宋婷婷，蔡榮珊，王 宏，劉月，伍振峰，楊 明，徐應(yīng)淑*，熊永愛*

1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563000

2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

放化療仍然是目前治療癌癥的主要手段，但其引起的骨髓抑制常導(dǎo)致患者造血功能下降、免疫力降低，阻礙放化療的順利進(jìn)行[1]。地榆皂苷I是地榆預(yù)防和治療骨髓抑制的關(guān)鍵成分[2-4]，然而其溶解性差、體內(nèi)半衰期短，限制了其藥效的發(fā)揮[5]。聚乙二醇1000 維生素E 琥珀酸酯（D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）具有增加疏水性藥物溶解度和包封率、延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期等功能[6]。TPGS 修飾的脂質(zhì)體還能避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，延長(zhǎng)脂質(zhì)體循環(huán)時(shí)間[7]。本研究旨在制備TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，優(yōu)化操作工藝條件，并對(duì)其形貌、粒徑、藥物釋放特性等進(jìn)行表征，以評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性和適用性。

1 儀器與材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；ME204E 電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；90Plus PALS 激光粒度儀，美國(guó)布魯克海文儀器公司；TL-650Y 超聲波細(xì)胞破碎儀，江蘇天翎儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JEM-1200EX 透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；TG18 微量高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；SHZ-82A 數(shù)顯恒溫振蕩器，金壇市朗博儀器制造有限公司；超濾離心管，美國(guó)Millipore 公司，截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000；透析袋，截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～14 000，北京索萊寶科技有限公司。

地榆皂苷I，實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.76%；地榆皂苷I對(duì)照品，批號(hào)MUST-17022502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.47%，成都曼思特生物科技有限公司；大豆磷脂S100，德國(guó)Lipoid 公司；聚乙二醇1000 維生素E 琥珀酸酯、DL-α-生育酚，上海阿拉丁試劑有限公司；膽固醇，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；甲醇、乙腈，HPLC 級(jí)；純化水；氯仿、聚山梨酯80 等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 地榆皂苷I 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 采用HPLC 法測(cè)定地榆皂苷I含量，Unitary C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（35∶65）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL，采用外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定。

2.1.2 專屬性考察 精密稱定地榆皂苷I對(duì)照品12.5 mg 置于25 mL 量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取適量地榆皂苷I對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，即得地榆皂苷I對(duì)照品溶液。取TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體混懸液0.5 mL，加適量甲醇破乳，超聲得到澄清透明溶液，表明已經(jīng)破乳完全，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。取空白脂質(zhì)體，同法制備陰性對(duì)照溶液。以陰性對(duì)照溶液作為空白對(duì)照，分別對(duì)對(duì)照品溶液及供試品溶液按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果表明，溶劑和輔料對(duì)地榆皂苷I測(cè)定無干擾，對(duì)照品溶液與供試品溶液的峰形良好，出峰時(shí)間一致，表明該測(cè)定方法專屬性良好。

圖1 陰性對(duì)照(A)、地榆皂苷I 對(duì)照品(B)和地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體供試品(C)的HPLC 圖Fig.1 HPLC spectrum of negative samples(A),ziyuglycoside I reference substances(B)and ziyuglycoside I long-circulating liposomes sample(C)

2.1.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取適量地榆皂苷I對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0、250.0 μg/mL 的溶液。按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。以峰面積（Y）對(duì)地榆皂苷I質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝1.329 2X＋2.622 8，r＝0.999 8。結(jié)果表明，地榆皂苷I在質(zhì)量濃度5.0～250.0 μg/mL 呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度考察 精密量取適量的地榆皂苷I對(duì)照品儲(chǔ)備液，加適量甲醇配制低、中、高（5、50、250 μg/mL）3 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，每日各進(jìn)樣5 次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果測(cè)得低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液的日內(nèi)精密度分別為 0.83%、1.17%、0.92%，日間精密度分別為1.47%、1.13%、0.98%。

2.1.5 加樣回收率考察 于0.5 mL 空白脂質(zhì)體混懸液中分別精密加入適量地榆皂苷I對(duì)照品溶液，然后加甲醇破乳，配制成質(zhì)量濃度為5、50、250 μg/mL 的供試品溶液，各供試品溶液平行制備3 份，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率分別為 101.14%、98.72%、99.82%，RSD 分別為1.34%、1.25%、0.58%。

2.2 地榆皂苷I 的提取及含量測(cè)定

采用3 步堿沉法[8]提取地榆皂苷I，將純化得到的地榆皂苷I按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC 色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定其含量。結(jié)果提取得到的地榆皂苷I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.76%。

2.3 地榆皂苷I 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法[9]制備包載地榆皂苷I的普通脂質(zhì)體和TPGS 包衣脂質(zhì)體。將處方量的地榆皂苷I、大豆磷脂、膽固醇和維生素E（含或不含TPGS）溶解在氯仿-甲醇（2∶1）混合溶劑中，置于干燥茄形瓶中，超聲溶解以獲得澄清溶液，在37 ℃恒溫水浴中減壓旋蒸以完全除去有機(jī)溶劑，在瓶壁上形成均勻透明的脂質(zhì)薄膜，然后加入pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液5 mL，37 ℃常壓水合2 h，充分振搖至水合完全，經(jīng)探頭超聲處理，以35%功率（總功率為650 W）超聲2 min（超聲3 s，間隔3 s，溫度過高時(shí)可用冰浴降溫），最終得到帶淡藍(lán)色乳光的脂質(zhì)體，儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中。

2.4 超濾離心法測(cè)定包封率

2.4.1 超濾膜吸附回收率的測(cè)定 配制質(zhì)量濃度分別為166.7、81.7、37.7 μg/mL 的地榆皂苷I溶液，從3種不同質(zhì)量濃度溶液中各取400 μL至超濾離心管中，7 000×g離心20 min，收集濾液，不更換超濾單元，再分別同法超濾3 次。將超濾前后的藥液按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算超濾膜吸附回收率。由結(jié)果（表1）可知，在各個(gè)質(zhì)量濃度下第2 份濾液的回收率符合要求，因此，可選擇飽和2 次后的超濾膜分離脂質(zhì)體與游離藥物。

表1 超濾膜吸附回收率的測(cè)定Table 1 Determination of adsorption recovery of ultrafiltration membrane

2.4.2 包封率和載藥量的測(cè)定 取過0.22 μm 濾膜的脂質(zhì)體混懸液200 μL 至超濾離心管中，7 000×g離心20 min，將超濾液加甲醇稀釋至1 mL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算游離藥物含量（m2）。同時(shí)取未經(jīng)超濾的地榆皂苷I脂質(zhì)體混懸液，按“2.1.2”項(xiàng)下操作破乳，測(cè)定藥物含量，計(jì)為總藥量（m1）。脂質(zhì)體中包載藥物和投入脂質(zhì)的總量為m3，按公式計(jì)算藥物包封率和載藥量。

包封率＝(m1－m2)/m1

載藥量＝(m1－m2)/m3

2.5 地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體處方優(yōu)化

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 影響地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制備過程的因素很多，本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)初步考察了大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比、TPGS 物質(zhì)的量百分比、藥物與大豆磷脂質(zhì)量比和超聲條件（超聲功率與時(shí)間）對(duì)地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。

（1）大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響：固定處方中大豆磷脂S100 為30 mg，TPGS 物質(zhì)的量百分比為6%，藥物與大豆磷脂質(zhì)量比為1∶4，30%超聲功率，超聲2 min。精密稱取處方量的成膜材料，按“2.3”項(xiàng)下地榆皂苷I脂質(zhì)體的制備方法制備脂質(zhì)體，考察大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比（6∶1、4∶1、3∶1、2∶1）對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。結(jié)果（表2）表明，當(dāng)大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4∶1 時(shí)，包封率較高，粒徑最小。膽固醇的加入可以提高脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，減少泡囊內(nèi)包封藥物的泄露，但過量的加入會(huì)使膜的形成變得困難。最終選擇大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4∶1 進(jìn)行后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)。

表2 大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 2 Effects of mass ratio of soybean phospholipid to cholesterol on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I long-circulating liposomes(,n=3)

表2 大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 2 Effects of mass ratio of soybean phospholipid to cholesterol on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I long-circulating liposomes(,n=3)

大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比 包封率/% 粒徑/nm 15∶1 73.19±0.48 92.78±0.59 6∶1 69.89±1.09 94.71±0.65 4∶1 76.25±0.49 93.40±0.11 3∶1 69.48±1.05 100.21±1.01 2∶1 68.21±0.84 106.31±0.88

（2）TPGS 物質(zhì)的量百分比對(duì)地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響：固定處方中其他輔料的用量和制備條件，精密稱取處方量的成膜材料，按“2.3”項(xiàng)下地榆皂苷I脂質(zhì)體的制備方法制備脂質(zhì)體，考察TPGS 物質(zhì)的量百分比（3%、6%、10%）對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。結(jié)果（表3）表明，當(dāng)TPGS 物質(zhì)的量百分比為10%時(shí)，包封率較高，粒徑較小?？赡苁且?yàn)門PGS 修飾脂質(zhì)體后，會(huì)在脂質(zhì)體表面形成一層水化層，減小脂質(zhì)體表面張力，阻止了脂質(zhì)體的聚集和融合，使粒子更穩(wěn)定，從而提高藥物包封率，減小脂質(zhì)體的粒徑[10]。因此，選擇TPGS 物質(zhì)的量百分比為10%進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

表3 TPGS 物質(zhì)的量百分比對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 3 Effects of molar percentage of TPGS on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I longcirculating liposomes(,n=3)

表3 TPGS 物質(zhì)的量百分比對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 3 Effects of molar percentage of TPGS on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I longcirculating liposomes(,n=3)

TPGS 物質(zhì)的量百分比/% 包封率/% 粒徑/nm 3 70.35±1.18 103.20±1.10 6 69.47±1.35 100.60±0.58 10 76.25±1.44 93.40±0.11

（3）藥物與大豆磷脂質(zhì)量比對(duì)地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響：固定處方中其他輔料的用量和制備條件，精密稱取處方量的成膜材料，按“2.3”項(xiàng)下地榆皂苷I脂質(zhì)體的制備方法制備脂質(zhì)體，考察藥物與大豆磷脂質(zhì)量比（1∶20、1∶6、1∶4、1∶3、1∶2）對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。由表4 可知，藥物與大豆磷脂質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體的粒徑和包封率的影響較大。當(dāng)藥物與大豆磷脂質(zhì)量比從1∶20 變?yōu)?∶2 時(shí)，包封率降低，可通過包封地榆皂苷I的脂質(zhì)體囊泡體積有限來解釋。藥物與大豆磷脂質(zhì)量比的增加導(dǎo)致平均粒徑的增加，可能是因?yàn)樗幬餄舛仍酱?，超聲分散的機(jī)械力越大。當(dāng)藥物與大豆磷脂質(zhì)量比為1∶20 時(shí)，包封率較高，但載藥量較低，考慮到后續(xù)藥動(dòng)學(xué)以及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，選擇1∶6～1∶2 進(jìn)一步篩選，選擇藥物與大豆磷脂質(zhì)量比為1∶4 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

表4 藥物與大豆磷脂質(zhì)量比對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 4 Effects of mass ratio of drug to soybean phospholipid on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I long-circulating liposomes(,n=3)

表4 藥物與大豆磷脂質(zhì)量比對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 4 Effects of mass ratio of drug to soybean phospholipid on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I long-circulating liposomes(,n=3)

藥物與大豆磷脂質(zhì)量比 包封率/% 粒徑/nm 1∶20 90.88±1.41 100.53±0.38 1∶6 76.80±1.45 91.67±0.48 1∶4 76.25±0.64 93.40±0.11 1∶3 61.67±1.08 107.92±0.24 1∶2 56.30±1.88 126.69±0.64

（4）超聲條件對(duì)地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響：固定處方中其他輔料的用量和制備條件，精密稱取處方量的成膜材料，按“2.3”項(xiàng)下地榆皂苷I脂質(zhì)體的制備方法制備脂質(zhì)體，考察超聲條件（30%功率、2 min，35%功率、2 min，30%功率、3 min，35%功率、3 min）對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。由結(jié)果（表5）可知，當(dāng)30%超聲功率（總功率為650 W），超聲時(shí)間從2 min 增加到3 min 時(shí)，平均粒徑減小，包封率變化不大。當(dāng)35%超聲功率、超聲時(shí)間為2 min 時(shí)，脂質(zhì)體的包封率較高，粒徑較小。最終結(jié)果表明，超聲條件對(duì)脂質(zhì)體的粒徑和包封率影響不大，選擇超聲條件為超聲功率35%，超聲2 min 制備脂質(zhì)體。

表5 超聲條件對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 5 Effects of ultrasonic conditions on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I longcirculating liposomes(,n=3)

表5 超聲條件對(duì)地榆皂苷I 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(,n=3)Table 5 Effects of ultrasonic conditions on particle size and encapsulation efficiency of ziyuglycoside I longcirculating liposomes(,n=3)

超聲功率和時(shí)間（總功率為650 W） 包封率/% 粒徑/nm 30%，2 min 71.85±0.87 98.32±0.50 30%，3 min 73.10±1.27 94.76±1.18 35%，2 min 76.25±1.84 93.40±0.11 35%，3 min 71.62±1.13 94.88±0.21

2.5.2 Box-Behnken 響應(yīng)面分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了顯著變量及其優(yōu)選水平，因素水平見表6。通過Box-Behnken 響應(yīng)面分析法對(duì)大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比（X1）、藥物與大豆磷脂質(zhì)量比（X2）、TPGS 物質(zhì)的量百分比（X3）3 個(gè)自變量進(jìn)行處方優(yōu)化，以地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體包封率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 6 Box-Behnken experiment design and results

結(jié)果通過Design expert 10.04 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析?；貧w方程為Y＝77.23－1.03X1－11.78X2＋4.58X3－3.61X1X2＋3.39X1X3＋1.12X2X3－7.37X12－11.16X22－3.93X32，R2＝0.983 0。P值表示因變量和自變量之間線性關(guān)系的顯著性，回歸方程的方差分析結(jié)果見表7。由顯著性結(jié)果可知，X3、X1X2、X1X3、X12、X32對(duì)包封率影響顯著，X2、X22對(duì)包封率的影響非常顯著。自變量及其相互作用對(duì)包封率的影響見圖2所示的響應(yīng)面曲線。模型的概率P＜0.000 1，表明模型極顯著，方程的響應(yīng)值與自變量間線性關(guān)系顯著，且方程的失擬項(xiàng)F值為2.86（P＞0.05）不顯著，說明該回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好，回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)性。

表7 包封率回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of entrapment efficiency regression equation

圖2 以包封率為指標(biāo)的三維響應(yīng)面曲線圖Fig.2 Three-dimensional response surface curve with encapsulation efficiency as an indicator

根據(jù)分析結(jié)果得出地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的最佳處方條件為大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4.6∶1；藥物與大豆磷脂質(zhì)量比為1∶5；TPGS 物質(zhì)的量百分比為7.8%。根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)行處方驗(yàn)證，測(cè)得平均包封率為79.89%（n＝3），接近理論包封率80.59%（n＝3），平均載藥量為10.48%（n＝3）。

2.6 表征

2.6.1 微觀形態(tài) 取少量TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體混懸液，用蒸餾水稀釋至一定濃度，并將1 滴脂質(zhì)體樣品滴至銅網(wǎng)表面，真空干燥，用1%磷鎢酸溶液負(fù)染30 s，最后用透射電鏡觀察脂質(zhì)體的微觀形態(tài)。結(jié)果顯示，TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體呈球形或類球形雙層結(jié)構(gòu)，粒子間無聚集現(xiàn)象，分布較均勻（圖3）。

圖3 TPGS修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體透射電鏡圖Fig.3 Micromorphology of TPGS modified ziyuglycoside I long-circulating liposomes

2.6.2 粒徑及Zeta 電位測(cè)定 取脂質(zhì)體樣品，用去離子水稀釋10 倍至計(jì)數(shù)率約為500 kcps，采用激光粒度儀測(cè)定脂質(zhì)體粒徑、多分散性和Zeta 電位。Zeta 電位是衡量電荷量的重要指標(biāo)，通常較高的Zeta 電位（絕對(duì)值大于30 mV），表示系統(tǒng)更穩(wěn)定[11]。結(jié)果測(cè)得TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑為（95.79±0.81）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.048±0.007，說明脂質(zhì)體的粒徑分布比較均勻，可能是TPGS 所含有的PEG 鏈在脂質(zhì)體表面形成了親水性保護(hù)層，使脂質(zhì)體更穩(wěn)定，均一性提高[12]（圖4）。Zeta 電位為（-38.60±0.97）mV，說明TPGS修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體表面荷負(fù)電，帶電脂質(zhì)體可以減少聚集和融合，增加穩(wěn)定性（圖5）。脂質(zhì)體的理化參數(shù)見表8。

圖4 TPGS修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of TPGS modified ziyuglycoside I long-circulating liposomes

圖5 TPGS修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體電位Fig.5 Potential of TPGS modified ziyuglycoside I long-circulating liposomes

表8 脂質(zhì)體理化參數(shù)(,n=3)Table 8 Physical and chemical parameters of liposomes(,n=3)

表8 脂質(zhì)體理化參數(shù)(,n=3)Table 8 Physical and chemical parameters of liposomes(,n=3)

樣品 粒徑/nm PDI Zeta 電位/mV空白脂質(zhì)體 93.87±0.32 0.201±0.012-37.57±0.50 TPGS 修飾脂質(zhì)體 95.79±0.81 0.048±0.007-38.60±0.97普通脂質(zhì)體 128.84±0.98 0.181±0.010-26.54±0.38

2.6.3 穩(wěn)定性考察 將測(cè)定包封率后的脂質(zhì)體儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中，分別于儲(chǔ)存的第10、20、30 天取出，觀察外觀，并測(cè)定脂質(zhì)體的包封率、粒徑和Zeta電位，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，TPGS 修飾的地榆皂苷I脂質(zhì)體在4 ℃環(huán)境中放置30 d，脂質(zhì)體外觀性狀無明顯變化，溶液仍呈均一、穩(wěn)定狀態(tài)。平均粒徑、PDI、Zeta 電位和藥物包封率結(jié)果見表9，變化幅度較小，表明該脂質(zhì)體樣品在低溫（4 ℃）條件下放置30 d 穩(wěn)定性良好。

表9 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察結(jié)果(,n=3)Table 9 Results of liposome stability(,n=3)

表9 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察結(jié)果(,n=3)Table 9 Results of liposome stability(,n=3)

t/d 粒徑/nm PDI Zeta 電位/mV 包封率/%0 95.35±0.38 0.168±0.011-38.17±0.63 77.85±0.77 10 95.92±0.39 0.191±0.007-36.84±0.61 76.30±0.08 20 97.65±0.56 0.192±0.006-37.42±0.17 74.49±0.47 30 98.08±0.94 0.196±0.003-36.30±0.90 73.98±0.85

2.6.4 體外釋放度 采用透析袋擴(kuò)散法[13]考察地榆皂苷I脂質(zhì)體的體外釋放情況。精密移取質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 的地榆皂苷I脂質(zhì)體、TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、地榆皂苷I甲醇溶液各1 mL，分別裝入經(jīng)預(yù)處理的透析袋中。將透析袋密封并浸入30 mL 含0.5 mg/mL 聚山梨酯80 的PBS 溶液中（pH 7.4），溫度為（37.0±0.5）℃，以100 r/min恒溫振蕩。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 取出1 mL 釋放介質(zhì)，過0.22 μm 濾膜于進(jìn)樣小瓶中，同時(shí)補(bǔ)充等溫等體積的釋放介質(zhì)。樣品中藥物質(zhì)量濃度按上述HPLC 法測(cè)定，并按公式計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的藥物累積釋放率（Q），繪制累積釋放曲線。

V0為釋放介質(zhì)總體積（mL），Ci和Cn為第i、n時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度（mg/mL），V為取樣體積（mL），m表示樣品中地榆皂苷I的總質(zhì)量

圖6 顯示了游離地榆皂苷I溶液、地榆皂苷I脂質(zhì)體和TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體在含0.5%聚山梨酯80 的PBS 溶液中的累積釋放率。相比于游離地榆皂苷I溶液，2 種地榆皂苷I脂質(zhì)體均表現(xiàn)出一定的緩釋特性。24 h 后，地榆皂苷I脂質(zhì)體和TPGS 修飾的地榆皂苷I脂質(zhì)體的累積釋放率分別為73.53%、75.89%，達(dá)到最大累積釋放量，之后釋放趨于平緩。而游離地榆皂苷I溶液在12 h后的累積釋放率達(dá)到90%以上。兩種脂質(zhì)體顯示出控制釋放超過1 d，沒有檢測(cè)到藥物的突釋現(xiàn)象，這表明藥物不位于脂質(zhì)體表面，而是位于其核心。據(jù)報(bào)道，TPGS 影響納米粒子藥物釋放系統(tǒng)的釋放行為，藥物的持續(xù)釋放可歸因于脂質(zhì)體載體材料的延遲擴(kuò)散。

圖6 游離地榆皂苷I 溶液、地榆皂苷I 脂質(zhì)體和TPGS修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的體外釋放曲線Fig.6 In vitro release curve of free ziyuglycoside I,ziyuglycoside I liposomes and TPGS modified ziyuglycoside I long-circulating liposomes

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，操作簡(jiǎn)便，易獲得形貌和粒徑較好的樣品。在薄膜分散法中，磷脂的水化是很關(guān)鍵的步驟，在分散過程中，干燥的磷脂膜之間發(fā)生了有規(guī)律的重排。加入水相后，有序的磷脂層從壁上脫離從而卷曲形成脂質(zhì)體[14]，其中水化溫度和水化時(shí)間的控制對(duì)樣品能否成功制備至關(guān)重要，水化溫度必須高于磷脂的相轉(zhuǎn)變溫度。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定的水化溫度為37 ℃，水化時(shí)間為2 h，結(jié)果表明該條件下磷脂水化很充分，所制備的樣品粒度均勻，久置無沉淀產(chǎn)生。最終制得的TPGS 修飾的地榆皂苷I長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好，具有較高的包封率和載藥量，同時(shí)也展現(xiàn)出良好的緩釋效果。

地榆皂苷I可溶于甲醇、甲醇-氯仿混合溶劑、DMSO 等有機(jī)溶劑，而不溶于氯仿。而薄膜分散法通常選擇氯仿或氯仿-甲醇混合溶劑溶解膜材，因此本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-氯仿混合溶劑，成膜性較好。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑的殘留會(huì)影響磷脂的聚集狀態(tài)，如體系中殘留較大量的氯仿，獲得的產(chǎn)品中有可能存在乳滴，從而使得制備的脂質(zhì)體不穩(wěn)定，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，因此須嚴(yán)格控制有機(jī)溶劑的殘留量。磷脂雙分子層構(gòu)成脂質(zhì)體的基本骨架，不飽和磷脂在脂質(zhì)體制備和儲(chǔ)存過程中易被氧化，體內(nèi)循環(huán)中會(huì)導(dǎo)致藥物快速泄露。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，得知可在制備過程中添加脂溶性抗氧劑維生素E，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，所制備的脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好。

實(shí)驗(yàn)中測(cè)得地榆皂苷I在水中的溶解度為0.25 mg/mL，極微溶解，所以游離地榆皂苷I在脂質(zhì)體制劑的外水介質(zhì)中以2 種形式存在：即地榆皂苷I的游離未溶解形式和游離溶解形式，且游離溶解形式的地榆皂苷I不能忽略。包封率是脂質(zhì)體處方篩選及質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，文獻(xiàn)報(bào)道[15]測(cè)定包封率的方法有凝膠過濾法、超速離心法、透析法等，但這幾種方法儀器要求條件高、繁瑣，本實(shí)驗(yàn)使用超濾離心法測(cè)定包封率，方便、快速，且重現(xiàn)性好，更適于生產(chǎn)中進(jìn)行質(zhì)量控制。在包封率的測(cè)定中，通過0.22 μm 微孔濾膜濾過，將游離的未溶解形式的地榆皂苷I從脂質(zhì)體混懸液中除去。將濾液（由脂質(zhì)體包封的地榆皂苷I和游離的溶解形式地榆皂苷I組成）置于超濾離心管中，離心進(jìn)行分離。在離心的過程中，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)熱，而溫度升高會(huì)影響脂質(zhì)體穩(wěn)定性，因此，最終選擇的離心時(shí)間為20 min。結(jié)果得到的超濾液均為澄清狀態(tài)，說明分離完全，超濾離心法可用于地榆皂苷I脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，為解決地榆皂苷I在PBS 介質(zhì)中溶解度低的問題，通過在釋放介質(zhì)中加入0.5%聚山梨酯80 滿足了漏槽條件。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突