童佳歡 劉肇恒 龍杞 郝慶勛 王域辰 焦揚(yáng)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種原因尚不明確的，以肺部彌漫纖維化伴蜂窩囊樣改變?yōu)樘卣鞯募膊??；颊咴\斷后中位生存期僅2～3年。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展的最重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1是MicroRNA-29b(miR-29b)的下游靶基因之一，miR-29b的過表達(dá)可以直接抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，從而達(dá)到抗纖維化的作用[1-2]。此外，miR-29b可顯著提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，從而抑制氧化應(yīng)激，減輕肺纖維化[3-4]。miR-29b這種“多途徑”“多靶點(diǎn)”作用特點(diǎn)，與中醫(yī)學(xué)的調(diào)整陰陽平衡，扶正祛邪的治療理念相吻合。

課題組總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為IPF以肺氣虧虛為本，臨床運(yùn)用肺痹湯治療取到了較好的療效[5]。課題組通過動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，肺痹湯可調(diào)節(jié)肺組織TGF-β1水平，對(duì)成纖維細(xì)胞的TGF-β1/smad信號(hào)通路具有調(diào)控作用[6-7]。肺痹湯以黃芪為君，黃芪既能補(bǔ)益肺氣，亦能通調(diào)血脈。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總皂苷可抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)，下調(diào)TGF-β1表達(dá)[8]，抑制肺纖維化發(fā)展，其中黃芪甲苷能顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，延緩 IPF進(jìn)程[9-10]，但其抗肺纖維化機(jī)制仍需深入研究。本實(shí)驗(yàn)基于miR-29b，研究黃芪甲苷對(duì)博來霉素肺纖維化模型小鼠的干預(yù)作用，探討其防治肺纖維化的可行性及作用機(jī)制，為臨床治療肺纖維化提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL雄性小鼠40只，體質(zhì)量(22±2)g，購于北京維通利華有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2006-009，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對(duì)濕度60%～80%，12小時(shí)/12小時(shí)明暗周期照射。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

黃芪甲苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，購自上海源葉生物科技有限公司；miR-29b模擬劑(批號(hào)：miR4CM001)、miR-29b模擬劑陰性對(duì)照藥(批號(hào)：RIBOCSUTOM001)購于廣州銳博生物科技有限公司；HE染色試劑盒、Masson三色染色液購于北京索萊寶科技有限公司；羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)試劑盒購于南京建成有限公司；MDA試劑盒(貨號(hào)：DG30429M)、ROS試劑盒(貨號(hào)：DG30626M)、SOD試劑盒(貨號(hào)：DG30430M)購于北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。

1.3 模型制備

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組8只，造模組32只。造模組小鼠稱重后，以異氟烷麻醉。將小鼠上牙迅速掛于懸線，使小鼠呈豎直位，用彎鑷將小鼠舌頭拽出，用100 μL移液槍向氣管內(nèi)快速滴入博來霉素溶液(2 u/kg)后，保持豎直狀態(tài)片刻，使藥液嗆入氣管中，旋轉(zhuǎn)1分鐘，使液體在小鼠肺內(nèi)均勻分布，隨后放回鼠籠，待自然蘇醒?？瞻捉M以相同方法滴入等量PBS。

1.4 分組及給藥

造模組小鼠成功造模后，隨機(jī)分為模型組、miR-29b組、miR-29b陽性對(duì)照藥組(簡稱NC組)、黃芪甲苷組，每組8只。造模1天后開始給藥，每天上午9點(diǎn)給藥。黃芪甲苷組以黃芪甲苷40.8 mg/(kg·d)灌胃，空白組、模型組、miR29組、NC組分別以生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃。參照文獻(xiàn)[11]，miR-29b組以miR-29b模擬劑10 mg/(kg·3d)氣道內(nèi)滴入，NC組以miR-29b模擬劑陰性對(duì)照藥10 mg/(kg·3d)氣道滴入，空白組、模型組、中藥各組以等量PBS氣道滴入。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 一般狀態(tài)觀察 觀察各組小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)變化、進(jìn)食、飲水及體質(zhì)量、呼吸情況變化，記錄小鼠死亡情況，進(jìn)行死亡原因分析。

1.5.2 肺組織病理學(xué)染色 將小鼠左肺置于中性福爾馬林液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，用HE染色觀察肺組織肺泡炎程度；Masson染色觀察肺組織肺纖維化程度。觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變，主要包括肺泡炎性細(xì)胞浸潤、肺組織水腫、肺間質(zhì)纖維化等。

1.5.3 肺組織羥脯氨酸檢測 取小鼠右側(cè)肺組織放入液氮速凍，保存在-80℃，采用羥脯胺酸試劑盒(堿水解法)測定肺組織中羥脯胺酸含量。

1.5.4 Elisa檢測血清中SOD、MDA、ROS水平 小鼠稱重后用異氟烷麻醉，摘眼球取血，分離上血清，采用Elisa試劑盒檢測血清中SOD、MDA、ROS水平。

1.5.5 qPCR法檢測肺組織中miR-29b、TGF-β1、smad3水平 根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)引物(見表1)，提取總RNA檢測純度，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，建立擴(kuò)增體系，讀取擴(kuò)增曲線、溶解曲線及目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5.6 Western-blot檢測肺組織中TGF-β1、smad3、P-smad3水平 將少量肺組織塊置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，充分研磨組織塊。加入400 μL的裂解液進(jìn)行勻漿，置于冰上。待樣本充分裂解完成后，在4°C下12000 rpm，離心5分鐘，取上清于-20℃保存。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測樣品蛋白含量，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，最后進(jìn)行凝膠圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較

空白組小鼠精神狀態(tài)好，活潑好動(dòng)，毛發(fā)光澤，呼吸平穩(wěn)。模型組及NC組小鼠精神較差，少動(dòng)，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)干枯，可見喘息氣促。miR-29b組及黃芪甲苷組小鼠癥狀較輕。

從第1天到第9天，除空白組外，各組小鼠體質(zhì)量均下降，第9天至第28天，各組小鼠體質(zhì)量逐漸增加。與空白組相比，模型組及黃芪甲苷組第5、9、13、17、21、25、28天體質(zhì)量減輕(P<0.05)，NC組第5、9、17、21、25、28天體質(zhì)量減輕(P<0.05)，miR-29b組第9、28天體質(zhì)量減輕(P<0.05)。與模型組和NC組相比，空白組、miR-29b組和黃芪甲苷組第9天時(shí)體質(zhì)量較高(P>0.05)。見表2。

表2 各組博來霉素肺纖維化模型小鼠體質(zhì)量變化比較

2.2 各組小鼠肺組織病理比較

空白組無炎性細(xì)胞浸潤，管腔無滲出，無膠原纖維沉積。模型組和NC組可見管腔大量炎性滲出，肺泡間隔增寬、充血，肺泡破壞嚴(yán)重，Masson染色可見大量膠原纖維沉積，纖維結(jié)節(jié)生成。miR-29b組和黃芪甲苷組可見部分炎性細(xì)胞浸潤，Masson染色可見少量膠原纖維沉積。見圖1～2。

注：A空白組，B模型組，C miR-29b組，D NC組，E黃芪甲苷組。

2.3 各組小鼠肺組織HYP含量比較

與空白組相比，模型組、miR-29b組、NC組、黃芪甲苷組羥脯氨酸含量均升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-29b組和黃芪甲苷組羥脯氨酸含量較低(P<0.05)。見表3。

表3 各組博來霉素肺纖維化模型小鼠肺組織HYP含量比較

2.4 各組小鼠血清SOD、MDA、ROS含量比較

與空白組相比，模型組、miR-29b組和黃芪甲苷組的SOD含量減少，MDA和ROS含量增加(P<0.05)，NC組的SOD顯著減少、MDA增加(P<0.05)。與模型組相比，miR-29b組的MDA、ROS含量減少(P<0.05)，NC組的SOD含量減少(P<0.05)，黃芪甲苷組的SOD含量明顯增多，MDA和ROS含量減少(P<0.05)。與NC組相比，miR-29b組和黃芪甲苷組SOD含量增加，ROS含量減少(P<0.05)。見表4。

表4 各組博來霉素肺纖維化模型小鼠血清SOD、MDA、ROS含量比較

2.5 各組小鼠肺組織TGF-β1、Smad3、miR-29b mRNA含量比較

與空白組相比，模型組和NC組的TGF-β1、Smad3基因表達(dá)量明顯升高，miR-29b基因表達(dá)量減少(P<0.05)；miR-29b組的Smad3基因表達(dá)量減少(P<0.05)。與模型組相比，miR-29b組和黃芪甲苷組的Smad3表達(dá)量減少、miR-29b表達(dá)量升高(P<0.05)。與NC組相比，miR-29b組的Smad3表達(dá)量減少、miR-29b表達(dá)量升高(P<0.05)，黃芪甲苷組Smad3表達(dá)量減少(P<0.05)；與miR-29b組相比，黃芪甲苷組的Smad3含量升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組博來霉素肺纖維化模型小鼠肺組織TGF-β1、Smad3、miR-29b mRNA含量比較

2.6 各組小鼠肺組織TGF-β1、Smad3、P-smad3蛋白含量比較

與空白組相比，模型組和NC組的TGF-β1、P-smad3蛋白含量升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-29b組和黃芪甲苷組的TGF-β1、P-smad3蛋白含量減少(P<0.05)。與NC組相比，miR-29b組的TGF-β1、P-smad3蛋白含量減少(P<0.05)，黃芪甲苷組P-smad3蛋白含量減少(P<0.05)。見表6、圖3。

表6 各組博來霉素肺纖維化模型小鼠肺組織TGF-β1、Smad3、P-smad3蛋白含量比較

圖3 各組博來霉素肺纖維化模型小鼠肺組織TGF-β1、Smad3、P-smad3蛋白含量表達(dá)

3 討論

肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，已有的研究認(rèn)為多種因素共同參與了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程。MicroRNA是一種非編碼的單鏈小分子RNA，通過與mRNA互補(bǔ)配對(duì)的方式，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，同一種microRNA可以調(diào)控多種mRNA的表達(dá)，而同種mRNA也可能受到不同的microRNA調(diào)控[12-13]。miR-29家族由miR-29a、miR-29b、miR-29c三種成員構(gòu)成，這三種成員之間僅存在2～3個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異，且具有相同的種子序列，因此它們作用的靶基因也往往相同，具有高度保守性[14]。miR-29可直接抑制膠原纖維生成，或通過多種細(xì)胞因子抑制肺纖維化[15]。氧化應(yīng)激是觸發(fā)肺纖維化形成的重要機(jī)制之一，肺損傷后釋放大量的ROS，使肺組織發(fā)生過氧化，刺激膠原蛋白的合成與分泌[16]。另一方面，ROS也可通過激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，增加結(jié)締組織生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)和肺纖維化[17-18]。研究表明，miR-29家族的過表達(dá)可以降低ROS和MDA含量，清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物，同時(shí)顯著提高SOD含量，提高機(jī)體抗氧化水平，從而減輕肺纖維化程度[3,19]。miR-29也可直接作用于靶基因TGF-β1的3’-UTR[20]，抑制TGF-β1表達(dá)，并通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的抑制作用[21-22]，減輕肺纖維化。這種多靶點(diǎn)、多途徑的調(diào)控方式與中醫(yī)整體觀具有相似性。

肺纖維化在古代文獻(xiàn)中無對(duì)應(yīng)病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可以歸為“肺痿”“肺痹”范疇?！夺t(yī)門法律》有言“肺痿者，肺氣痿而不振也”，《辨證錄》中說：“肺痹之成于氣虛，盡人而不知也，……然肺痹即氣痹也。”肺纖維化多因氣虛而起，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，臨床也常以補(bǔ)氣之品治療肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)氣藥在治療肺纖維化的過程中使用頻率較高，其中黃芪為最常用的補(bǔ)氣藥之一[23]。

近年來對(duì)黃芪研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分，可有效改善抗氧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]，也可降低肺組織羥脯氨酸含量，下調(diào)致纖維化因子TGF-β1表達(dá)水平，明顯改善博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化程度[25]。但黃芪甲苷調(diào)節(jié)TGF-β1的機(jī)制還需進(jìn)一步研究，對(duì)microRNA的干預(yù)也有待更多探索。

本實(shí)驗(yàn)研究以miR-29b為切入點(diǎn)，研究黃芪甲苷對(duì)肺纖維化小鼠的作用機(jī)制。結(jié)果表明，博來霉素肺纖維化模型組小鼠早期出現(xiàn)體質(zhì)量下降，miR-29b可以減輕小鼠體質(zhì)量下降的程度，黃芪甲苷也有緩解體質(zhì)量減輕的趨勢(shì)。病理結(jié)果顯示，模型小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量膠原纖維沉積，黃芪甲苷可以減少膠原纖維形成，減輕肺纖維化程度。羥脯氨酸是膠原纖維的主要成分，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示黃芪甲苷可以通過減少羥脯氨酸含量抑制肺纖維化。同時(shí)，黃芪甲苷可以有效增加SOD含量，抑制MDA的生成，提示黃芪甲苷具有抑制氧化反應(yīng)的作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織miR-29b的基因表達(dá)減少，而黃芪甲苷可以一定程度上提高miR-29b的表達(dá)，說明黃芪甲苷對(duì)miR-29具有一定的調(diào)控作用。黃芪甲苷也可減少Smad3基因的表達(dá)，抑制其磷酸過程，減少了P-Smad3蛋白水平，同時(shí)也可以減輕TGF-β1蛋白含量，從而起到調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以通過調(diào)控miR-29b減輕氧化應(yīng)激水平，抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，減少膠原沉積，從而改善肺纖維化病理損傷。但黃芪甲苷的臨床干預(yù)效果仍需進(jìn)一步研究。