劉恬佳，邱智東，邱 野，陳亞君，胡 爽，劉 達

長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林 長春 130117

外泌體具有獨特的形態(tài)和成分特征，它包含在由多個核內(nèi)體與質(zhì)膜融合形成的多泡小體中，直徑為30～150 nm，是一種具有脂質(zhì)雙層膜結構的囊泡。外泌體中攜帶母體細胞特征性生物信息分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 和非編碼RNA 等，具有天然的分子轉運特性和良好的生物相容性[1]。近年來對于外泌體領域的研究飛速發(fā)展，主要集中在心血管[2]、腫瘤[3]、神經(jīng)系統(tǒng)[4]、干細胞[5]等方面。但是國內(nèi)外對于外泌體的研究主要集中在動物外泌體上，而植物外泌體的研究還處在初步階段。盡管對其起源、組成及其功能的研究甚少，但是一些研究已經(jīng)表明植物來源的外泌體可能參與植物細胞間的細胞通訊，是能夠作為調(diào)節(jié)植物先天免疫的手段。目前已經(jīng)成功從葡萄[6]、生姜[7]、小麥[8]、檸檬[9]等植物中成功提取出外泌體并證實其生物活性。

人參因具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[10-11]而深受眾人喜愛。近年來人參被關注到具有心臟保護的作用，如人參皂苷Re 可減輕過氧化氫對心肌細胞的毒性并增加一氧化氮（NO）生成發(fā)揮多種有利于心臟保護的作用[12-13]。Zhu 等[14]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1通過抗氧化作用和降低細胞內(nèi)鈣水平提高缺氧心肌細胞的細胞活力。人參皂苷Rb1也可通過多種機制發(fā)揮心臟保護作用[15]。Cui 等[16]從實驗和臨床研究中總結了人參、人參皂苷和人參制品對缺血和再灌注心肌損傷的直接保護作用的證據(jù)。現(xiàn)有報道對人參根中皂苷、多糖等成分研究較多，但這些成分生物利用度較低。為了解決這一問題，在植物制劑的研究中科學研究逐漸側重于開發(fā)新的藥物遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、外泌體、納米顆粒等。外泌體本身可攜帶原始細胞的表面受體和配體發(fā)揮作用并且可以潛在地提高生物利用度，提高藥物的有效性和安全性[8-9,17]。

多柔比星（doxorubicin）是一種高效廣譜的抗生素，在癌癥治療中得到廣泛應用[18-20]。然而，長期使用多柔比星可對機體產(chǎn)生一些嚴重的不良反應，特別是心臟毒性[21-23]。隨著多柔比星累積劑量的增加，患者發(fā)生多柔比星誘導的心臟毒性風險將會加重[24]。一旦發(fā)生心力衰竭，患者的死亡率將顯著增加。因此，多柔比星引起的心臟毒性限制了其臨床應用[25]。本課題成功地通過差速離心、密度梯度離心等方法從人參根中分離純化了外泌體，并考察其對多柔比星誘導的心臟毒性的保護作用，為治療多柔比星誘導心臟毒性提供潛在的藥物靶點。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Smart R17 Plus 型高速冷凍離心機，韓國Hanil Science Industrial 公司；wX＋Ultra Series 型超速離心機、Countess II FL 型自動細胞計數(shù)儀、371 型CO2恒溫培養(yǎng)箱、1384 型生物安全柜、iBright FL1000型多功能凝膠成像系統(tǒng)、AMAFD 1000 型熒光顯微鏡，Thermo Fisher Scientific 公司；Spectra Max Paradigm 型酶標儀，美谷分子儀器有限公司；Power PacTMBasic 型蛋白質(zhì)電泳儀，Bio-Rad 公司；A00-1-1102 型流式細胞儀，Beckman Cytoflex 公司；Jeol1230 型透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；ZetaView 型納米顆粒跟蹤分析儀，德國Particle Metrix 公司。

1.2 藥材與試劑

人參供試樣品均采自吉林省東南部長白山西麓撫松縣北崗鎮(zhèn)農(nóng)田人參栽培基地（42°24′48″N，127°31′55″E，海拔760 m）。經(jīng)長春中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為五加科人參屬植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的新鮮根和根莖。鹽酸多柔比星，北京索萊寶科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥99%，批號D8740，規(guī)格25 mg/瓶；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibco 公司；BCA 蛋白定量測試盒、極超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；PBS、胰蛋白酶、青霉素鏈酶素雙抗，Hyclone 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒，博士德生物工程有限公司；碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素，Sigma 公司；臺盼蘭、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Hoechst33342 染色液，北京索萊寶科技有限公司；抗體 β 肌動蛋白（β-actin）、凋亡相關蛋白B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細胞色素C（cytochrome C，Cyt C），Cell Signaling Technology公司；超純水，F(xiàn)isher Chemical 公司；磷鎢酸溶液，北京中鏡科儀技術有限公司。

1.3 細胞株

大鼠心肌H9C2 細胞來源于廣州賽庫生物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 人參根外泌體的提取

選取1 kg 新鮮人參根清洗后進行破碎。采用差速離心法依次以1000×g離心10 min，3000×g離心20 min，10 000×g離心30 min，取上清。將上清液置于固定角轉子中，以100 000×g離心1 h，沉淀懸浮于1 mL PBS 中。采用密度梯度離心法將樣品轉至30%、45%、60%蔗糖溶液150 000×g離心2 h，收集30%～45%蔗糖溶液中間層，加等量PBS 洗去蔗糖150 000×g離心1 h，收集沉淀，1 mL PBS 吹懸沉淀，得到外泌體溶液。

圖1 人參根外泌體分離主要步驟及結果示意圖Fig.1 Schematic representation of major steps and results of ginseng root exosome separation

2.2 人參根外泌體的表征

2.2.1 TEM 檢測 用吸管取1 小滴樣品于蠟盤上，取銅網(wǎng)使有支持膜的表面與樣品液表面接觸，靜置3～5 min 取出，取出銅網(wǎng)，用濾紙條吸除多余的液滴，稍晾干。取3%磷鎢酸溶液，滴1 小滴于臘盤上。吸附有樣品的銅網(wǎng)放置于染液表面（樣品與染液接觸），靜置3～5 min。取出銅網(wǎng)，用濾紙條吸除多余的液滴，白熾燈下晾干。TEM 拍照（標尺分別為100、200 nm），觀察人參根外泌體的形態(tài)，結果清晰可見提取出的人參根外泌體形態(tài)呈茶托狀，具有雙層膜結構且膜結構完整，結果見圖2。

圖2 人參根外泌體TEM 下形態(tài)觀察Fig.2 Morphology of ginseng root exosomes under TEM

2.2.2 納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術分析人參根外泌體粒徑 分離的外泌體樣品用1×PBS 緩沖液適當稀釋，應用ZetaView PMX 110 儀器和相應軟件 Zeta View 8.04.02，使用納米粒子跟蹤分析（NTA）測量外泌體的粒徑和濃度（ZetaView 系統(tǒng)用110 nm 的聚苯乙烯顆粒進行校準，溫度維持在23、37 ℃）。通過NTA 粒徑分析檢測到112.7 nm 粒徑長度的人參根外泌體占總人參根外泌體的92.7%，結果見圖3 和表1。綜上所述，根據(jù)其形態(tài)和大小分析可以確定人參根中提取出的天然納米囊泡為外泌體。

圖3 人參根外泌體NTA 粒徑分析Fig.3 NTA particle size analysis of ginseng root exosomes

表1 人參根外泌體NTA 粒徑峰值分析結果Table 1 Results of NTA particle size peak analysis of ginseng root exosomes

2.2.3 人參根外泌體中蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍蛋白法測定人參根外泌體中蛋白含量。按照考馬斯亮藍貯備液與雙蒸水為1∶4 的比例進行配制，備用。分別配制空白組、標準組、測定組樣品，空白組取0.05 mL 雙蒸水與3 mL 考馬斯亮藍顯色液混勻制得；標準組取0.05 mL 牛血清白蛋白（BSA）標準品（質(zhì)量濃度0.524 g/L）與3 mL 考馬斯亮藍顯色液混勻制得；測定組取人參根外泌體樣品0.05 mL 與3 mL 考馬斯亮藍顯色液混勻制得?；靹蚝蟮目瞻捉M、標準組、測定組樣品靜置10 min后，分別取200 μL 于595 nm 處測定吸光度（A）值，每組重復3 次。最終得到測定組A值為0.229 1，標準組A值為0.203 9，空白組A值為0.144 8，根據(jù)計算公式，測得人參根外泌體中總蛋白的含量為2.992 μg/g。

待測樣本蛋白質(zhì)量濃度＝(A測定－A空白)/(A標準－A空白)×標準品質(zhì)量濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)

2.2.4 蛋白組學分析 取等量樣品蛋白進行酶解，用裂解液將體積調(diào)整至一致，加入二硫蘇糖醇（DTT）使其終濃度為5 mmol/L，56 ℃還原30 min。加入碘乙酰胺（IAA）使其終濃度為11 mmol/L，室溫避光孵育15 min。將烷基化好的樣本轉移至超濾管，室溫12 000×g離心20 min，用8 mol/L 尿素置換3 次，再用置換buffer 置換尿素3 次，以蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1∶50 的比例加入胰蛋白酶，酶解過夜。室溫12 000×g離心10 min 回收肽段，再用超純水回收肽段1 次，合并2 次肽段溶液，酸化后進行Stage Tip 除鹽。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行分析[26-27]，得到總譜圖數(shù)為87 242，匹配譜圖數(shù)為22 605。通過譜圖解析共鑒定到22 605 條肽段，其中特異性肽段為19 219，鑒定到5585 個蛋白。

2.2.5 Small RNA（sRNA）測序分析 使用AASRA和cmsearch 軟件對人參根外泌體中所有sRNA 與各類RNA 進行比對。在比對過程中，可能存在1 個sRNA 同時比對上2 種不同的注釋信息的情況。為了使每個sRNA 有唯一的注釋，按照MiRbase＞pirnabank＞snoRNA（human/plant）＞Rfam＞other sRNA 的優(yōu)先級順序?qū)RNA 遍歷注釋。鑒定到人參根外泌體中各類sRNA 所占比例如表2所示。

表2 人參根外泌體中各類sRNA 所占比例Table 2 Proportion of sRNA in exosomes of ginseng roots exosomes

2.3 人參根外泌體對多柔比星誘導的心肌損傷保護作用機制

2.3.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 大鼠心肌H9C2 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試驗分為3 組，分別為對照組、模型組（1 μmol/L 多柔比星）和藥物干預組（1 μmol/L 多柔比星＋不同質(zhì)量濃度20、40、80 μg/mL 的人參根外泌體）處理24 h。

2.3.2 統(tǒng)計學分析 所有研究均進行至少3 次的生物學重復實驗，數(shù)據(jù)以形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s檢驗。統(tǒng)計學分析和作圖應用 GraphPad Prism 8 和ImageJ 軟件。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析應用MaxQuant 軟件。

2.3.3 人參根外泌體對H9C2 細胞的細胞毒性測定取對數(shù)生長期的H9C2 細胞用胰蛋白酶消化，離心，重懸細胞，臺盼蘭染色計數(shù)。將細胞懸液稀釋成密度5×103個/mL，接種于96 孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 細胞貼壁后，開始加藥處理。分別加入質(zhì)量濃度為0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL 的人參根外泌體溶液每孔200 μL，每組設置6 個復孔，將96 孔板重新放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后棄去培養(yǎng)液，重新每孔加入新培養(yǎng)液100 μL、CCK-8 10 μL，培養(yǎng)箱中孵育2～4 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的A值，取平均值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A樣品－A空白)/(A對照－A空白)

其中，空白組只含有培養(yǎng)基，僅用于計算細胞存活率，對照組是細胞不加藥，樣品組是細胞加藥。結果見表3，人參根外泌體5～100 μg/mL 質(zhì)量濃度作用于H9C2 細胞時，對H9C2 細胞無毒性，最終選擇人參根外泌體20、40、80 μg/mL 進行以下實驗。

表3 不同質(zhì)量濃度人參根外泌體溶液對H9C2 細胞存活率的影響(,n=3)Table 3 Effects of different concentrations of ginseng root exosomes solution on survival rate of H9C2 cells(,n=3)

表3 不同質(zhì)量濃度人參根外泌體溶液對H9C2 細胞存活率的影響(,n=3)Table 3 Effects of different concentrations of ginseng root exosomes solution on survival rate of H9C2 cells(,n=3)

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)細胞存活率/%對照-100.00±0.03給藥 5 99.95±0.07 10 100.01±0.02 20 99.98±0.03 40 100.02±0.02 60 99.99±0.01 80 99.90±0.05 100 99.96±0.06

2.3.4 多柔比星誘導H9C2 細胞損傷濃度的篩選為選擇合適多柔比星造模的劑量，按“2.3.3”項下方法處理，每個孔分別加入濃度為0、0.5、1、2、4、10 μmol/L 的多柔比星溶液200 μL，每組設置6 個復孔。測定細胞存活率，取平均值作為實驗結果。使用GraphPad Prism 軟件計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值，結果見表4。隨著多柔比星處理濃度的不斷增加，H9C2 細胞的存活率明顯降低，根據(jù)細胞的存活率計算IC50值為1.770 μmol/L。根據(jù)實際所需最終選擇H9C2 細胞的多柔比星誘導濃度為1 μmol/L。

表4 不同濃度多柔比星對 H9C2 細胞存活率的影響(,n=3)Table 4 Effect of different concentrations of doxorubicin on survival rate of H9C2 cells(,n=3)

表4 不同濃度多柔比星對 H9C2 細胞存活率的影響(,n=3)Table 4 Effect of different concentrations of doxorubicin on survival rate of H9C2 cells(,n=3)

組別 質(zhì)量濃度/(μmol·L-1)細胞存活率/%對照-100.00±0.01給藥 0.5 76.83±0.05 1 62.84±0.05 2 46.33±0.11 4 29.33±0.02 10 15.16±0.07

2.3.5 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞存活率的影響 按“2.3.3”項下方法處理，每孔加入1 μmol/L 的多柔比星溶液200 μL，12 h 后棄去多柔比星溶液，重新分別加入質(zhì)量濃度分別為20、40、80 μg/mL 人參根外泌體溶液，每孔200 μL，24 h 后棄去原有培養(yǎng)液，重新每孔加入新培養(yǎng)液100 μL，CCK-8 10 μL，培養(yǎng)箱中孵育2～4 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的A值，取平均值，計算細胞存活率，結果見表5。與對照組相比，模型組H9C2細胞經(jīng)多柔比星處理后，細胞活力顯著減弱（P＜0.001）。與模型組相比，人參根外泌體40、80 μg/mL給藥組H9C2 細胞存活率顯著提高（P＜0.01、0.001），提示，人參根外泌體能劑量相關地改善多柔比星對H9C2 細胞增殖的抑制。

表5 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞存活率的影響(,n=3)Table 5 Effect of ginseng root exosomes on doxorubicindamaged H9C2 cells viability(,n=3)

表5 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞存活率的影響(,n=3)Table 5 Effect of ginseng root exosomes on doxorubicindamaged H9C2 cells viability(,n=3)

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001###P＜0.001 vs control group;**P﹤0.01 ***P＜0.001 vs model group

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)細胞存活率/%對照-100.00±0.03模型 1 μmol·L-1 66.53±0.05###人參根外泌體 20 76.74±0.08 40 82.27±0.11**80 92.51±0.06***

2.3.6 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞凋亡的影響（Hochest 染色實驗法） 取對數(shù)生長期的H9C2 細胞，胰蛋白酶消化并收集細胞，按照3×105個/mL 密度接種于6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h細胞貼壁后棄上清液，加入1 μmol/L 的多柔比星溶液，12 h 后棄上清，加入不同質(zhì)量濃度的人參根外泌體（0、20、40、80 μg/mL）處理細胞，培養(yǎng)24 h后棄去各孔中培養(yǎng)基，加入少量Hoechst 33342 工作液，加入工作液的體積宜覆蓋住6 孔板中的細胞即可，混勻。室溫孵育20 min。吸出Hoechst 33342染色液，用PBS 洗滌3 次，每次5 min。直接在熒光顯微鏡下觀察。Hoechst 熒光染料檢測細胞凋亡結果見圖4，多柔比星損傷后細胞形態(tài)發(fā)生染色質(zhì)固縮，細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染的比例顯著增多，即凋亡的細胞顯著增加。隨著給藥組人參根外泌體溶液濃度增加，上述現(xiàn)象逐漸減輕。

圖4 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of ginseng root exosomes on doxorubicindamaged H9C2 cells apoptosis

2.3.7 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞線粒體膜電位的影響（JC-1 染色實驗法） 細胞處理方法同“2.3.6”項，棄去各孔中培養(yǎng)基，加入少量JC-1 工作液，加入工作液的體積宜覆蓋住6 孔板中的細胞即可，混勻。細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結束后吸除工作液，用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次，加入2 mL 細胞培養(yǎng)液。直接在熒光顯微鏡下觀察。

線粒體通路是參與細胞凋亡發(fā)生最經(jīng)典的通路之一，在細胞凋亡的早期線粒體結構會發(fā)生一些顯著變化[28-29]。研究表明，在不同因素誘導的細胞凋亡中，在細胞形態(tài)學改變之前均出現(xiàn)線粒體膜電位的下降[30]。JC-1 熒光染料檢測細胞凋亡結果見圖5。對照組細胞呈紅色聚集，表現(xiàn)為正常的超極化膜電位。加入多柔比星后，模型組細胞表現(xiàn)出明顯的綠色JC-1 單體，線粒體膜電位降低。然而，藥物干預組線粒體膜電位逐漸升高，表現(xiàn)淡紅色和橙色熒光，表明人參根外泌體對多柔比星誘導的線粒體膜電位降低具有明顯的改善作用。

圖5 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞線粒體膜電位的影響Fig.5 Effect of ginseng root exosomes on doxorubicindamaged H9C2 cells membrane potential

2.3.8 人參根外泌體對多柔比星誘導的H9C2 細胞凋亡相關蛋白表達的影響 采用Western blotting 檢測細胞凋亡相關蛋白。細胞處理方法同“2.3.6”項，3000 r/min 離心5 min 收集細胞，棄去上清，加入適量的RIPA 裂解液，裂解4 h，12 000 r/min 離心30 min，吸取上清用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后，加入加樣緩沖液，在干式恒溫器上95 ℃煮樣5 min，得到蛋白樣品。蛋白樣品上樣10 μL經(jīng)SDS 聚丙烯凝膠分離后轉至PVDF 膜上，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，加入不同一抗β-actin（1∶5000）、Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、Cyt-C（1∶1000），4 ℃孵育過夜，收集一抗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔/鼠二抗，孵育1.5 h，在膜上滴加混勻后的ECL 化學發(fā)光液，利用多功能凝膠成像儀顯影。

在凋亡過程中，抗細胞凋亡因子Bcl-2 可阻止線粒體膜孔的開放，而促凋亡調(diào)節(jié)因子Bax 誘導其開放，線粒體膜孔開放可促進Cyt C 從線粒體釋放進入細胞質(zhì)中，從而誘發(fā)細胞凋亡。人參根外泌體對多柔比星誘導的線粒體凋亡途徑關鍵蛋白表達的影響見圖6 和表6。與對照組相比，多柔比星處理后Bcl-2 表達下降；Bax、胞質(zhì)Cyt C 的表達升高。加入人參根外泌體后，隨濃度的增加有效地抑制了多柔比星誘導H9C2 細胞的Bax 和胞質(zhì)Cyt C 表達，增加了Bcl-2 水平。

圖6 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of ginseng root exosomes on expression of apoptosis-related proteins in doxorubicin-injured H9C2 cells

表6 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響(,n=3)Table 6 Effect of ginseng root exosomes on expression of apoptosis-related proteins in doxorubicin-injured H9C2 cells(,n=3)

表6 人參根外泌體對多柔比星損傷的H9C2 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響(,n=3)Table 6 Effect of ginseng root exosomes on expression of apoptosis-related proteins in doxorubicin-injured H9C2 cells(,n=3)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001#P＜0.05 ##P＜0.01 vs control group; *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 vs model group

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) Cyt C/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/β-actin對照 -1.00±0.03 1.01±0.02 0.99±0.03模型 1 μmol·L-1 1.31±0.14# 2.14±0.08## 0.65±0.07##給藥 20 1.06±0.08 1.32±0.15* 1.03±0.09*40 0.85±0.11** 0.82±0.21** 1.15±0.13**80 0.35±0.06*** 0.53±0.09*** 1.31±0.14***

3 討論

多柔比星是一種非常有效和常用的化療藥物，用于治療惡性腫瘤[31]。然而在動物研究和臨床患者中發(fā)現(xiàn)多柔比星可誘發(fā)心臟毒性，因此找到能夠有效預防和治療多柔比星誘導心臟毒性的藥物是非常必要的。研究發(fā)現(xiàn)人參對心血管系統(tǒng)疾病具有很好的治療效果，但由于其溶解度有限、穩(wěn)定性差、生物利用度低以及其對細胞的非靶向性等問題，雖然其具有多種生物活性和治療特性但在臨床上的應用受到了限制。過去為了解決這些問題人們利用一些合成載體，如脂質(zhì)體和納米載體等用于提高人參的生物利用度。但合成的藥物載體具有一定的局限性，其研發(fā)成本高、包封率低、使用范圍窄等問題還有待解決。本課題試圖通過提取人參根外泌體為解決人參的生物利用度問題提供思路。

外泌體是細胞外分泌的納米囊泡，已有研究證明植物也能分泌外泌體，并在植物細胞間的通訊中發(fā)揮重要作用。這些植物來源的外泌體對人類沒有已知的潛在毒性，且容易被哺乳動物細胞吸收，介導物種間的交流[9]。本研究通過差速離心和密度梯度離心等方法成功地從人參根中提取出外泌體，通過透射電子顯微鏡和NTA 粒徑分析表明這些人參根外泌體具有類似于哺乳動物來源的外泌體的結構，并且含有蛋白質(zhì)、核酸、sRNA 等胞內(nèi)成分。利用H9C2 心肌細胞構建了多柔比星誘導的心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)人參根外泌體對其具有明顯的保護作用。其作用機制可能是通過保護多柔比星誘導的線粒體相關凋亡途徑，減輕多柔比星誘導的心臟毒性。通過Hoechst 熒光染色發(fā)現(xiàn)人參根外泌體給藥后多柔比星誘導的細胞形態(tài)的變化明顯減輕。JC-1 染色觀察到多柔比星誘導心肌損傷后線粒體膜電位下降，明顯可見綠色JC-1 單體，加入人參根外泌體后逆轉了這一現(xiàn)象。Western blotting 證實了人參根外泌體通過下調(diào)Bax 和上調(diào)Bcl-2 及減少Cyt C 的釋放來減輕多柔比星誘導的心臟毒性，保護心肌細胞損傷。

綜上所述，本實驗成功提取和鑒定到人參根外泌體，并首次證明了人參根外泌體可以在體外有效改善多柔比星引起的心肌損傷，恢復線粒體膜電位，上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax 凋亡相關蛋白的表達并減少Cyt C 的釋放。這些發(fā)現(xiàn)為多柔比星相關毒性的預防提供了一個新的視角，人參根外泌體作為一種參與哺乳動物心肌保護的調(diào)節(jié)劑為一類新的納米藥物在疾病治療方面提供重要參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突