董娜娜 郭瑞娟 付愛芹

1煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，煙臺(tái) 264000；2煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院東院腫瘤內(nèi)科，煙臺(tái)264000

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和微小RNA(microRNA, miR)是兩類小分子非編碼RNA，兩者通過相互作用參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，可作為腫瘤靶向治療的分子靶點(diǎn)[1-3]。F-box和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白19反義RNA 1(FBXL19-AS1)屬于lncRNA，lncRNA FBXL19-AS1在胃癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]和乳腺癌[6]等腫瘤中表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程。但lncRNA FBXL19-AS1對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的影響未見報(bào)道。Starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA FBXL19-AS1可能靶向結(jié)合miR-339-3p。研究表明，miR-339-3p在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]；miR-339-3p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-339-3p可抑制結(jié)直腸癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]。但miR-339-3p對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的影響也未見報(bào)道。本研究檢測(cè)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，驗(yàn)證lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的靶向關(guān)系，以期闡明lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為胰腺癌治療提供新的分子靶點(diǎn)。

資料與方法

一、胰腺癌組織、細(xì)胞株lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p表達(dá)檢測(cè)

收集2017年1月至2019至8月間煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院手術(shù)切除且病理確診的73例胰腺癌患者的癌組織及匹配的癌旁正常胰腺組織(距離手術(shù)切緣>3 cm)。TNM分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期34例、Ⅳ期11例；低分化35例、中分化28例、高分化13例?；颊咝g(shù)前均未接受放療或化療等輔助治療。所有標(biāo)本取下后立即置-196℃液氮中保存。

應(yīng)用Trizol法抽提胰腺癌和癌旁組織總RNA，應(yīng)用 RNA逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒(大連寶生物工程有限公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說明書操作。轉(zhuǎn)錄的cDNA行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)。lncRNA FBXL19-AS1正向引物序列為5′-GGT-ACAACTACGGATATGA-3′，反向引物序列為5′-TACGTCTCGACCATTACGCA-3′；miR-339-3p正向引物序列為5′-CGACATACGACTACGAGATA-3′，反向引物序列為5′-CGATTTACGATACGCAAGACGA-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-CGACTC-AGCGACGAGTCGA-3′，反向引物序列為5′-CTA-CGATACGGGAACAACGTCCG-3′；內(nèi)參U6正向引物序列為5′-CGCTACGACTCGCGCTCTTC-3′，反向引物序列為5′-CTCGCGGCCAAGAGCTAGCG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值，采用公示2-△△Ct計(jì)算lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)管，取均值。

正常胰腺上皮細(xì)胞株hTERT-HPNE及胰腺癌細(xì)胞株Capan-1、SW1990和PaTu8988均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。常規(guī)復(fù)蘇、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用上述相同方法檢測(cè)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的表達(dá)量。

二、胰腺癌Capan-1細(xì)胞分組及檢測(cè)

1．Capan-1細(xì)胞分組：將Capan-1細(xì)胞分為NC組 (正常對(duì)照組)、si-NC組(轉(zhuǎn)染無意義陰性序列)、si-FBXL19-AS1組(轉(zhuǎn)染FBXL19-AS1小干擾RNA)，miR-NC組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照)、miR-339-3p組(轉(zhuǎn)染miR-339-3p過表達(dá)慢病毒載體)，si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p NC組(共轉(zhuǎn)染FBXL19-AS1 siRNA和miR-339-3p抑制劑陰性對(duì)照序列)、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組(共轉(zhuǎn)染FBXL19-AS1siRNA和miR-339-3p抑制劑)。所有siRNA、anti-miR構(gòu)建及慢病毒包裝均由上海生工生物工程有限公司完成。以病毒∶細(xì)胞為100∶1的比例感染細(xì)胞24 h，更新培養(yǎng)液，以含1 g/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)液處理24 h以殺死未被感染的細(xì)胞，取存活并感染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。

2．Capan-1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：取NC組、si-NC組、si-FBXL19-AS1組、miR-NC組、miR-339-3p組、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p NC組、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組Capan-1細(xì)胞，以2.5×104個(gè)/孔接種于96孔板，分別培養(yǎng)0、12、48、72 h，到時(shí)間點(diǎn)加入10 μl CCK-8(日本株式會(huì)社)繼續(xù)孵育2 h，上酶標(biāo)儀測(cè)每孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光值(A450值)。

3．Capan-1細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)：取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-1細(xì)胞，調(diào)整為細(xì)胞密度5.0×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。將Transwell小室(美國(guó)Corning公司)或預(yù)先在隔膜上室面鋪設(shè)Matrigel基質(zhì)膠并自然晾干后的Transwell小室置于24孔板。上室加100 μl細(xì)胞懸液，下室加500 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，輕輕擦去隔膜上室面未穿膜細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，置顯微鏡下以200倍隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

4．Capan-1細(xì)胞cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)檢測(cè)：取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-1細(xì)胞，以5.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后用RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。一抗cyclinD1工作濃度1∶500，MMP2、MMP9和β-actin工作濃度均1∶1 000，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗工作濃度1∶5 000。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的靶向關(guān)系驗(yàn)證

從Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://starbase.sysu.edu.cn)搜索lncRNA FBXL19-AS1d的潛在靶向基因，通過雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的靶向關(guān)系。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-1細(xì)胞，以1.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，將野生型(wild type，WT)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics或miR-NC，突變型(mutant type，MT)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至Capan-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解，應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，按試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織和各細(xì)胞株lncRNA FBXL19-AS1 和miR-339-3p表達(dá)量

胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)量分別為2.96±0.21和1.00±0.13，癌組織顯著高于癌旁正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=67.804，P<0.05)。胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織miR-339-3p表達(dá)量分別為0.37±0.05和1.00±0.11，癌組織顯著低于癌旁正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=44.548，P<0.05)。

Capan-1、SW1990及PaTu8988細(xì)胞lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)量分別為2.43±0.18、1.97±0.13和1.73±0.14，均顯著高于hTERT-HPNE細(xì)胞的1.00±0.07，miR-339-3p表達(dá)量分別為0.42±0.03、0.54±0.03和0.57±0.04，均顯著低于hTERT-HPNE細(xì)胞的1.00±0.05(F值分別為173.898、391.881，P值均<0.05)。其中以Capan-1細(xì)胞的lncRNA FBXL 19-AS1表達(dá)量最高， miR-339-3p表達(dá)量最低，故選擇Capan-1細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、敲減Capan-1細(xì)胞lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)

si-FBXL19-AS1組lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)水平顯著低于si-NC組(0.42±0.02比1.04±0.08，t=22.556，P=0.000)，表明抑制lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)的Capan-1細(xì)胞構(gòu)建成功。

與NC組或si-NC組比較，si-FBXL19-AS1組細(xì)胞A450值、遷移細(xì)胞數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)顯著下降，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而NC組與si-NC組各檢測(cè)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、圖1)。提示抑制lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)可以抑制Capan-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)。

表1 正常對(duì)照組、si-NC組、si-FBXL19-AS1組Capan-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

圖1 正常對(duì)照組(1)、si-NC組(2)、si-FBXL19-AS1組(3)Capan-1細(xì)胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

三、miR-339-3p過表達(dá)抑制Capan-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白的表達(dá)

miR-339-3p組miR-339-3p表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(1.73±0.14比1.00±0.07，t=13.991，P=0.000)，表明miR-339-3p過表達(dá)的Capan-1細(xì)胞株構(gòu)建成功。與miR-NC組比較，miR-339-3p組Capan-1細(xì)胞A450值、遷移細(xì)胞數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)顯著下降，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖2、表2)。

圖2 miR-NC組、miR-339-3p組Capan-1細(xì)胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

表2 miR-NC組與miR-339-3p組Capan-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

四、抑制miR-339-3p可逆轉(zhuǎn)敲減lncRNA FBXL19-AS1對(duì)Capan-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組miR-339-3p表達(dá)水平顯著低于si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC組(0.47±0.03比1.00±0.07)，表明抑制miR-339-3p 表達(dá)的si-FBXL19-AS1細(xì)胞株構(gòu)建成功。

與si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC組比較，si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組細(xì)胞A450值、遷移細(xì)胞數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)顯著上升，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表3、圖3)。提示抑制miR-339-3p可逆轉(zhuǎn)敲減lncRNA FBXL19-AS1對(duì)Capan-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

表3 si-lncRNA FBXL19-AS1+anti-miR-NC組與si-lncRNA FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組Capan-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

圖3 si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC組(1)、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組(2)Capan-1細(xì)胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

五、lncRNA FBXL19-AS1靶向調(diào)控miR-339-3p

通過Starbase生物信息學(xué)軟件檢索到lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics組Capan-1細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-lncRNA FBXL19-AS1和miR-NC組(0.47±0.04比1.00±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.763，P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染MT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics組與共轉(zhuǎn)染MT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-NC組Capan-1細(xì)胞的熒光素酶活性分別為1.03±0.11和1.01±0.09，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.422，P=0.679)。提示野生組存在lncRNA FBXL19-AS1靶向調(diào)控miR-339-3p，而突變組沉默了lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)，故不存在lncRNA FBXL19-AS1靶向調(diào)控miR-339-3p。

圖4 lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的結(jié)合位點(diǎn)

討 論

LncRNA是真核生物中廣泛存在的參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的小分子非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究表明，CASC19[ 9]、LINP1[10]和NT5E[11]等多種lncRNA在胰腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展進(jìn)程；而STXBP5-AS1[12]和MTSS1- AS[13]等lncRNA在胰腺癌中低表達(dá)，在胰腺癌的發(fā)展過程中起抑癌基因作用。lncRNA FBXL19-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，lncRNA FBXL19-AS1在乳腺癌細(xì)胞呈高表達(dá)，沉默其表達(dá)可削弱乳腺癌細(xì)胞增殖能力并加劇細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-876-5p/FOXM1有關(guān)[14]；肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA FBXL19-AS1高表達(dá)，且與肺腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)，敲減其表達(dá)可靶向上調(diào)miR-203-3p表達(dá)，阻滯肺腺癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，并抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，可作為肺腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)[15]；lncRNA FBXL19-AS1在結(jié)直腸癌高表達(dá)，敲減其表達(dá)可靶向結(jié)合并上調(diào)miR-203表達(dá)，減弱體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[16]。但目前未見lncRNA FBXL19-AS1影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織及Capan-1細(xì)胞lncRNA FBXL19-AS1表達(dá)升高，提示其可能促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展進(jìn)程；敲減lncRNA FBXL19-AS1可顯著降低胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示敲減lncRNA FBXL19-AS1可抑制胰腺癌細(xì)胞的惡性表型，延緩胰腺癌發(fā)展進(jìn)程，可作為胰腺癌治療的潛在的分子靶點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲受多種基因分子的調(diào)控，其中cyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控分子，可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]；MMP2和MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，參與降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[18]。本研究結(jié)果顯示，敲減lncRNA FBXL19-AS1可抑制胰腺癌細(xì)胞cyclinD1、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)，提示其可能通過調(diào)控cyclinD1、MMP2和MMP9的表達(dá)來影響胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

研究報(bào)道，miR-339-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其可靶向抑制IP6K2的表達(dá)，降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]；miR-339-3p在黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-339-3p可靶向抑制MCL1，減弱黑色素瘤細(xì)胞的侵襲性，可作為抑制黑色素瘤細(xì)胞侵襲的分子靶點(diǎn)[20]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織及細(xì)胞系中miR-339-3p的表達(dá)明顯降低，過表達(dá)miR-339-3p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲起抑制作用，提示miR-339-3p低表達(dá)是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素，抑制miR-339-3p可逆轉(zhuǎn)敲減lncRNA FBXL19-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示lncRNA FBXL19-AS1可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR- 339- 3p來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的惡性表型，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌發(fā)展進(jìn)程。通過Starbase生物信息學(xué)軟件和雙熒光素酶分析證實(shí)lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，lncRNA FBXL19-AS1靶向調(diào)控miR-339-3p，lncRNA FBXL19-AS1/miR-339-3p軸可能為胰腺癌的靶向治療提供新的分子靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突