.4進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)種子萌發(fā)過程中SOD、POD及CAT的活性狀態(tài)萌發(fā)天數(shù)

由表1中可知白術(shù)種子萌發(fā)過程中SOD、POD及CAT為30.78 U/g FW，從第4天開始顯著上升，第9天達到最大值，為229.77 U/g FW；白術(shù)種子POD的活性隨著萌發(fā)時間推進呈現(xiàn)先降低后上升趨勢，第3天達到最小值變化情況。白術(shù)種子在整個萌發(fā)過程中SOD的活性呈現(xiàn)先緩慢降低，再迅速升高趨勢，萌發(fā)第3天下降到最低值62.06 U/g FW且顯著低于前2 d（P＜0.05），第5天開始迅速上升且顯著高于前4 d，第7天達到最大值178.04 U/g FW，但后5 d不存在差異顯著性；而整個萌發(fā)過程中種子CAT的活性總體呈現(xiàn)上升趨勢，但顯著不差異。

表1 白術(shù)種子萌發(fā)過程中相關(guān)生理指標(biāo)多重比較（＜0.05）Table 1 The multiple comparison of related physiological indicators during seed germination(＜0.05)

表1 白術(shù)種子萌發(fā)過程中相關(guān)生理指標(biāo)多重比較（＜0.05）Table 1 The multiple comparison of related physiological indicators during seed germination(＜0.05)

注：同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著（P＜0.05），所標(biāo)字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。Note:Different letters in the same precedence means significant difference between the treatments（P＜0.05）,same letter in the same row means not significant difference between treatments（P＞0.05）.

萌發(fā)天數(shù)Germination days SOD(U/g FW)POD(U/g FW)CAT(U/g FW)可溶性糖（mg/g）Souble sugar可溶性蛋白（mg/g）Soluble protein MDA（mol/g FW）第1天 The first day 81.93±7.42b 83.89±33.66bc 0.07±0.06c 217.33±22.24a 3.92±0.11a 0.06±0.05a第2天 The second day 68.12±19.37b 87.13±6.26bc 0.10±0.01abc 183.10±9.52b 3.10±0.55ab 0.05±0.01a第3天 The third day 30.78±0.84b 62.06±14.18c 0.07±0.01c 151.89±18.90c 2.23±0.59bc 0.07±0.04a第4天 The fourth day 53.89±18.85b 93.45±16.98bc 0.09±0.06bc 124.68±15.27d 2.23±0.58bc 0.08±0.01a第5天 The fifth day 178.61±18.01a 130.15±16.71ab 0.11±0.02abc 115.60±5.79d 1.90±1.00cd 0.08±0.002a第6天 The sixth day 216.75±51.71a 164.94±18.08a 0.13±0.02abc 84.46±10.00e 1.57±0.58cd 0.08±0.02a第7天 The seventh day 221.65±10.17a 178.04±7.29a 0.16±0.03ab 78.10±10.15ef 1.16±0.53de 0.06±0.006a第8天 The eighth day 222.19±20.77a 174.32±14.30a 0.15±0.02ab 56.51±10.51f 0.49±0.36e 0.05±0.007a第9天 The ninth day 229.77±13.93a 156.85±23.55a 0.18±0.07a 33.08±8.18g 0.38±0.16e 0.06±0.01a

2.2 白術(shù)種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白、可溶性糖和MDA的變化趨勢

如表1所示，白術(shù)種子萌發(fā)過程中可溶性糖呈現(xiàn)下降趨勢，表1可知除了第4天和第5天、第6天和第7天、第7天和第8天之間不存在顯著性差異之外，其余各組之間都存在顯著性差異，萌發(fā)第1天可溶性糖含量最高，達到217.33 mg/g，第9天降到最低，僅為33.08 mg/g。由于白術(shù)種子在萌發(fā)過程中大分子多糖、脂肪等物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，用于生長合成，所以在萌發(fā)第1天可溶性糖含量極高，隨著生長消耗慢慢降低，說明白術(shù)種子在萌發(fā)過程中可溶性糖含量下降明顯。從表1可知，整個萌發(fā)過程中白術(shù)種子可溶性蛋白也是呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，但是下降幅度較可溶性糖緩慢，種子萌發(fā)第1天其可溶性蛋白達到最大值3.92 mg/g，萌發(fā)至第8天可溶性蛋白已經(jīng)下降至很低，第9天達到最小值0.38 mg/g，說明可溶性蛋白減少程度較大。由表1可知，MDA在種子萌發(fā)過程中呈現(xiàn)著不規(guī)律變化，總體呈現(xiàn)先升后降狀態(tài)，但是種子在整個萌發(fā)過程中MDA的含量不存在顯著性差異，說明MDA的含量變化并不明顯?？赡茉蚴前仔g(shù)種子萌發(fā)過程沒有受到脅迫導(dǎo)致MDA的含量在正常水平徘徊或種子萌發(fā)過程中各種保護酶的活性增加導(dǎo)致其含量一直沒有顯著變化，且有降低趨勢。

2.3 NaCl處理對白術(shù)種子萌發(fā)過程中SOD、POD和CAT的影響

通過對比NaCl和CK處理白術(shù)種子同一萌發(fā)時間的相關(guān)生理指標(biāo)變化得出NaCl處理對白術(shù)種子萌發(fā)的影響，由圖1可知，各個氯化鈉水平處理下白術(shù)種子SOD、POD和CAT都顯著低于CK。由圖1 A得出，經(jīng)鹽脅迫處理后白術(shù)種子SOD的活性顯著下降，在各個鹽濃度水平下呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，僅有萌發(fā)第3、4天種子SOD的活性在NaCl 0.5 g/L和NaCl 1.0 g/L下顯著高于對照，從第5天開始每個鹽濃度水平下SOD的活性都顯著低于CK。由圖1 B可得，白術(shù)種子經(jīng)不同濃度NaCl溶液處理后，隨著萌發(fā)進程推進POD的活性緩慢上升，但各個鹽濃度水平處理下POD的活性在整個萌發(fā)時期都顯著低于CK。由圖1 C可知，經(jīng)過鹽脅迫處理的種子CAT的活性遠(yuǎn)低于CK，且整個萌發(fā)時期種子CAT的活性呈上升趨勢，萌發(fā)第6天以前CAT的活性在各個鹽濃度水平處理下都低于對照，從第7天開始迅速上升且都顯著高于CK，其中NaCl 1.5 g/L水平處理上升幅度最大。

圖1 不同濃度NaCl處理下白術(shù)種子萌發(fā)過程中相關(guān)生理指標(biāo)的影響Fig.1 The impacts of relevant physiological indicators during seed germination of treated with different concentrations of NaCl

2.4 NaCl溶液處理對白術(shù)種子萌發(fā)過程中可溶性糖和可溶性蛋白的影響

由圖1 D可知，用NaCl溶液處理可以顯著增加白術(shù)種子可溶性糖含量，隨著NaCl濃度的增加可溶性糖含量顯著增加，每個萌發(fā)階段的每個NaCl水平處理都顯著高于對照，從圖1 D中可看出隨著種子萌發(fā)進程的推進，種子中的可溶性糖含量不管是CK還是NaCl處理都在下降，但是NaCl處理組下降趨勢顯著低于CK，而從每個NaCl水平處理對可溶性糖含量影響下降趨勢來看，隨著NaCl濃度的增加下降的幅度就顯著降低，而且在2.0 g/L和2.5 g/L NaCl水平下種子萌發(fā)過程中的可溶性糖含量下降幅度很小，特別是第6天以后2.0 g/L和2.5 g/L NaCl水平處理下的可溶性糖含量顯著高于其他處理，初步說明當(dāng)NaCl濃度高于2.0 g/L時會對種子造成不可修復(fù)的損傷。而從圖1 E中可以看出白術(shù)種子在鹽脅迫下萌發(fā)時其可溶性蛋白含量隨著鹽濃度的增加而升高，萌發(fā)第1天最高，為9.80 mg/g；在鹽脅迫下萌發(fā)前3 d種子內(nèi)的可溶性蛋白含量在各個水平間都存在顯著差異且與濃度呈正相關(guān)，從第4天時開始緩和，說明種子在第4天開始恢復(fù)，而從第4天到第9天可以看出雖然種子的可溶性蛋白含量都有所下降，但是每個NaCl濃度水平處理下的可溶性蛋白含量都顯著高于CK，除第7天2.5 g/L NaCl處理下種子可溶性蛋白顯著高于其他水平處理之外，其余萌發(fā)階段的水平處理之間并無顯著差異，但顯著高于CK。說明NaCl處理對種子萌發(fā)傷害很大，甚至0.5 g/L水平都會造成嚴(yán)重傷害。

2.5 NaCl溶液處理對白術(shù)種子萌發(fā)過程中MDA的影響

圖1 F中顯示的白術(shù)種子在NaCl脅迫下萌發(fā)時整個萌發(fā)時期MDA的含量變化，結(jié)果顯示不同濃度的NaCl對白術(shù)種子萌發(fā)過程中MDA的含量影響巨大，可以看出種子萌發(fā)前4 d每個水平處理下MDA的含量都顯著高于CK，而第4 d之后隨著種子的慢慢修復(fù)，即各種氧化酶活性的增加導(dǎo)致MDA的含量也開始下降，在不同水平濃度NaCl處理下種子萌發(fā)過程中MDA的含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，增加的幅度和NaCl的濃度成正比，在2.5 g/L NaCl水平處理下增加幅度最大且最大值為17.77mol/mL FW；從趨勢上可知，從第4天開始后MDA的含量開始下降，但是下降趨勢在0.5g/L、1.0 g/L、1.5 g/L NaCl水平處理下降較急，而2.0 g/L和2.5 g/L NaCl水平處理下降較緩且MDA的含量顯著高于CK，并沒有下降到正常水平，相反從第5天在0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L NaCl水平處理下種子MDA的含量開始恢復(fù)到正常水平且與CK無顯著差異，說明當(dāng)NaCl濃度達到2.0 g/L以上時對種子的傷害巨大且恢復(fù)困難。

3 討論

3.1 白術(shù)種子萌發(fā)過程中生理指標(biāo)的變化

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，更是種苗生產(chǎn)的基礎(chǔ)途徑之一，種子萌發(fā)和幼苗生長是植物對環(huán)境脅迫較為敏感的時期，其生長和生理特征極易受到周圍環(huán)境的影響[8]，由于白術(shù)應(yīng)用廣泛，需求較大，全國各地皆有種植，但是其生產(chǎn)中存在品種退化和病蟲害嚴(yán)重等問題[9]，所以探明種子萌發(fā)生理及環(huán)境條件對白術(shù)種子萌發(fā)的影響甚為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著白術(shù)種子萌發(fā)進程的推進，種子SOD、POD和CAT的活性總體都顯著增高，而SOD和POD的活性在萌發(fā)前3 d緩慢下降，CAT的活性先緩慢升高然后緩慢下降，這可能是因為種子萌發(fā)前期這幾種酶需要重新合成或需要激活，進而導(dǎo)致SOD、POD和CAT的活性在萌發(fā)前3 d變化并不大，這點與凃峰等[10]的研究有相似之處；相反白術(shù)種子的可溶性糖和可溶性蛋白含量在整個萌發(fā)過程呈顯著下降趨勢，說明白術(shù)種子在萌發(fā)時大分子物質(zhì)在吸水之后快速分解，致使種子內(nèi)的可溶性糖和可溶性蛋白含量在萌發(fā)開始時顯著增加，但是后期新生組織和物質(zhì)的合成導(dǎo)致種子內(nèi)的可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著下降，這與楊敏等[11]對青蒿的研究基本一致，白術(shù)種子在整個萌發(fā)時期MDA的含量呈現(xiàn)先緩慢升高后降低趨勢，但萌發(fā)階段之間并沒有顯著差異。

3.2 不同NaCl濃度對白術(shù)種子萌發(fā)的影響

目前對于菊科蒼術(shù)屬植物蒼術(shù)和白術(shù)最適宜萌發(fā)環(huán)境條件有一定文獻報道[12-14]，但是對于在鹽脅迫下白術(shù)種子萌發(fā)過程相關(guān)生理指標(biāo)的變化研究較少，為探究此過程，本研究選擇了可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、SOD、POD和CAT 6項指標(biāo)來評價白術(shù)種子對鹽脅迫的響應(yīng)。SOD、POD和CAT是清除膜質(zhì)受損而產(chǎn)生的過氧化物，鹽脅迫下其活性將上升以消除膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是能充分體現(xiàn)鹽脅迫響應(yīng)的指標(biāo)之一[15]。研究顯示，在不同濃度NaCl脅迫下白術(shù)種子SOD和POD的活性在整個萌發(fā)時期總體呈升高趨勢，從響應(yīng)情況得出鹽脅迫導(dǎo)致白術(shù)種子細(xì)胞膜和胞內(nèi)相關(guān)酶的活性降低甚至受損，且膜質(zhì)過氧化程度高，此外試驗過程中1.0 g/L以上鹽脅迫浸種處理下白術(shù)種子萌發(fā)較差，說明白術(shù)種子耐鹽能力較差，在鹽的脅迫下極易導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境失衡，這與大多數(shù)的研究有相似之處[16-18]。其次，可溶性糖和可溶性蛋白是種子萌發(fā)不可或缺的基礎(chǔ)能源物質(zhì)，可溶性糖更是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，其含量有助于提高植物抗鹽性，MDA則反映細(xì)胞膜的受損程度，細(xì)胞膜遭受破壞將導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性下降進而增加MDA的含量[19,20]。白術(shù)種子萌發(fā)過程中可溶性糖和可溶性蛋白含量隨NaCl濃度的增高在整個萌發(fā)時期呈下降趨勢，但各處理都高于對照，說明白術(shù)種子對鹽脅迫響應(yīng)積極，但隨著鹽濃度增加其膜質(zhì)可能受損而導(dǎo)致可溶性糖含量被動增加，進而影響種子萌發(fā)。此外MDA的含量在鹽脅迫處理下都顯著高于對照，且當(dāng)NaCl濃度高于1.5 g/L時整個萌發(fā)時期都無法恢復(fù)正常水平，與已研究的結(jié)果吻合[21,22]。從MDA的含量即可推斷白術(shù)種子在鹽脅迫下其膜質(zhì)過氧化程度隨鹽濃度增加而增強，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損且通透性較強，因此導(dǎo)致可溶性糖含量上升，而此時種子嚴(yán)重傷害導(dǎo)致SOD、POD和CAT的活性也顯著下降，進而導(dǎo)致MDA無法被消除，外部表現(xiàn)為整體萌發(fā)狀況較差。

綜上所述，鹽脅迫嚴(yán)重影響白術(shù)種子萌發(fā)，造成白術(shù)種子膜質(zhì)嚴(yán)重受損，相關(guān)酶的活性降低，內(nèi)環(huán)境失衡進而導(dǎo)致萌發(fā)較差，所以種植白術(shù)應(yīng)避開鹽漬土壤。此外大量研究也表明連作會導(dǎo)致土壤負(fù)離子增加、酸度增加[23-27]，但有人報道藥用植物對土壤中的離子影響較大，不同程度地降低土壤中水溶性Na+、K+含量，還會降低NaCl處理土壤中的水溶性Cl-、SO42-和HCO3-的含量[28]，所以有待進一步探索鹽脅迫是否與連作障礙有聯(lián)系。